比色法测定甘草中总皂苷的含量

比色法测定甘草中总皂苷的含量【摘要】目的建立甘草中甘草总皂苷含量的测定方法。

方法用香草醛 高氯酸试剂，在589 nm处有最大吸收，并对比色条件进行了优化。

结果该法精密度高，1 h内稳定，平均加样回收率为99.03%。

结论此法简便、准确、稳定性、重复性好，可用于甘草总皂苷的测定。

【关键词】甘草；总皂苷；香草醛 高氯酸Determination of Total Saponins in Glycyrrhiza by ColorimetryAbstract：ObjectiveTo establish the method of determination of total saponins in Glycyrrhiza. MethodsUse Vanillin HClO4 as the chromogenic reagent and detect the maximum absorption at the wavelength of 589 nm. Choose the best chromogenic preparation to determine the contents of the samples. Results The precision of the method is high. The color of the treated samples was stable within 1h. The average value of the recovery was 99.03%.ConclusionThe method is simple, accurate, highly sensitive and reproducible. It may be used for the quantitative determination of total saponins in Glycyrrhiza.Key words：Glycyrrhiza; Total saponins; Vanillin- HClO4甘草为豆科（Leguminosae）甘草属（Glycyrrhiza）植物，为我国重要的传统中草药。

甘草属植物在世界上共有30余种，我国有8种，分布在内蒙、西北、东北等地。

目前，被《中国药典》认定的甘草药材原植物有3种［1］，即乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的根及根茎。

其中以乌拉尔甘草分布最广，产量最多，质量最好。

研究发现甘草属植物中三萜类皂苷具有含量高、生理活性强的特点，不仅具有抗溃疡、消炎、解毒等生理活性，今年研究还发现具有抗病毒、抗癌活性。

皂苷定量分析方法的研究已有很多报道［2～7］，包括重量法、比色法、薄层扫描法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）等。

重量法具有测定值稳定、重现性好等特点，但分析流程时间长，操作繁琐，试剂消耗量大，得到的皂苷中一般混有一定量的杂质，使结果偏高，误差较大。

比色法一般采用香草醛－硫酸比色法［2］。

张中伟发现香草醛－硫酸法稳定性差，而香草醛 高氯酸作为三萜皂苷常用的显色剂，较香草醛 硫酸的精密度高，且受糖类干扰较小［6］。

薄层扫描法和高效液相法对测定样品、设备要求较高，且只适合一些特定皂苷的测定。

综合考虑，以香草醛 高氯酸作为显色剂，测定甘草中总皂苷的含量，建立一种简便、准确的方法。

1 器材1.1 仪器721型分光光度计，上海分析仪器厂；KQ 50DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；AB204 S型分析天平，METTLER公司；紫外扫描分光光度计，岛津UV 240。

1.2 试剂高氯酸，甲醇，香草醛，冰醋酸（以上试剂均为分析纯），甘草酸单铵盐标准品（甘草酸单铵盐10 mg溶解于甲醇中定容至10 ml，浓度为1 mg·ml-1，甘草（购于黑龙江省大庆市大同区）。

2 方法2.1 最大波长的确定准确吸取0.5 ml标准品溶液，置于10 ml具塞试管中，70℃水浴挥干溶剂，加入0.2 ml的5%香草醛－冰醋酸溶液，再加入0.8 ml的高氯酸，摇匀，于55℃水浴中加热20 min，立即取出用流水冷却至室温，加入冰醋酸5 ml稀释，摇匀，以不加标准品的样品管为空白，于400～700 nm波长处进行扫描。

2.2 比色条件的优化2.2.1 最佳显色时间的确定取5份0.2 ml对照品溶液，分别置具塞试管中，70℃水浴挥干溶剂，各加入0.2 ml的5%香草醛－冰醋酸溶液，再加入0.8 ml的高氯酸，摇匀，于60℃水浴中加热不同时间（5，10，15，20，25 min），立即取出用冷水冷却至室温，加入冰醋酸5ml，摇匀，于最大吸收波长处测定其吸收值。

2.2.2 最佳显色温度的确定分别取5份0.2 ml对照品溶液，依上法操作，在不同温度（50，55，60，65，70℃）水浴20 min，同上进行测定。

2.3 显色稳定性的考察精确吸取标准样溶液0.2 ml，按2.1中的香草醛－高氯酸法显色，在1 h内，每隔5 min测定吸收值的变化情况。

2.4 标准曲线绘制精确吸取标准液0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 ml分别置于10 ml具塞试管中，按2.1中的香草醛－高氯酸法显色后测定吸光值，每个浓度平行测定3次，以皂苷的质量为横坐标，吸光度为纵坐标作图得到回归方程。

2.5 样品待测液的制备准确称取脱脂后的甘草粉0.2 g（40目）于10 ml具塞试管中，准确加入甲醇4 ml(含1%氨水)，加塞后放入超声波清洗器中超声1 h，然后取出试管置于离心机中以3 000 r·min-1离心15 min，上清液作为待测液。

2.6 精密度的测定准确吸取待测液60 μl共6份，按2.1中的香草醛－高氯酸法显色后测定吸收值。

2.7 加标回收率实验准确量取6份已知浓度的供试样品25μl，再分别加入标准溶液30 μl，按2.1中的香草醛－高氯酸法显色后测定吸收值，计算加标回收率。

2.8 样品的测定吸取上述2.5项下提取纯化的3种样品溶液各60 μl，按2.1中的香草醛－高氯酸法显色后测定吸收值，根据工作曲线计算皂苷含量。

3 结果与讨论3.1 最大波长的确定香草醛－高氯酸是常用的一类显色剂，显色灵敏度高，试剂空白溶液色浅，常用作三萜皂苷的显色剂。

其反应机理可能是皂苷在强氧化性酸的作用下脱氢，氧化后再与香草醛加成。

显色后，香草醛－高氯酸能与皂苷反应形成特征的紫红色。

扫描结果表明，甘草酸单铵盐标准品溶液在589 nm处有最大吸收，故选取589 nm为测定波长。

3.2 比色条件的确定3.2.1 最佳显色时间的确定结果见图1。

3.2.2 最佳显色温度的确定结果见图2。

3.3 显色的稳定性显色反应的1 h内试样的吸光值下降较小（CV＝0.68%），在1 h 内测定的数据是基本稳定的，可以满足测定的要求。

3.4 标准曲线回归曲线数据见表1。

表1 测定的回归曲线数据（略）以3次测定的吸光值的平均值A为纵坐标，以甘草酸单铵盐量/mg为横坐标，绘制成标准曲线，如图3所示，该标准曲线的回归方程0为：y= 2.334 3x - 0.001 1，r = 0.999 63.5 样品待测液的制备测定样品皂苷含量一般采用索氏抽提的方法 ,这种制备样品方法既繁琐、费时,又难以抽提完全，不能满足样品批量测定制样的要求。

吉宏武［8］发现20 倍的甲醇超声波提取1 h 可将材料中的皂苷提取完全。

由于甘草酸在甘草皂苷中所占比例最大,且在甘草中以钠盐或钾盐的形式存在, 加入稀氨水(0.5 %～5 %) ,则可与甘草酸形成铵盐而增加其水溶性,使提取效率提高。

稀醇(甲醇或乙醇50 %～70 %) 溶液对皂苷的溶解性较好,对植物细胞组织的穿透性也较强,多糖、蛋白质等在醇溶液中易产生沉淀,因此提取液的杂质较少［9］，所以在选用样品的提取溶剂时采用甲醇(含1%氨水)。

在对样品测定之前要脱脂,否则对香草酸-高氯酸比色体系干扰较大。

3.6 精密度的测定结果见表2。

表2 精密度实验结果（略）3.7 加标回收率实验结果如表3。

表3 加标回收率实验结果（略）平均回收率X＝99.03%，测定的标准差S=5.08，CV=5.13%表明皂苷在提取、纯化过程中没有损失，可以保证最终测定结果的可靠性。

3.8 样品的测定结果见表4。

表4 样品总皂苷的测定含量（略）本方法测定的皂苷含量为5.16%,与谢彦报道的含量范围(5%～11%)一致［9］。

采用香草醛 高氯酸比色法对甘草皂苷进行定量测定时，显色反应过程中吸光度随加热时间和温度的改变而变化，测定时要严格按照操作步骤。

另外，所用的香草醛 冰乙酸溶液要在用时现配，否则空白值的颜色会加深，影响测定的结果。

【参考文献】［1］谢彦，徐淑永，曾和平. 甘草属植物中三萜类化合物研究概述［J］.广州化学，2004，32(1)：1.［2］陆藴如，邵爱新．用香草醛 硫酸比色法测定次片甘草及蜜灸甘草中甘草酸的含量［J］.药物分析杂志，1981，1（2）：84.［3］刘刚．薄层分离 紫外分光光度法测定甘草浸膏中甘草酸的含量［J］.宁夏大学学报，1990，11（4）：38.［4］张继，杨永利，王莱．双波长薄层扫描法测定乌拉尔甘草中甘草酸含量［J］.西北师范大学学报，1998，34（1）：66．［5］梁月琴，刘琴，吴德政．用高效液相色谱法测定甘草及其制剂中甘草酸含量［J］.军事医学科学院院刊，1997，21（3）：55．［6］张中伟，谢明勇，王远兴，等．比色法测定苦瓜总皂苷［J］.南昌大学学报（理科版），2005，29（5）：447.［7］鱼红闪，吴少杰，金凤燮，等．树脂法提取甘草中甘草苷的研究［J］.食品与发酵工业，1999，25（1）：40.［8］吉宏武，丁霄霖.百合总皂苷定量测定方法的研究［J］.林产化学与工业.2003.23(4)：54.［9］鲁守平, 孙群, 王建华,等.甘草中有效成分甘草酸的提取和测定方法研究概况［J］.2006.31(5)：357.。