不同杂交后代苹果与富士苹果的多酚氧化酶特性比较
不同苹果中果皮、果肉、果核多酚物质的提纯与比较
不同苹果中果皮、果肉、果核多酚物质的提纯与比较佚名【摘要】苹果多酚具有抗氧化衰老、降低血糖血脂、减重减肥等功效,苹果多酚应用的领域非常广阔,应用前景很大,本文对不同品种的苹果的果皮、果肉、果核进行多酚提取与比较,嘎啦果、红蛇果和红富士三种苹果中果皮所含的多酚物质高于果核和果肉,红蛇果的果皮中多酚物质含量最高,可以将红蛇果果皮中的多酚物质提取出来,有效降低成本,更好利用于其他领域.【期刊名称】《江西化工》【年(卷),期】2018(000)006【总页数】2页(P136-137)【关键词】苹果;多酚物质;比较【正文语种】中文苹果中所有多元酚类物质统称为苹果多酚。
苹果多酚具有抗氧化衰老、降低血糖血脂、减重减肥等功效。
[1-4] 苹果多酚应用的领域非常广阔，可以把提取出来的多酚制成化妆品，周文杰等人将提取出来的苹果多酚研制成防晒霜[5]，减轻紫外线对肌肤的伤害，更好的阻挡UVA和UVB，也可以做成药物，预防心血管疾病等，王艺璇等人研究不同的苹果多酚提取物对血管紧张素转化酶活性的抑制作用[6]，为苹果多酚降血压功能性提供佐证。
因此，笔者对不同品种的苹果的果皮、果肉、果核进行多酚提取与比较。
1 材料与方法1.1 材料与试剂材料：三种苹果，嘎啦果购买于新西兰，红蛇果购买于甘肃省，红富士购买于陕西。
试剂：没食子酸，福林酚，果胶酶，均为生化试剂，均由上海金穗生物科技有限公司生产；抗坏血酸、无水乙醇、碳酸钠，均为分析纯，均由西陇科学股份有限公司生产。
1.2 仪器与设备FA2004N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；JJ500电子天平，上海精密科学仪器有限公司；752pro紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司制造；SHB-3循环水式多用真空泵，上海丞明仪器设备有限公司；KQ-100DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
1.3 方法1.3.1 苹果多酚的提取各称取5.0克的果皮、果肉、果核放入50ml烧杯中并加入维生素C 0.8ml然后封上蜡膜，防止氧化。
苹果果皮、果肉多酚含量测定及抗氧化能力研究
苹果抗氧化成分提取参照 Arslan 的方法[7]，并略 作改动。
王岩，等： 苹果果皮、果肉多酚含量测定及抗氧化能力研究
2
基础研究
1 材料与方法 1.1 材料
富士苹果（产自新疆）、国光苹果（产自山东）、花牛 苹果（产自甘肃）、金冠苹果（产自辽宁）均购于齐齐哈 尔市大润发超市。 选择大小，色泽均匀，无机械伤和病虫 害的果实。 在提取之前，使用小刀将苹果果皮和果肉分离， 于真空冷冻干燥箱内干燥至无水并粉碎，在 -20℃贮存。 1.2 试剂
中国是世界上最大的苹果生产国和消费国，苹果 种植面积和产量均占世界总量的 40 %以上，在世界苹 果产业中占有重要地位[1-2]。 我国苹果的种类繁多，其 中富士、国光、金冠等苹果品种在市场上最为常见[3]。
基金项目：齐齐哈尔大学青年教师科研启动支持计划项目（2014kM27）；黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目（12521605）；教育部 留学归国科研启动基金资助 作者简介：王岩（1982—），男（汉），讲师，博士，研究方向：天然产物 化学及功能食品。
不同品种苹果果皮、果肉中的总黄酮含量如图 2。
30
总黄酮含量/（mg RE/g，FW）
1.3.3 总黄酮含量测定 采用三氯化铝分光光度法[8]。
1.3.4 DPPH 自由基清除性能测定 采用 Zhang et al.的测定方法[10]。
1.3.5 Trolox 当量抗氧化能力（TEAC） 采用 Al-Weshahy et al.的测定方法[11]。
不同干燥条件对山富士苹果总多酚及多酚氧化酶活性的影响
自２ ０世 纪 ８ ０年代 以来 ，我 国苹 果 产 业 发 展 迅 猛 ，苹果 种 类 繁 多 ，现 已跃 为 我 国 四大 水 果 之 首 ］ 。 苹果 中含有丰富的生物活性 物质——苹果多酚 ，研 究表 明 ，它 拥有 一 定 的生 物学 特 性 ｆ ２ １ 氧 化 性 、清 ：抗
多 酚 方 面 的报 道 。本 试 验 采 用 日本 山 富 士 苹果 为试 样 进 行 研 究 ，为 以后 我 国苹 果 品 种选 育研 究 方 面提 供一定 的参考 。利用传 统的热风干燥 ，在不 同温度 下 进 行 干 燥 ，对 山富 士苹 果 的 总 多 酚含 量 以及 多酚
不 同干燥条件对 山富士苹果 总多酚 及 多酚氧化 酶活性 的影 响
李 潇 ，刘 宇 ， 谢春 阳 ，小 出章二
（． １ 吉林农业大学 ，吉林 长春 １０ １ ； ２ １本 岩手 大学 ，日本 岩手 ０ ０ ８ ５ ） ３ １ ８ ．３ ２ — ５０ 摘要 ：利 用热风 干燥 ，在 ４ ，５ ，６ ，７ Ｏ Ｏ ０ ０℃的干燥条 件下 ，将 １本 山富 士苹果 片干燥 至干基 含水率分 别为 ５ ％， ３ ０
２ １ ｔ ｉｅ ｉ ．ｗａｅＵｎｖｒ ｔ ｓ ｙ，Ｍｏ ｏ ａ １ ｔ ２ — ５ ０ Ｊｐ ｎ ｉ ｆ ｋ ， ｗａｅ０ ０ ８ ５ ， ａ ａ ）
Ａ ｓａｔ ｂｔ ｃ：Ｗｉ ｈ ｅｔ －ｉ ｄｙ ｇ ｈｎｔｅｄ ｏ ｄｔｎ ０ ０ ６ ，７ Ｃ ｒｓｅｔ ｅ ，ｄ ｉｇＪｐｎｗｌ Ｆ ｊ ｒ ｔ ｔｅｈ ａ ｄ ａ ｒｉ ，ｗ ｅ ｒ ｃｎｉｏ ｓｉ ４ ，５ ， ０ ０ ｏ ｅｐｃｉ ｌ ｈ ｅ ｒ ｎ ｈ ｙ ｉ ｓ ｖ ｙ ｒ ｎ ａａ ｉ ｕｉ ｙ ｄ
除体 内 自由基 、抑菌 、抗衰老 、抗肿瘤 、抗过敏等 氧化酶 的活性进行分析 ，探讨其 干燥条件对 引起酶 功能［ ３ 】 苹 果进 行 再加 工 的过程 中 ，易 发 生 酶促 褐 促 褐 变 的两 大 物 质 因 素产 生 的影 响 ，分 析 最 佳 干 燥 。对 变而影 响苹果多酚的含量 。苹果 多酚是苹果 中的次 工 艺条 件 ，为 山富士 苹果 深加 工提 供 了可靠 的依 据 。
不同品种苹果多酚组分分析及其相关生物活性研究开题报告
不同品种苹果多酚组分分析及其相关生物活性研究开题报告一、研究背景苹果是世界上广泛食用的水果之一，其营养价值高、风味好、具有丰富的生物活性成分。
其中，多酚类化合物是苹果中重要的生物活性成分。
随着人们对健康食品和天然抗氧化剂需求的提高，苹果的多酚类化合物在保健品、药物、食品加工和化妆品等领域得到了广泛应用。
因此，研究不同品种苹果中多酚组分分析及其相关生物活性成为了目前苹果研究的热点和难点。
二、研究目的本研究旨在分析不同品种苹果中多酚类化合物的组成及其抗氧化和抗炎作用，并探究其与品种、产地和保存方式等因素的相关性，为苹果生物活性成分的开发利用提供理论支持。
三、研究内容1.不同品种苹果中多酚组分分析的研究：采用高效液相色谱（HPLC）和质谱联用技术（LC-MS）对不同品种苹果中多酚类化合物进行分析，并探究不同品种、果皮和果肉中多酚成分的差异。
2.不同品种苹果抗氧化和抗炎研究：利用ABTS和DPPH等试剂评价不同品种苹果中多酚类化合物的抗氧化活性，并采用细胞培养技术评价其抗炎作用。
3.相关因素探究：探究不同品种、产地和保存方式等因素对苹果中多酚类化合物组成和生物活性的影响，为合理选择苹果品种和保存方式提供指导。
四、研究方法1.样品采集：选择不同品种苹果的果皮和果肉作为实验样品。
2.多酚组分分析：采用HPLC和LC-MS技术对样品中的多酚类化合物进行分离鉴定。
3.抗氧化和抗炎实验：采用ABTS和DPPH等试剂评价苹果中多酚类化合物的抗氧化活性，并利用细胞培养技术评价其抗炎作用。
4.相关因素分析：通过对比不同品种、产地和保存方式等因素对苹果中多酚类化合物组成和生物活性的影响，探究其之间的相关性。
五、预期结果1.分析不同品种苹果中多酚成分的差异，揭示苹果中多酚类化合物的分布规律。
2.评估不同品种苹果中多酚类化合物的抗氧化和抗炎活性。
3.探究品种、产地和保存方式等因素对苹果中多酚类化合物组成和生物活性的影响，为合理选择苹果品种和保存方式提供指导。
苹果中多酚氧化酶特性的测定不完全2
有关于苹果中多酚氧化酶的实验原理：多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类。
在苹果中，酶促褐变主要是因多酚氧化酶氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合或邻醌与蛋白质，氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗，严重影响制品的营养、风味及外观品质。
PPO的来源不同，它们的理化性质也存在较大的差异，因而对同一物理或化学处理的敏感性不同。
在生产实践中，根据原料的不同种类，来源和加工特点，合理选择PPO活性的抑制方法，对提高产品质量有重要作用。
材料：无伤痕，无病害，品质良好的成熟苹果，品种为酸王，于4℃贮藏备用。
试剂：丙酮，磷酸盐缓冲溶液，邻苯二酚溶液，PVPP，Triton-100.Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。
30% Triton X-100的配制：试剂：Triton X-100 :28.2ml, 0.05mol/L PBS(pH6.8) 72.8ml配制方法：取Triton X-100及PBS混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。
用前取该储备液稀释至所需浓度。
所需实验测出的数据及相关内容：ph对PPO的影响及其稳定性，最适反应温度及其它的热稳定性，对底物专一性的高低，不同抑制剂对反应的抑制程度，PPO的酶促动力学参数。
实验步骤设计:(1)苹果洗净后在4℃保温，再去皮后取果肉200g，立即加入冷冻丙酮500ml,用高速组织捣碎机匀浆2min；用布氏漏斗抽滤，滤饼用200ml冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末在蒸发皿中，在室温下干燥，即得PPO丙酮粉。
(2)称取丙酮粉0.5g,溶于250ml 0.05mol/L.ph6.8的预冷磷酸盐缓冲液溶液，用磁力搅拌器搅拌20min,5000r/min离心10min,上清液过滤，即得苹果PPO粗酶液。
苹果汁中多酚氧化褐变及其产物理化特性研究
苹果汁中多酚氧化褐变及其产物理化特性研究苹果汁中多酚氧化褐变及其产物理化特性研究引言：苹果是一种广泛食用的水果，其汁液含有大量的多酚类化合物，如儿茶素、花青素等。
然而，当苹果被加工为汁液时，其中的多酚类化合物会发生氧化反应，导致汁液颜色的变化。
本研究旨在探究苹果汁中多酚类化合物的氧化褐变机制，并对其产物的理化特性进行研究。
方法：1.采集新鲜苹果，制备苹果汁液。
2.将苹果汁液分为几个不同的组：对照组、低温组、酶处理组和添加抗氧化剂组。
3.通过可见光光谱法测定不同组的苹果汁液的吸光度，以评估其颜色变化。
4.利用高效液相色谱法（HPLC）对苹果汁液中多酚类化合物的含量进行测定。
5.利用紫外-可见光谱法（UV-vis）研究苹果汁液中多酚氧化褐变反应的动力学过程。
6.通过红外光谱法（FT-IR）对苹果汁液中多酚氧化褐变反应产物的官能团进行分析。
结果与讨论：实验结果显示，苹果汁液在暴露于空气中后，逐渐出现深褐色，同时其吸光度也显著增加。
与对照组相比，低温组的苹果汁液颜色变化较小，表明低温可以有效减缓多酚氧化的速率。
酶处理组的苹果汁液颜色变化最为明显，表明酶的加入促进了多酚氧化反应。
而添加抗氧化剂的组则几乎没有颜色变化。
通过HPLC分析，我们发现苹果汁液中的花青素在氧化过程中逐渐降解，而单宁酸的含量则逐渐增加。
这与多酚类化合物在氧化过程中的反应规律一致。
UV-vis结果显示，苹果汁液在氧化过程中出现了两个明显的吸收峰，分别位于300-400 nm和600-700 nm，表明多酚类化合物被氧化为具有较长共轭链的产物。
而抗氧化剂的添加则有效减小了这两个吸收峰的强度。
FT-IR结果显示，苹果汁液在氧化过程中出现了C=O的伸缩振动峰的强度增加，表明其产物中可能含有酮类化合物。
此外，还观察到了羟基的伸缩振动峰降低，表明多酚类化合物中的羟基也发生了部分氧化。
结论：本研究揭示了苹果汁液中多酚氧化褐变的机制，实验证明了低温和抗氧化剂的添加可以有效减缓多酚氧化的速率。
不同中间砧对“红富士”苹果树体生长及酶活性和总酚含量的影响
摘 要 ： 以不 同 Ｓ Ｈ 。 实生后代 为 中间砧 的“ 红 富士” 苹果为试材 ， 研 究 了不 同中间砧 对“ 红富
士” 苹 果 树 体 生 长 以及 过 氧 化 物 酶 （ Ｐ （ ） Ｄ ） 、 超 氧化物歧 化酶 （ Ｓ Ｏ Ｄ ） 活性 和 总 酚 含 量 的 影 响 。 结 果
１ ． ４ 数据分析 所得数据利用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ软件进行统计分析 。
影响 ， 旨在为筛选适宜矮化砧木提供参考依据 。
１ 材 料 与方法
１ ． １ 试 验材 料 供 试 材 料为 ４ ａ生苹 果树 ， 中间 砧 为 Ｓ Ｈ｝ 。 实生后代 ，
２ 结 果与分 析
２ ． １ 不 同中间砧对“ 红富士” 苹果树体生长 的影响
砧木号分别为 ２ ． ６ 、 ２ ８ 、 １ ７ ８ 、 ２ １ ２ 、 ２ ４ ２ ， 基砧均为八棱海棠 ， 嫁
接 品种 为“ 红 富士 ” 。以“ 红 富 士” ／ Ｓ 。 ／ Ａ 棱 海 棠为 对 照 。
１ ． ２ 试 验 方 法
分别 于 ２ ０ １ ２ 年春梢缓慢生长期 （ ５月 ２ ４日） 与秋季
关键词 ： Ｓ Ｈ４ 。 实生后代； 中间砧 ； “ 红富士” ； 过氧化物酶（ Ｐ （ ） 】 ） ） ； 超氧化物歧化酶（ ９ ０ Ｄ ） ； 总酚含量 中图分类号 ： Ｓ ６ ６ １ ． １ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ １ －０ ０ ０ ９ （ ２ ０ １ ３ ） ２ １ 一Ｏ ０ Ｏ ９ 一Ｏ ４ 应用 矮化 砧 木进行 矮 密栽培 是苹 果生 产 的发展趋 势， 选择适 宜 的矮 化砧 木是 果 树矮 化 的关 键［ １ 伽。 由山 西 省农 业 科 学 院 果 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 研 究 所 选 育 的 Ｓ Ｈ 系苹 果 砧 木 Ｓ Ｈ４ 。 生长势与 Ｍ２ 相近 ， 具有矮化 、 早果 、 丰产 、 果实 品质
苹果出库后生理指标比较测定
苹果出库后生理指标比较测定—果蔬采后生理设计性实验摘要：此设计性实验测定了经乙烯利处理和低温贮藏的红富士苹果的呼吸强度、有机酸含量、细胞膜渗透率，以及多酚氧化酶（PPO）、过氧化氢酶(POD)活性的测定和丙二醛(MDA)含量的测定。
关键词：苹果出库生理指标比较测定前言：红富士是从普通富士的芽（枝）变中选育出的着色系富的统称。
富士苹果是日本农林水产省果树试验场盛冈分场于1939年以国光为母本，元帅为父本进行杂交，历经20余年,选育出的苹果优良品种，具有晚熟、质优、味美、耐贮等优点,于1962年正式命名，是世界上最著名的晚熟苹果品种。
富士果实虽有风味好、晚熟、耐贮等优点，但也存在着果实着色差的缺点。
为此，日本各地又从富士当中选出了许多着色好的富士芽变，统称为红富士。
红富士苹果在渭北平原，陕北黄土高原一些地区以及秦岭以北麓地区均能正常生长，并能早实丰产稳产，色艳质优。
红富士的经济栽培北界在白于山、横山以南，西起吴旗的油城子，经过志丹县的桑园沟，冬至清涧。
在北纬37°以北，榆林县以南地区，选用适宜的地形和小气候条件，也可少量栽培，但需注意防冻防霜。
乙烯利也叫一催磷，乙烯磷。
具有抑制新梢生长，促进成花结果，果实着色成熟等作用。
苹果成熟前3 至 4周，用纯量的320至800毫克/千克浓度溶液喷布全树，可使果实提早10至15天成熟。
苹果花前10天，全树喷100至200毫克/千克浓度溶液，可提高果实品质。
此设计性实验测定了经乙烯利处理和低温贮藏的苹果的呼吸强度、有机酸含量、细胞膜渗透率，以及多酚氧化酶（PPO）、过氧化氢酶(POD)活性的测定和丙二醛(MDA)含量的测定。
了解果蔬采后生理变化和生产上减少果蔬采后损失的操作技术。
1.试验材料与方法1.1 试验材料与处理1.1.1 试验材料红富士苹果：2010年5月26日购于新北园春水果批发市场，产地陕西。
1.1.2材料处理：1、冰箱（4℃）贮藏；2、室温（20℃）贮藏（乙烯利0.2%处理3天）1.2 试剂与仪器1.2.1 试剂： 0.4mol/L的氢氧化钠溶液、0.1 mol/L的氢氧化钠溶液、Bacl2溶液、酚酞、0.1mol•L-1的草酸溶液、蒸馏水、0.2 mol·L-1 pH=6.2 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、0.1 mol·L-1邻苯二酚、5.0%三氯乙酸、0.5%硫代巴比妥酸、H2O20.1mol•L-1愈创木酚1.2.2 仪器：电子天平、培养皿、干燥器、50ml或100ml碱式滴定管、酸式滴定管、试管、研钵、烧杯、锥形瓶、漏斗、电炉、移液管（1ml、5ml，10ml，20ml）、离心机、脱脂棉、电导仪、恒温水浴锅、分光光度计。
苹果多酚的研究概况
酸 。绿 原 酸 是 肉 桂 酸 的 衍 生 物 （ 羟 基 肉 桂 酸），咖啡酸在苹果中以咖啡奎宁酚酸的形 式存在， 酯类水解后产生咖啡酸。苹果中的 黄 酮 类 物 质 主 要 有 儿 茶 素 、表 儿 茶 素 、原 花 青素（Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１）、槲皮酮和槲皮苷等。苹果皮 中的多酚（除了绿原酸和表儿茶素外）含量 要高于果肉中的多酚含量，研究发现整个 苹果果实的４ ６ ％的酚类物质在果皮中。果皮 中 含 有 较 高 含 量 的 儿 茶 素 、槲 皮 素 阿 拉 伯 糖 苷 、槲 皮 素 葡 萄 糖 昔 和 半 乳 糖 糖 苷 混 合 物，苹果果肉中含有较高含量的绿原酸和 儿茶素， 但没有槲皮苷和槲皮素。果皮果肉 中均含有绿原酸和儿茶素，而槲皮素糖普 则只存在于果皮中。
提 高 了 林 地 生 产 力 。林 地 、林 分 、用 材
的顺序是混较类、杉木、硬阔类、马尾松、软阔 林、防护林、特种林、人工林、国有林等的单
类，分别为３９６．６８％、２９．２３％、１４．５５％、１３．７８％ 位 面 积 蓄 积 量 均 呈 正 增 长 ， 民 营 和 外 资 的
和－１４．５５％；各优势树种的蓄积均有不同程 单位面积蓄积也比同期的集体林和上一期
龋齿的形成要经历以下三个过程：（１） 糖质的摄食；（２）链球菌变种从而形成齿垢； （３）齿垢中菌生成酸，使牙齿的釉质溶解。其 中，使蔗糖转化为不溶性葡聚糖类的酶为 葡 萄 糖 转 移 酶 （ 简 称 Ｇ ｔ ａ ｓ ｅ ） 。如 果 抑 制 了 龋 齿形成的第（２）阶段，即抑制了Ｇｔａｓｅ的活 性，可起到有效预防龋齿的效果。 ４ ． ５ 抑制血压上升作用
加工工艺也影响多酚的组成，主要决 定于苹果浆的存放时间和杀菌以及酶等处 理 方 法 。压 榨 苹 果 汁 中 的 总 酚 含 量 明 显 低 于浸提的苹果汁中的含量。
不同品种苹果非浓缩还原汁的多酚组成及与抗氧化能力的关系
中国食品学报Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology第20卷第5期2 0 2 0年5月Vol. 20 No. 5May 2 0 2 0不同品种苹果非浓缩还原汁的多酚组成及与抗氧化能力的关系王彦淇!郭玉蓉2王永涛!赵 靓!吴晓蒙廖小军!（1中国农业大学食品科学与营养工程学院 国家果蔬加工工程技术研究中心 农业部果蔬加工重点实验室 食品非热加工北京市重点实验室 北京1000832陕西师范大学食品工程与营养科学学院西安710119）摘要 目的：通过分析15种非浓缩还原（NFC ）苹果汁的多酚组成、抗氧化能力及二者相关性，研究多酚组成对抗氧化能力的贡献，为果汁生产企业在原料果选择方面提供借鉴&方法：制备15个品种的NFC 苹果汁，利用超 高效液相色谱（UPLC "和体外抗氧化试验分析多酚组成和抗氧化能力（DPP H 和ABTS 自由基清除能力）%通过单因素方差和相关性分析处理试验结果&结果：NFC 苹果汁中，单体酚以绿原酸含量最高，表儿茶素没食子酸酯 含量最低；大类多酚有原花青素、酚酸和黄酮类3种，其中酚酸含量最高（102〜331 !g/：L ）,黄酮含量最低（5〜30!g/mL ）0不同（种苹果中，“乔纳金”苹果的DPPH 自由基清除能力最高为89.1%,"秋香”苹果的ABTS 自由基清除能力最强为92.6%&结论：原花青素大类物质是NFC 苹果汁体外抗氧化能力的主要贡献者，原花青素B2、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯3种单体酚有较强的DPPH 自由基清除能力，而ABTS 自由基清除能力更多地依 赖于总酚含量&关键词 苹果；非浓缩还原汁；多酚组分；抗氧化性；相关性分析文章编号 1009-7848（2020）05-0074-10 doi ： 10.16429/j.1009-7848.2020.05.010苹果是全球消费量最高的水果之一 [1],而我 国拥有世界上最大的苹果及苹果汁生产量和出口 量。
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不同杂交后代苹果与富士苹果的多酚氧化酶特性比较 Characteristics of polyphenol oxidase(ppo) of fuji and different apple hydrids 侯召华 王成荣 李文香 董剑寒 韩希风 朱永宝 HOU Zhao-hua WANG Chengrong LI Wen-xiang DONG Jian-han HAN Xi-feng ZHU Yong-bao (莱阳农学院食品科学与工程学院，山东 青岛266109)(Department of Food Science，Laiyang Agricultural College，Qingdao，Shangdong 266109,China)摘要:不同杂交后代苹果54号、45号及富士苹果多酚氧化酶特性比较结果表明：不同苹果的最适pH值不同，45号和富士为 5.5，54号为 6.0；45号、54号和富士最适温度分别为30,35,40 ℃；富士热稳定性最强，其次是45号，最次为54号；不同苹果PPO的最适底物依次为绿原酸、咖啡酸、儿茶酚；Na2S2O3对PPO活性抑制效果最佳，L-半胱氨酸与抗坏血酸的抑制效果较好，EDTA -2Na的抑制效果较差；不同苹果PPO同工酶酶带不同，染色深浅不同。
富士有四条酶带，45号和54号只有一条共有酶带，富士酶带数最多，染色最深。
关键词:杂交苹果；多酚氧化酶；特性Abstract: The PPO characteristics of 2 new cultivars (45 and 54 )of different apple hydrids and Fuji apple were studied. The results indicated that the optimal pH of 45, 45 and Fuji is 5.5、6.0、5.5,respectively; the optimal temperature of 45、54 and Fuji is 30,35,40 ℃,respectively; the most suitable substrate is Chlorogenic acid;Na2S2O3、Vc、L-Cysteine and EDTA -2Na could inhibit PPO activity, Na2S2O3was the mosteffective inhibitors for PPO of the apple; Isoenzyme paterns of PPO is different, Fuji has 4 paterns, 45 and 54 only have 1patern.Keywords:Polyphenol oxidase(PPO)；Apple hydrids；Characteristics ——————————————项目基金：山东省教育厅资助项目(项目编号：J04C12)作者简介：侯召华（1982-），男，莱阳农学院食品科学与工程学院在读研究生。
E-mail：chengwang@通讯作者：王成荣收稿日期：2006-12-08苹果属于蔷薇科苹果属，是世界四大水果之一。
2004年我国苹果总产量2 000多万t，接近世界总产量的50%[5]。
在苹果加工中易发生酶促褐变而影响品质，多酚氧化酶（polyphenoloxidase,PPO,EC1.14.18.1）作用于酚类物质是导致褐变的重要原因[1]。
莱阳农学院园艺学院经过十几年的潜心研究选育出一系列杂交后代苹果，经制汁发现，其中一些高酸类型苹果褐变非常轻，但对其褐变轻的原因尚不明了。
文章以杂交后代45号、54号苹果及富士苹果为原料，探讨与果汁生产密切相关的苹果PPO特性，为阐明其褐变机理提供理论参考。
1 材料与方法1.1材料与仪器特拉蒙与新红星杂交后代苹果54号、45号及富士：采于莱阳农学院园艺学院实验站蓬莱湾子口园艺场；儿茶酚、绿原酸、咖啡酸（sigma）、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、Vc、L-半光氨酸、EDTA-Na2、Na2S2O3：试剂均为分析纯；Allegra 64R冷冻离心机(BECKMAN) 、754紫外分光光度计、电子天平、超低温冰箱、电热恒温水浴锅；DYY-12型电脑三恒多用电泳仪、SL-2数控层析冷柜。
1.2 实验方法1.2.1 PPO的提取[3] 称取5 g果粉，用pH5.0的0.025 mol/L柠檬酸，0.05 mol/L磷酸缓冲液25 mL，在4 ℃下匀浆，然后在4 ℃下12 000 r/min冷冻离心20 min。
取上清液为粗酶液，备用。
1.2.2 PPO活性测定[2]用分光光度计法测定多酚氧化酶活性，反应体系为2.3 mL缓冲液，0.5 mL底物，0.2 mL酶液，每隔30 s测其吸光值，反应温度为35 ℃。
一个酶活单位为每毫升酶液在1 min内使OD值升高0.001（以U/g*min表示）。
1.2.3 pH对PPO活性的影响[7] 配制柠檬酸-磷酸缓冲液, pH分别为2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，以0.2 mol/L儿茶酚为底物，用上述方法测定多酚氧化酶的酶活力。
1.2.4 温度对PPO活性的影响 配制pH5.0的0.025 mol/L柠檬酸，0.05 mol/L磷酸缓冲液，分别在不同的温度4，25，30，35，40，45，50，55 ℃等，以0.2 mol/L儿茶酚为底物，测定多酚氧化酶的酶活。
1.2.5 PPO热稳定性测定 酶液分别在80 ℃下放置45，90，135，180 s，以0.2 mol/L儿茶酚为底物测其残余酶活。
1.2.6 PPO对不同底物的反应动力学Km和Vm的测定[4] 配制浓度分别为0.02，0.04，0.06 ，0.08，0.1 mol/L的儿茶酚底物，分别加入酶液，在pH5.0、温度35 ℃的条件下用分光光度计测定反应液PPO活力。
根据Linewear和Burk方程:1/V=Km/Vmax{1/[S]}+1/Vmax求得此条件下的Km及Vmax值[4]。
分别以不同浓度的儿茶酚、绿原酸及咖啡酸为反应底物，以此得到不同底物的Km和Vm值。
1.2.7 几种抑制剂对PPO活性的影响 配制浓度为1 mmol/L、0.02 mmol/L的L-Cys、EDTA-2Na、Vc、Na2S2O3溶液，反应体系调整为1.8 mLpH5 .0柠檬酸-磷酸缓冲液，0.5 mL抑制剂，0.5 mL儿茶酚在35 ℃下静置10 min，然后测定PPO活力。
1.2.8 同工酶酶谱的比较 采用垂直板聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳。
采用T=10%分离胶（pH8.9），T=5%浓缩胶(pH6.7) ，Tris-甘氨酸（pH8.3）电极缓冲液，在4 ℃下，电压300 V，电泳4 h[8]。
PPO染色用pH值4.5的醋酸缓冲液，0.6%的儿茶酚和0.05%的对苯二胺，35 ℃下染色直至酶带出现。
2 结果与分析2.1 pH对不同品种苹果PPO的影响由图1可见，不同杂交后代苹果PPO的最适pH值是不同的，54号为6.0， 45号和富士均为5.5。
pH值对PPO活性有明显影响，54号在pH＜3.5时，PPO活性缓慢增加，pH值在3.5～6之间，PPO活性急剧上升， pH＞6时，PPO活性迅速降低。
富士在pH＜5时，pH对PPO活性的影响不明显。
45号苹果在pH值3.5～4.0之间，pH对PPO活性的影响较为明显，而54号苹果在pH值3.5～4.0之间，pH对PPO活性的影响非常明显，由此可见，pH值对苹果PPO活性的影响与苹果的种类和品种密切相关。
2.2不同品种苹果PPO的最适温度由图2可以看出，不同杂交后代苹果PPO活性的最适温度是不同的。
45号为30 ℃，54号为35 ℃，富士为40 ℃。
在25 ℃以下，温度对54号和富士PPO活性影响均不明显，对45号影响较明显；在25～55 ℃之间，温度对45号和富士苹果PPO活性的变化影响均不明显；在4～35 ℃之间，54号PPO活性缓慢上升，在35 ℃以上，随温度的增加，PPO活性明显降低。
2.3不同品种苹果PPO的热稳定性由图3可以看出，不同杂交后代苹果PPO的热稳定性是不同的。
富士PPO的热稳定性较强，45号和54号PPO的热稳定性较差。
在90 ℃条件下处理45 s，各杂交后代PPO活性均急剧降低，45 s后不同苹果PPO活性降低趋于平缓，但其PPO钝化所需时间表现出显著差异，90 s时54号PPO失活，135 s时45号PPO失活，180 s时富士PPO失活。
由此可见，在果汁加工中钝化PPO所需的时间应因品种而异。
2.4 PPO酶促动力学参数Km和Vmax以儿茶酚为底物，采用L-B双倒数法作图，以儿茶酚的浓度倒数为横坐标，以儿茶酚的消耗量和醌的吸光值的倒数为纵坐标，米氏方程V=Vmax[S]/(Km+[S])可转化为1/V=Km/Vmax·[S]+1/Vmax形式。
对实验结果进行处理做出1/V～1/[S]图，见图4。
由图4 可以得到方程：Y=0.0004x+0.00071/Vm=0.0007Km/Vm=0.0004Km=0.57Vm=1428.57以此类推，得到其他品种不同底物的Km和Vm值。
表1 不同底物的Km(mol/L)和Vmax /（U/g.min-1）品种 儿茶酚 绿原酸 咖啡酸Km Vm Km Vm Km Vm富士 0.5714 1428.57 0.0026 258.71 0.0357 89.2954号 0.0428 1428.57 0.0063 625 0.0482 152.3645号 0.0833 833.33 0.0063 625 0.0445 136.52Km值大小表示酶对底物亲和力的大小，Km越小表示酶对底物亲和力越强。
由表1可以看出，不同苹果PPO的适宜底物依次为绿原酸、咖啡酸和儿茶酚。
同一种底物对不同苹果PPO 的Km值差异极为显著（0.0026～0.5714），以绿原酸为底物时，富士的Km值和Vmax值最小，45号和54号的Km值和Vmax值均相同；以咖啡酸为底物时，不同苹果Km值和Vmax大小为富士＜54号＜45号，54号和45号的Km值和Vmax差异不明显；以儿茶酚为底物时，Km值大小为54号＜45号＜富士，Vmax 大小为45号＜富士=54号，可见亲和力强，PPO活性并不一定就大。
2.5 抑制剂对PPO活性的影响表2 不同抑制剂对PPO活性的影响 /%种类 L-半胱氨酸/（mmol/L-1） 抗坏血酸/（mmol/L-1）Na2S2O3/（mmol/L-1）EDTA -2Na/（mmol/L-1）0.2 1 0.2 1 0.2 1 0.2 1富士 84.62 0 80.77 0 90.23 0 88.46 61.5454 70.59 29.41 98.82 63.52 85.67 0 96.47 9745 78.57 0 92.86 0 94.53 0 100 92.86由表2可以看出，各抑制剂对苹果PPO活性均有一定抑制能力，且抑制剂浓度增大，抑制能力强。