细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测基因表达水平。
其原理是通过逆转录将RNA转化为cDNA，并利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因的序列，最终定量检测目标基因的表达水平。
下面将详细介绍RT-PCR的原理。
1.逆转录（Reverse Transcription）逆转录是RT-PCR的第一步，主要是将目标基因的RNA转化为互补的DNA，即cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶（Reverse Transcriptase）和引物（Primers）的参与。
首先，待检测的RNA通过加热来解旋成为单链。
然后，在逆转录反应中，引物（Primers）结合在RNA的末端，提供一个起始点。
逆转录酶（Reverse Transcriptase）将引物作为模板，合成互补的DNA链。
引物一般选择Oligo-dT引物，它可以与RNA的多聚腺苷酸尾端结合，从而引导逆转录酶合成cDNA链。
此外，逆转录反应还需要dNTP（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液等辅助物资。
2. PCR扩增（Polymerase Chain Reaction）逆转录后得到的cDNA是目标基因的复制物。
为了增加检测敏感性，需进一步扩增cDNA序列。
在PCR扩增过程中，引物（Primers）的作用是选择目标基因的特异序列，通过引物与目标序列的互补配对，使DNA聚合酶（DNA Polymerase）能够在相应的温度下在该位置合成新的DNA链。
PCR扩增需要参与的物质有DNA聚合酶、引物、dNTP、缓冲液和模板DNA。
引物是PCR反应中的关键，其中一对引物的设计应使其能够选择性地与目标基因序列的两个位点互补，从而能够在接下来的扩增反应中产生目标DNA片段。
PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和扩增。
首先，通过高温（通常为94℃至96℃）变性步骤将目标DNA链分离为两个单链。
p53基因与蛋白质水平检测技术方法
p53基因与蛋白质水平检测技术方法
检测p53基因和蛋白质水平的常用技术方法有：
1. 基因测序：通过测序技术检测p53基因的DNA序列，从而
确定基因是否存在突变或缺失。
2. PCR（聚合酶链反应）：通过特异性引物扩增p53基因的片段，采用凝胶电泳或实时荧光定量PCR测定扩增产物的数量。
3. Southern印迹：通过限制性内切酶切割DNA并通过凝胶电
泳分离DNA片段，然后将片段转移到膜上并进行特异性探针
杂交，来检测p53基因是否存在缺失或重组。
4. Northern印迹：通过RNA提取、琼脂糖凝胶电泳和探针杂
交技术，来检测p53基因的转录水平。
5. Western印迹：通过蛋白质提取、SDS-PAGE凝胶电泳、膜
转移和抗体识别等步骤，来测定p53蛋白质的表达水平。
6. 免疫组织化学染色：通过对组织标本进行抗体染色，来观察p53蛋白质在组织中的表达。
7. 免疫荧光染色：通过使用荧光标记的抗体与细胞中的p53蛋白质结合，然后通过荧光显微镜观察p53蛋白质的分布和表达情况。
8. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过特异性抗体与p53蛋白
质结合，在酶的作用下产生发光或色素反应来测定p53蛋白质的浓度。
9. 质谱法（Mass spectrometry）：通过分析p53蛋白质的质量和碎片谱图，确定蛋白质是否含有突变。
以上这些方法可以在基础科研和临床实验室中使用，用于检测p53基因和蛋白质的水平，以研究其在细胞内的作用及与疾病的关联。
RTPCR原理和实验步骤
RT—PCR原理与实验步骤一、知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白) 共合成109个丝心蛋白。
因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2、PCR技术(Polymerase chain reaction）：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。
反应分三步：A。
变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合.C。
延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’3’方向延伸。
以上三步为一个循环,如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链;2、Rnase水解活性：水解RNA：DNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。
二、RT—PCR的准备:1。
引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定PCR反应特异性.因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型,不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
2) 引物设计原则的把握引物设计原则包括：a、引物长度：一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度,也影响反应的特异性。
RT PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达
RT-PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达一、实验原理细胞内RNA通常与蛋白质结核，防止RNA酶讲解，以核蛋白形式存在。
分离制备RNA 是必须先破碎细胞，使得核蛋白释放到溶液中，并进一步与蛋白质分离，然后再讲RNA 与其他成分分离，并保证RNA的完整性。
1、Trizol法该法分离提取RNA产率高、纯度好且不易降解，是目前实验室中最常用的提取RNA的方法。
Trizol是一种总RNS抽提试剂，含有苯酚（蛋白质变性，膜蛋白变性、膜磷脂溶解、RNA酶变性保护RNA）、异硫氰酸胍（蛋白质变性、RNS酶抑制剂）等物质，可以迅速溶解细胞同时保护RNA完整性。
之后再加入氯仿抽提，离心后，RNA位于水相，用异丙醇可沉淀回收水相中的RNA。
2、RNA质量标准RNA的均一性以及完整性，均一性在于有效去除其他成分，完整性在于最大限度减少RNA酶对RNA的讲解。
通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度：A260/A280=1.7~2.0，低于该值表明有蛋白污染。
PCR3、PCR聚合酶链式反应是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术。
利用两段已知序列度寡核苷酸作为引物，将两引物间特定的DNA片段进行复制，经过多次循环，使得模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。
其基本过程分为变性、退火、延伸三个步骤。
变性是高温加热导致模板DNA双链间的解离，退火是降低温度使得模板DNA与高浓度引物间发生互补结合，延伸是在耐热DNA聚合酶参与下延伸引物。
每次循环可作为下一次循环的模板，因此每经过一次循环特定DNA的分子数目扩增一倍。
4、RT-PCR反转录聚合酶链式反应是将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增。
RT-PCR实质上是对mRNA的扩增，我们常用此法克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
成熟的mRNA3’端有Poly尾可与Oligo特异性结合，然后在反转录酶催化下以mRNA为模板合成一条互补DNA链称为cDNA。
rtqpcr原理
rtqpcr原理RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它基于PCR技术，通过测量PCR反应过程中的荧光信号来实时监测DNA或RNA的扩增过程，从而能够准确、快速地定量分析样品中目标基因的表达水平或拷贝数。
本文将详细介绍RT-qPCR的原理及其在科研和临床中的应用。
RT-qPCR的原理主要包括RNA反转录、PCR扩增和荧光信号检测三个步骤。
首先，RNA反转录将RNA转录为cDNA，即反转录过程。
然后，PCR扩增通过DNA聚合酶酶链反应（PCR）使得目标DNA序列在体系中不断复制，从而形成指数级增长。
最后，荧光信号检测通过荧光染料实时监测PCR过程中的DNA合成量，从而得到实时的扩增曲线。
这三个步骤共同构成了RT-qPCR的原理。
RT-qPCR在科研和临床中有着广泛的应用。
在科研领域，RT-qPCR可以用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型鉴定等方面。
在基因表达分析中，科研人员可以通过RT-qPCR技术准确地测定目标基因在不同组织或不同处理条件下的表达水平，从而揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
在病原微生物检测中，RT-qPCR可以快速、灵敏地检测样品中的微生物DNA或RNA，对于临床诊断和疾病监测具有重要意义。
在临床领域，RT-qPCR常被用于病毒载量检测、癌症早期诊断、药物代谢鉴定等方面。
例如，临床医生可以利用RT-qPCR技术监测病毒患者血液中病毒载量的动态变化，指导临床治疗方案的调整。
总之，RT-qPCR作为一种准确、快速、灵敏的分子生物学技术，已经成为科研和临床实验室中不可或缺的工具。
它的原理简单清晰，应用广泛多样，为生命科学领域的研究和临床诊断带来了许多便利和突破。
相信随着技术的不断进步和完善，RT-qPCR在未来会有更加广阔的发展前景。
Beclin1、LC3 及 P53 在肺腺癌 EGFR-TKI 耐药中的表达及意义
Beclin1、LC3 及 P53 在肺腺癌 EGFR-TKI 耐药中的表达及意义摘要：目的探讨Beclin1、LC3 及 P53 在肺腺癌 EGFR-TKI 耐药的表达意义。
方法选取我院80例晚期肺腺癌患者标本，采用SP和RT-qPCR检测靶向治疗前与靶向耐药后自噬相关蛋白Beclin1、LC3和p53的表达水平。
结果与靶向治疗前比较，在靶向治疗耐药后，Beclinl、LC3 和p53在肺癌组织中的相对表达量比较差异均具有统计学意义(P<0.05）。
结论自噬相关蛋白Beclin1、LC3及 P53表达水平与EGFR-TKI耐药呈现相关性。
基金项目：吉安市指导性科技计划项目作者简介：罗亮，男，（1986.6--），硕士，主要从事肿瘤临床工作肺癌是常见的呼吸系统肿瘤，其发病和死亡率逐年上升[1]。
表皮生长因子酪氨酸激酶受体抑制剂(EGFR-TKI)通过抑制酪氨酸激酶的活性，阻断肿瘤细胞增殖和生长的通路，从而抑制肿瘤细胞的生长、迁移和加快其凋亡。
EGFR-TKI的应用不仅改善了患者预后，还延缓了肿瘤进展，对肺癌的治疗具有重要意义，但EGFR-TKI耐药问题亦不容忽视。
近年来，自噬和肿瘤的关系逐渐引起重视，自噬相关基因在肿瘤的发生、生长及转移的过程中发挥重要的作用[2]，通过调控自噬的表达可能逆转肿瘤细胞对EGFR-TKI的耐药。
本研究通过检测自噬相关蛋白在肺腺癌靶向治疗中的表达水平，探究肺癌自噬相关蛋白与EGFR-TKI耐药之间的关系，为肺癌耐药后的治疗提供策略。
1资料与方法1.1一般资料收集 2017年1月至 2021年1月井冈山大学附属医院 80 例晚期肺腺癌患者，所有患者均经支气管镜或经皮肺穿刺活检获取组织标本。
经基因检测为EGFR（19 外显子或 21 外显子 L858）突变；疾病进展后再次病理活检取得足量标本。
所有患者均为Ⅳ期，男性45例，女性35例，平均年龄64.8±7.4岁，两组在性别、年龄和分期方面比较均无统计学意义(P>0.05)。
RT-PCR在基因表达检测中的应用
RT-PCR在基因表达检测中的应用基因表达的检测有几种方法。
经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。
随着大分子分离技术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。
随着重组DNA技术的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。
目前有好几种方法广泛应用于于研究特定RNA 分子。
这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。
这里描述RT-PCR从RNA水平上检查基因表达的应用。
RT-PCR检测基因表达的问题讨论关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。
理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷贝）。
1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。
该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。
当已知量的转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。
用此技术现已从不到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。
因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。
将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。
我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓冲液进行PCR扩增循环。
当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。
我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是否成功还没有进行过严格的研究。
反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。
RT-PCR检测血细胞中p53基因的表达
P53基因
命名 该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质 功能作用 重要的抑癌基因，防止癌变 细胞基因的修复功能
RT-PCR
RT-PCR(反转录PCR技术)
RNA的反转录（reverse transcription ）和 cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技 术。
基因表达的检测方法 反转录的引物 在GenBank中查找p53基因
退火
四项 参数
变性的DNA快速冷却至40－ 60C可使引物和模板DNA发生 结合。可根据引物的长度和G＋ C的含量选择复性温度
延伸
一般是70－75C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。<1kb， 1分钟；>1kb的可适当延长时 间。
循环次数
理论上20－25个循环PCR产物的 累计即可达到最大值、实际操作中 25－30较合理。
查找P53序列
引物设计的原则
引物应用核酸系列保守区内设计 并具有特异性
1
5
碱基要随机分布
产物不能形成二级结构
2 3
4
6 7
8
引物自身及之间不能有连续4个碱 基的互补
引物长度一般在15~30碱基之间
引物5′端可以修饰 引物3’端不可修饰
G+C含量在40%~60%之间
引物3′端要避开密码子的第3位
Ques
1
2
3
4
cDNA
假阳性对照（出现的PCR扩增 条带一致，有时更整齐更明亮）
假阴性对照（什么条带没有）
汇报人：李尽美
日期：2016-11-21
03
05
特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为 引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特 异的PCR扩增。
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实验报告
实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR佥测p53基因的表达
报告人：张铨合作者：殷悦涵实验日期：2016.4.26
一、实验原理
1. 细胞RNA的提取及鉴定
细胞内RNA®常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP的形式存在。
分离、制备RNA
寸首先须破碎细胞，使RNF释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。
Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA W提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA由于RNase 能迅速降解RNA所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节避免它的污染。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在 1.7-2.0 之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。
2. RT-PCR 佥测p53 基因的表达
PCF是一种体外大量扩增特异DN/片段的分子生物学技术，利用已知序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过多次循环是模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。
基本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后
特定的DNA片段的分子数增加一倍。
RT-PCR各mRN反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物
进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞（A549和
H1299）中的表达水平。
二、实验材料及设备
材料：肺癌细胞A549 （野生型）和H1299 （p53缺失型）、p53引物、GAPDH 引物
试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖
耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩
设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温干燥箱、制冰机、可调式取液器、PCF仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、
凝胶成像系统、冰箱
三、实验步骤
1. 细胞RNA的提取及鉴定
（一）RNA提取
取1*106个细胞与1.5mlEp管—加0.2ml氯仿摇匀—4C，12000rpm离心15min 分层
—取上层水相入新的Ep管中加入等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min—4C, 12000rpm离心10min, RNA沉淀—弃上清，加1ml75聽醇洗涤沉淀—4C, 12000rpm离心5min—弃上清，晾干，用30卩l无RNase水溶解沉淀
（二）RNA浓度和纯度测定
取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和280nm 波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度
2. RT-PCR检测p53基因的表达
（一）反转录合成cDNA
1. R NA预变性：取一支0.2mlPCR管加入样品RNA^ g，以无水RNase水补足体积至9卩l，70C，10min，立即置于冰上。
2. 设置反转录反应体系，向管内加入
混匀。
42 °C，15min反转录；95 °C，5min终止反应。
置于冰上
（二）PCR T增目的产物每组做两份模板不同的PCF反应
94 C预变性5mi n
94 C变性30s
58 C退火30s
72 C延伸30s
共30个循环
72 C 延伸5mi n
（三）RT-PCR产物鉴定:
1.
配2%
琼脂糖凝胶：
琼脂糖2g
0.5*TBE 100ml 微波加热融化；冷却至60C左右，加入
GoldView（DNA染料）5 卩l 混匀，灌胶
2. 电泳：
向水平电泳槽中加入0.5*TBE至恰好浸没凝胶约1mm左右
取15卩IRT-PCR产物上样，100V电泳20~30min
结果观察：用凝胶成像仪观察并拍摄电泳结果，以DNA分子量标准（marker）
为参照，分析PCR产物大小及p53在两种细胞中的表达情况。
理论上，A549是p53野生型的细胞，正常表达p53,该样品的PCR产物经电泳后，应在390bp的位置出现扩增条带；而H1299是p53缺失型的细胞，不表达p53,在相应位置没有扩增条带。
管家基因GAPD作为实验的内部参照，在两种细胞中均有表达，电泳后在320bp处
出现扩增条带。
四、实验结果
1. 细胞RNA的提取及鉴定
提取到细胞RNA用NanoDrop2000超微量分光光度计检测其Abs260/Abs280为2.03，浓度为4.3989卩g/卩l。
2. RT-PCR检测p53基因的表达
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五、实验讨论
1. 细胞RNA的提取及鉴定
由于在RNA提取实验中，RNA浓度较高，为4.2卩g/卩l，导致在取2卩g的RNA时，只需取0.5卩l的RNA溶液，移液器的精度不高，容易造成误差，因此应将溶液稀释至1卩g/卩l左右再取2卩g的RNA溶液。
Abs260/Abs280为2.02，说明我们组提取的RNA较为纯净，提取步骤操作良好，几乎没有蛋白质的污染，该溶液可以使用到RT-PCR的实验中。
2. RT-PCR检测p53基因的表达
可以看到我们组A549细胞中在390bp的位置出现扩增条带，H1299在390bp 处没有出现扩增条带，可说明A549细胞中正常表达p53基因，经过RT-PCF扩增后在电泳凝胶成像仪中表现出390bp有扩增条带，H1299细胞则不表达p53,不出现扩增条带。
由于我组实验结果为阴性，所以不能看出在实验步骤中混入RNase降解RNA
但还需在实验步骤中注意佩戴口罩和手套。