苏云金芽孢杆菌固态发酵培养基的优化

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孙翠霞等 :苏云金芽孢杆菌固态发酵培养基的优化/ 2006 年第 8 期
表6 Tab. 6
无机盐优化正交实验方差分析 Variance analysis of orthogonal test
for optimizing inorganic salt
方差分析 平方和
自由度
F值
备注
KH2 PO4
Fe SO 4
g
0. 1 0. 2 0. 4 0. 1 0. 2 0. 4 0. 1 0. 2 0. 4 1. 329 1. 338 1. 332 0. 443 0. 446 0. 444 0. 003
( N H4) 2 SO4 MgSO4
g
g
0. 5
0. 2
0. 7
0. 4
0. 9
0. 6
0. 7
表4 Tab. 4
水平 1 2 3
无机盐水平表/ g
Level of inorganic salt/ g
A . KH2 PO4 B. FeSO4 C. ( N H4) 2 SO4 D. MgSO4
0. 3
0. 1
0. 5
0. 2
0. 4
0. 2
0. 7
0. 4
0. 5
0. 4
0. 9
0. 6
表 5 L9 ( 34 ) 无机盐优化正交实验设计和测量结果 Tab. 5 Design and result of orthogonal test for
图 1 碳源 、氮源 4 个水平与发酵液吸光度的关系 Fig. 1 Relationship of carbon and nitrogen resource at four
levels with absorbance of fermentation liquor
由图 1 可以看出 ,碳氮源最佳水平为 A3B3 C3 D3 E3 , 即麦麸 40 g、豆饼粉 10 g、玉米粉5 g、酵母粉 1 g、米糠 5 g。麦麸为菌体生长提供碳源 ,又是菌体生长的载体 , 它的物理性状决定它起着填充作用 ,增加麦麸的比例会 增加培养基的透气性 ,因此麦麸在培养基中所占比例较 大 。豆饼粉为蛋白质含量丰富的有机氮源 ,为菌体生 长代谢产物合成提供必要的氨基酸 ,但豆饼粉粘度比 较大 ,为防止影响透气性 ,又能提供充足的氮源 ,其比 例应该在每 40 g 麦麸中加入10 g豆饼粉 。 21 2 无机盐优化实验( 表 4 、表 5 、表 6 、图 2)
0. 031
2
15. 500
FeSO4
0. 000
2
0. 000 F0. 05 (2 ,3) = 19
( N H4) 2 SO4 0. 002
2
1. 000 F0. 10 (2 ,3) = 9. 0
MgSO4
0. 000
2
0. 000
误差
0. 03
2
从表 6 方差分析可以看出 , KH2 PO4 的 F 值为 151 500 ,说 明 KH2 PO4 对 发 酵 的 影 响 比 较 显 著 , 而 FeSO4 、(N H4 ) 2 SO4 、MgSO4 对发酵效果的影响不显 著 。由此可知 ,影响发酵效果的主因素是 KH2 PO4 。
2 结果与讨论
21 1 碳氮源优化实验( 表 1 、表 2 、表 3 、图 1)
收稿日期 :2006 - 06 - 05 作者简介 :孙翠霞 (1981 - ) ,女 ,河北人 ,硕士研究生 ,从事生物农药发酵的研究 ;通讯联系人 :弓爱君 。电话 :010282388592 , E2mail :
optimizing inorganic salt
实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 1 2 3 R
KH2 PO4
g
0. 3 0. 3 0. 3 0. 4 0. 4 0. 4 0. 5 0. 5 0. 5 1. 484 1. 427 1. 088 0. 495 0. 476 0. 363 0. 132
optimizing carbon and nitrogen resource
方差分析 麦麸 豆饼粉 玉米粉 酵母粉 米糠 误差
平方和 0. 022 0. 005 0. 001 0. 000 0. 002 0. 02
自由度 3 3 3 3 3 3
F值 4. 400 1. 000 0. 200 0. 000 0. 400
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2006 ,Vol. 23 No. 8 化 学 与 生 物 工 程
Chemistry & Bioengineering
苏云金芽孢杆菌固态发酵培养基的优化
孙翠霞 ,弓爱君 , 姚伟芳 , 邱丽娜 , 曹艳秋 (北京科技大学 ,北京 100083)
摘 要 :采用正交实验法 ,对苏云金芽孢杆菌固态发酵培养基进行优化 ,将发酵产品干燥粉碎后制成菌悬液 ,通过测 量其吸光度来确定不同农副产品培养基成分对苏云金芽孢杆菌发酵的影响 。实验结果表明 ,不同培养基成分配比对发 酵效果影响差别很大 ,确定最佳培养基组分为 :麦麸 631 9 %、豆饼粉 161 0 %、玉米粉 81 0 %、酵母粉 11 6 %、米糠 81 0 %、 KH2 PO4 01 5 %、FeSO4 01 3 %、(N H4 ) 2 SO4 11 1 %和 MgSO4 01 6 %。
1 Βιβλιοθήκη Baidu材料与方法
11 1 供试菌种 苏云金芽孢杆菌 HD21 。
11 2 培养基 斜面种子培养基 :牛肉膏 3 g ·L - 1 ,蛋白胨 10 g
·L - 1 ,氯化钠 5 g ·L - 1 ,琼脂 15～20 g ·L - 1 ,p H 值 71 4～71 6 。
液体种子培养基 :胰蛋白胨 5 g ·L - 1 ,酵母膏 5 g ·L - 1 ,葡萄糖 1 g ·L - 1 , Na2 H PO4 01 8 g ·L - 1 ,p H 值 71 2 。
序号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 K1 K2 K3 K4 1 2 3 4 R
麦麸
g
30 30 30 30 35 35 35 35 40 40 40 40 45 45 45 45 1. 881 2. 174 2. 287 2. 152 0. 470 0. 544 0. 572 0. 538 0. 102
吸光度
0. 401 0. 481 0. 510 0. 489 0. 536 0. 537 0. 551 0. 550 0. 562 0. 543 0. 586 0. 596 0. 520 0. 537 0. 545 0. 550
表3 Tab. 3
碳氮源优化正交实验方差分析 Variance analysis of orthogonal test for
按照正交实验的配比进行固体发酵 ,在 31 ℃恒温 培养50 h ,停止发酵 。
将发酵物干燥后 ,准确称取干燥发酵成品 11 0 g , 加入装有数十枚玻璃珠的锥形瓶内 ,再加入50 mL 无 菌水 ,在振荡器上振荡 30 min , 将发酵成品打碎 ,过 滤 ,定容至 200 mL ,制成菌悬液 ,然后取出 10 mL ,再 稀释至200 mL ,在278 nm处测量吸光度 ,每种发酵液 重复 5 次 。
sf scx689 @sohu. co m 。
孙翠霞等 :苏云金芽孢杆菌固态发酵培养基的优化/ 2006 年第 8 期
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表1 Tab. 1
水平 1 2 3 4
碳源 、氮源水平表/ g
Level of carbon and nitrogen resource/ g
A. 麦麸 B. 豆饼粉 C. 玉米粉 D. 酵母粉
豆饼粉
g
0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 15 2. 019 2. 098 2. 192 2. 185 0. 505 0. 524 0. 548 0. 546 0. 043
玉米粉
g
0 2. 5
5 7. 5 2. 5
0 7. 5
5 5 7. 5 0 2. 5 7. 5 5 2. 5 0 2. 074 2. 158 2. 159 2. 103 0. 518 0. 539 0. 540 0. 526 0. 022
筛选固体培养基 :麦麸 、玉米粉 、豆饼粉 、米糠 、酵 母粉 ( 购 于 市 场 ) 、KH2 PO4 ( 北 京 红 星 化 工 厂 ) 、 (N H4 ) 2 SO4 、FeSO4 、MgSO4 (北京化学试剂公司) 。 11 3 仪器和设备
自制固态反应器 ,高压灭菌锅 , SW2CJ2FD 型净化 工作台 ,J Y92 型超声波细胞粉碎机 ,250D 型数显光照 培养箱 ,NIKON 显微镜 ,752C 型紫外可见分光光度计。 11 4 培养基筛选方法
与化学杀虫剂相比 ,苏云金芽孢杆菌对营养物质 的要求不高 ,在含氮 01 075 %～01 225 %、含糖 01 1 %～ 11 5 %和糖氮比 01 44～201 0 的环境下就能很好地生 长[2] ,但是选择合适的碳源 、氮源和无机盐以及它们之 间的比例直接影响到目标产物伴孢晶体的产生[3～5] 。 利用一些生产成本低廉的农副产品作为发酵培养基的 主要碳氮源可以降低发酵生产成本 ,有利于实现工业 化大规模发酵生产[6] 。作者采用正交实验对苏云金芽 孢杆菌固态发酵培养基进行优化 ,确定了 HD21 菌株 的最佳固体发酵培养基组分 。
关键词 :苏云金芽孢杆菌 ;固态发酵 ;正交实验 中图分类号 : TQ 9201 1 文献标识码 :A 文章编号 :1672 - 5425 (2006) 08 - 0034 - 03
苏云金芽孢杆菌 (简称 Bt ) 是目前世界上生产和 使用量最大的生物杀虫剂 。固体发酵作为 Bt 工业发 酵的一种新方法 , 和液体发酵相比在生产中逐渐体现 出它的优越性 :培养基含水量少 ,废水少 ,废渣少 ,环境 污染少 ,容易处理 ;能源消耗量低 ,工艺设备和技术较简 单 ,投资低 ;产物浓度高 ,后处理方便等[1] 。Bt 的发酵工 艺由液体发酵转为固态发酵 ,效价得到了明显提高 。
备注
F0. 05 (3 ,4) = 9. 28 F0. 10 (3 ,4) = 5. 39
从表 3 方差分析可以看出 ,麦麸和豆饼粉的 F 值
分别为 41 400 和 11 000 ,说明麦麸和豆饼粉对发酵的 影响比较显著 ,而玉米粉 、酵母粉和米糠对发酵液吸光
度的影响不大 ,以玉米粉和酵母粉的影响最小 。由此 可知 ,影响发酵效果的主要因素为麦麸和豆饼粉 。
酵母粉
g
0 0. 5
1 2 1 2 0 0. 5 2 1 0. 5 0 0. 5 0 2 1 2. 085 2. 137 2. 139 2. 133 0. 521 0. 534 0. 535 0. 533 0. 014
米糠
g
0 2. 5
5 7. 5 7. 5
5 2. 5
0 2. 5
0 7. 5
5 5 7. 5 0 2. 5 2. 039 2. 144 2. 163 2. 148 0. 510 0. 536 0. 541 0. 537 0. 031
0. 6
0. 9
0. 2
0. 5
0. 4
0. 9
0. 4
0. 5
0. 6
0. 7 1. 295 1. 400
0. 2 1. 346 1. 349
1. 304 0. 432 0. 467 0. 435
1. 304 0. 449 0. 450 0. 435
0. 035
0. 015
吸光度
0. 485 0. 524 0. 475 0. 487 0. 472 0. 468 0. 357 0. 342 0. 389
根据菌体总数多少和伴孢晶体吸光度值的大小 , 把目标产物的吸光度作为优化培养基的依据 。选择米 糠 、麦麸 、豆饼粉 、玉米粉 、酵母粉 5 个因素 ,每个因素 分别选 4 个水平设计正交实验 ,应用 L16 (45 ) 正交表对 各组分进行优化实验 。
将 KH2 PO4 、FeSO4 、( N H4 ) 2 SO4 和 MgSO4 4 个 因素作为培养基无机盐成分 ,每个因素选 3 个水平设 计正交实验 ,应用 L9 (34 ) 正交表对无机盐组分进行优 化实验 。 11 5 吸光度测定方法
30
0
0
0
35
5
2. 5
0. 5
40
10
5
1
45
15
7. 5
2
E. 米糠 0 2. 5 5 7. 5
表 2 L16 ( 45 ) 碳氮源优化正交实验设计和测量结果 Tab. 2 Design and result of orthogonal test for optimizing
carbon and nitrogen resource