一种农用抗生素发酵培养基优化及其分离纯化工艺研究

中国抗生素杂志２０１３年１２月第３８卷第１２期　文章编号：１００１－８６８９（２０１３）１２—０９０９・０６　

一种农用抗生素发酵培养基优化及其分离纯化工艺研究　黄永春刘红梅陈志永赵鹏张伟　（农业部环境保护科研监测所，天津３００１９１）　

摘要：目的　优化分离获得的一株土壤稀有放线菌发酵培养基，获得该有效成分的大孔树脂分离条件。方法　分别利用　单因素试验和均匀试验设计法，对发酵培养基构成成分和最佳用量进行优化；分别利用抑菌圈法和液相色谱法对发酵液中有效　成分含量进行测定，考察大孔树脂的吸附及解吸附参数。结果　经优化后的最佳培养基配方为葡萄糖１．８％、蛋白胨０．５％、豆粕　０．３％、酵母膏１．０％、ＣａＣＯ，Ｏ．２５％，此时发酵液中有效成分活性最强；Ｄ．１０１型大孔吸附树脂对发酵液中有效成分的吸附能力最　强，最佳吸附时间为１２０ｍｉｎ，采用７０％的丙酮水溶液即可对有效成分形成有效解吸附，最佳解吸附时间为１２０ｍｉｎ。结论　通过　一次吸附与解吸附分离使发酵液中有效成分得到了有效分离。　关键词：卡伍尔链霉菌；大孔树脂；农用抗生素　中图分类号：Ｒ３７８　文献标志码：Ａ　

Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ．Ｃａｖｏｕｒｅｎｓｉｓ　ｂｙ　ｍａｃｒｏｐｏｒｏｎｓ　ｒｅｓｉｎ　

Ｈｕａｎｇ　Ｙｏｎｇ－ｃｈｕｎ，Ｌｉｕ　Ｈｏｎｇ—ｍｅｉ，Ｃｈｅｎ　Ｚｈｉ—ｙｏｎｇ，Ｚｈａｏ　Ｐｅｎｇ　ａｎｄ　Ｚｈａｎｇ　Ｗｅｉ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＡｇｒｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１９１）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｔｈｅ　ｆｅ：ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ａ　ｓｏｉｌ　ｒａｒｅ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ　ｓｐ．ａｎｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＯＲｅ．ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ；ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＨＰＬＣ　ａｎｄ　ｃｕｐ—ｐｌａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｂｙ　ｕｎｉｆｏｒｉｌｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｇｌｕｃｏｓｅ　１．８％，ｐｅｐｔｏｎｅ　０．５％，ｂｅａｎ　ｃａｋｅ　０．３％，ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　１．０％，ｃａｌｃｉｕｍ　ｃａｒｂｏｎａｔｅ　Ｏ．Ｏ２５％．Ｔｈｅ　ｄｙｎａｍｉｃ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　Ｄ一１　０　１　ｒｅｓｉｎ　ｈａｄ　ｇｏｏｄ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｆｒｏｍ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　１２０　ｍｉｎｕｔｅｓ，　ｔｈｅ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｅｔｏｎｅ　ｗａｓ　７０％．ｔｈｅ　ＰＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｗａｓ　６．０．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｗａｓ　ｒｅｆｉｎｅｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｏｎｃｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｖｏｕｒｅｎｓｉｓ；Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｎｓ　ｒｅｓｉｎ；Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　

探寻应用于农业、医药及工业用途的抗生素一　直以来对世界各国都具有重要意义【　】。从微生物次生　代谢产物中筛选生物活性物质是新农药研究与开发　的一条重要途径。截止到目前为止，已报道Ｔ２２，５００　个具有明确生物活性的化合物【ｚ】，其中直接使用的有　１５０～１６０个，还有大约同等数量的化合物成为优秀的　

收稿日期：２０１２．１２—２２　基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（农业部环境保护科研监测所）自主项目（２０１２一ＳＺＪＪ—ＨＹＣ）；天津市自然科学基　

金项目（１２ＪＣＹＢＪＣ１９９００）　作者简介：黄永春，男，生于１９７４年，副研究员，长期从事微生物源农药的研发工作，Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｙａｌｂ＠１２６．ｃｏｍ　９１０　一种农用抗生素发酵培养基优化及其分离纯化工艺研究黄永春等　先导化合物，其成功率为０．２～０．３％，比前者的成功　率高出两个数量级［３］。由此可见，从微生物代谢产物　中寻找新型农药是一种简便、高效的方法。目前从　土壤放线菌中筛选抗真菌类农用抗生素的研究已取　得丰硕成果［４－６］，并且具有广阔发展前景。　优化新筛选到的天然菌株发酵培养基，并从发　酵液中分离纯化有效成份为分子结构鉴定提供物质基　础，是农用抗生素研发过程中的两项重要步骤。目前　很多种试验方法如均匀试验设计法［　、正交试验设计　法【ｓ】等都可用于指导培养基优化研究，有效降低发酵　试验工作量。发酵液中往往成份复杂，既有大量未完　全利用的培养基成分，也存在菌株发酵过程中代谢分　泌的非分离目标成份，通过优化培养基成分配比，提　高发酵液中有效成分浓度，同时减少培养基成分剩余　量，可有效为下一步的分离纯化创造有利条件。目前　发酵液中有效成份的分离纯化技术已经成为农用抗生　素研发成败的瓶颈限制因素之一［９］。　本课题组在前期研究工作中从土壤中分离获　得一株稀有放线菌【　】，后经菌株鉴定表明为一株卡　伍尔链霉菌　Ｃａｖｏｕｒｅｎｓｉｓ）（菌株鉴定部分内容待发　表）。经分离纯化后的有效成份室内及田问抗菌谱试　验表明，可对多种农作物病原真菌及细菌产生显著　抗性，具有较好的开发前景。本研究在前期工作基　础之上，对该菌株的发酵条件及有效成份的大孔树　脂分离纯化工艺进行了研究。构建了该菌株的摇瓶　发酵及大孔吸附树脂对有效成份的动态吸附与解吸　附分离纯化工艺。　１仪器与材料　高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器，岛津　公司）；旋转蒸发仪（ＥＬＹＥＬＡ，ＯＳＢ。２０００）；酸度计　（ＭＥＴＴＬＥＲ　ＴＯＬＥＤＯ）；离心机（湘仪，Ｈ一２０５０Ｒ）；　恒温摇床（上海智诚，ＺＨＷＹ－２０１２）；葡萄糖；蛋白　胨；豆粕；酵母膏；工业级大孔吸附树脂：ＡＢ．８，　ＮＡＫ一９，Ｄ一１０１，Ｄ　４０２０南开大学合成树脂厂。使用　前用乙醇浸泡隔夜，抽滤，弃去乙醇相，用蒸馏水　反复冲洗至没有乙醇味，备用。　抗生素原始生产菌株（　．ｃａｖｏｕｒｅｎｓｉｓ）：本实验室　自土壤中分离获得。　活性指示菌：总状毛霉（Ｍｕｃｏｒ　ｒａｃｅｍｏｓｕｓ），由　本实验室收藏。　２方法与结果　基础发酵培养基：葡萄糖１．０％、蛋白胨０．５％、　豆粕Ｏ．５％、酵母膏０．５％、ＣａＣＯ，０．２％。　真菌培养基（ＰＤＡ）：土豆汁２０％，葡萄糖２％，　琼脂２％。　发酵液活性测定方法：采用管碟法［１１］对发酵液　中有效成分进行测定。取５０００ｒ／ｍｉｎ离心并经０．４５ｇｍ　孔径滤膜过滤的发酵上清液或解吸附液２００ｇＬ于牛津　杯中，在ＰＤＡ培养基上以总状毛霉为指示菌生测，　以抑菌圈直径表示待测液活性大小，重复３次，数据　采用ＳＰＳＳ处理系统进行差异显著性分析。　有效成分的液相色谱测定方法：以７０％甲醇水　作流动相，流速为１．２ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２５４ｎｍ。　２．１　氮源对发酵液抑菌活性的影响　在基础培养基中分别添加浓度为０．５％的不同氮　源，它们对发酵液抑菌活性的影响见表１。在供试的　７种氮源中，以豆粕、酵母膏、蛋白胨作碳源时的抑　菌效果最好，以（ＮＨ　），ＳＯ　、ＫＮＯ，、牛肉膏作氮源时　抑菌效果比较差，而以尿素作氮源时则完全未见抑　菌活性。结果表明，以豆粕、酵母膏、蛋白胨作氮　源有利于抗菌代谢产物的产生。　２．２碳源对发酵液抑菌活性的影响　在基础培养基中分别添加浓度为１％的不同碳　源，它们对发酵液抑菌活性的影响见表２。在供试的　６种碳源中，以葡萄糖作碳源时发酵液的抑菌效果最　好，其次为甘油，以麦芽浸膏和玉米粉作碳源时抑　菌效果比较差，而使用蔗糖和可溶性淀粉则未见抑　菌活性。结果表明，以葡萄糖作碳源时有利于抗菌　代谢产物的产生。　２－３无机盐对发酵液抑菌活性的影响　在基础培养基中分别添加浓度为０．０２％的不同种　类的无机盐，并以不添加无机盐为对照，无机盐对发　酵液抑菌活性的影响见表３。从表３可以看出，在供　

表１不同氮源对发酵液抑菌活性的影响　Ｔａｂ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｎ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　

“一”表示无抑菌活性，以下表示与之相同。　

小写字母表示差异的显著性（Ｐ＜０．０５），字母不同则表示差异显　著，字母相同表示差异不显著。　中国抗生素杂志２０１３年１２月第３８卷第１２期　表２不同碳源对发酵液抑菌活性的影响　Ｔａｂ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｎ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　

“一”表示无抑菌活性，以下表示与之相同。　

小写字母表示差异的显著性（　：０．０５），字母不同则表示差异显著　字母相同表示差异不显著。　

试的７种无机盐中，以添加０．０２％的ＣａＣＯ，对发酵液　抑菌活性影响最明显。结果表明，向发酵液中添加　ＣａＣＯ，有利于抗菌代谢产物的产生。　２．４基础发酵培养基的优化研究　采用Ｕ１０（１０１Ｏ）均匀设计对基础培养基中各种　成份的配比进行优化研究，活性测试数据结果采用　ＳＰＳＳ软件进行差异显著性分析，结果见表４。　对实验结果（表４）进行回归分析、优化处理，　得到如下的回归方程：　１　５．０４＋１．５６Ｘ，．０．６８置一　０．５５ｘ３＋ｏ．４４ｘ４—１．８２ｘ５（（￣中　、　、　、　、　分别　为葡萄糖、蛋白胨、豆粕、酵母膏、碳酸钙的添加　量）。根据回归方程得到优化的培养基条件为：葡　萄糖１．８％、蛋白胨０．５％、豆粕Ｏ．３％、酵母膏１．０％、　ＣａＣＯ　０．２５％。采用优化的培养基得到的抑菌圈直径　可达１７．４　ｍｍ。利用经过优化后的培养基配方，在摇　床上于２８℃恒温条件下发酵９６ｈｆ￣ｌＪ各发酵液，供分离　纯化试验研究。　２＿５大孔吸附树脂型号筛选方法　大孔吸附树脂是当前微生物源天然产物分离技　表３不同无机盐对发酵液抑菌活性的影响　Ｔａｂ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｓａｌｔｓ　ｏｎ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　“一”表示无抑菌活性，以下表示与之相同。　小写字母表示差异的显著性（Ｐ＜Ｏ．０５），字母不同则表示差异显　著，字母相同表示差异不显著。　术领域发展最迅速、最活跃的分支之一，目前它已　逐渐取代活性炭和氧化铝等吸附剂，在抗生素工业　中显示出越来越重要的地位［　】。大孔吸附树脂是一　类有机高聚物吸附剂，它具有比表面积较大、交换　速度较快、机械强度高、对被提取物污染小、热稳　定好等特点【１３］。利用大孔树脂对发酵液中抗生素的　吸附与解吸附过程对发酵液中目标产物进行分离纯　化，已经成为抗生素分离纯化过程中一种几乎必不　可少的程序。有文献报道，近年来国内应用大孔吸　附树脂进行分离［１４－１５】、提取、浓缩、纯化的抗生素涵　盖了目前已知抗生素的所有类型［１６】。　分别称取四种预处理好的不同型号大孔吸附树　脂各５０．０ｇ于４个５００ｍＬ玻璃三角瓶中，分别向其中加　入２００ｍＬ经５０００ｒ／ｍｉｎ离心的发酵上清液，每种型号　树脂重复３次，封口后置于摇床上以１　５０／ｍｉｎ震荡吸　附１２０ｍｉｎ，分别取各瓶中经吸附后的发酵液按照２中　所述方法进行生测，不同型号大孔吸附树脂对发酵　液中有效成分的吸附情况如下表５所示。　表４　Ｕ１０（１０１０）优化培养基组成的试验结果　Ｔａｂ．４　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｂｙ　ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ　ｍｅｔｈｏｄ　水平　葡萄糖／％　蛋白胨／％　豆粕　酵母膏　碳酸钙　抑菌圈直径／ｍｍ　１４．４ｈ　ｌ５．２ｇ　ｌ５．７ｆ　１６．５ｄ　１６．４ｄ　１６．７ｃ　１６．２ｅ　１７．１ｂ　１７．４ａ　ｌ７．０ｂ