高效液相色谱法精品PPT课件
合集下载
液相色谱法ppt课件
二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
21
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
5
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
21
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
5
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
高效液相色谱法培训PPT课件
chromatography）。
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
5
离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
45
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
5
离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
45
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述
waters e高效液相色谱ppt课件
-
18
色谱柱的使用及操作
• 流动相的转换要缓慢 • 流速(压力)的变化幅度较小，比较稳定 • 温度的变化幅度 • 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
-
19
样品管理系统的准备
装载样品盘（loading carousels）：
医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
• 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
-
2
什么是高效液相色谱法
• 定量分析主要基于与标准品的比较
是其最大应用领域
• 定性分析；不是色谱的强项
基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器
• 对定量及定性分析的要求
灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用
-
40
HPLC使用常见注意事项
• 1.夏季气温高，水容易生菌，要求HPLC所用重蒸水必须每天都要更新。 • 2.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。高低流速交替冲洗。 • 3. 配制的流动相使用前要脱气，常用超声脱气法：流动相放在超声波容器中，
用超声波振荡10-15min，此法效果一般，但比较方便。
-
7
Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法
• 仪器组成及开机 • 溶剂管理系统的准备 • 样品管理系统的准备 • 运行样品 • 数据采集 • 报告打印 • 关机
-
8
Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法
• 仪器组成及开机
1 仪器组成
• Waters e2695 分离单元 • 2498型紫外检测器 • 色谱管理工作站 • 打印机
《液相色谱法》PPT课件
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
§7-1 概述
（1）液相色谱简介
（2）液相色谱的发展
（3）液相色谱的分类
§7-2 液相色谱仪
（1）液相色谱仪
（2）液相色谱仪的流程图
（3）液相色谱仪的工作过程
（4）液相色谱仪的基本组成系统
（5）高压泵
精选课件ppt
1
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化
手性色谱
立体效应 手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
两种最常用的色谱法
（一）吸附色谱法（adsorption chromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色
谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流 动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。 在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力 的不同而被分离。
（6）梯度洗脱装置 （7）进样器 （8）色谱柱 （9）色谱填料 （10）检测器 （11）数据处理系统与自动控制单元
§7-3 新型液相色谱仪简介
（1） waters的UPLC （2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型 （3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪
§7-1 概述
（1）液相色谱简介
（2）液相色谱的发展
（3）液相色谱的分类
§7-2 液相色谱仪
（1）液相色谱仪
（2）液相色谱仪的流程图
（3）液相色谱仪的工作过程
（4）液相色谱仪的基本组成系统
（5）高压泵
精选课件ppt
1
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化
手性色谱
立体效应 手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
两种最常用的色谱法
（一）吸附色谱法（adsorption chromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色
谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流 动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。 在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力 的不同而被分离。
（6）梯度洗脱装置 （7）进样器 （8）色谱柱 （9）色谱填料 （10）检测器 （11）数据处理系统与自动控制单元
§7-3 新型液相色谱仪简介
（1） waters的UPLC （2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型 （3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪
高效液相色谱法 (HPLC)ppt课件
Chromatography)
总之，HPLC与经典LC相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和 连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具 有较高的准确性和精密度。
经典LC的特点：简精便选课件，PPT填料一次使用。 9
高效液相色谱仪基本装置
进样阀 色谱柱
检测器
流动相 高压泵
● 通用检测器与选择型检测器
● 浓度型检测器和质量精选型课件检PPT测器
20
检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直
接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。
◆ 检测器的线性范围
大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性
响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y = a c , 只有在三 个数量级的浓度范围内满足0.98 1.02的线性响应的检测器 才是线性的。
高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电色谱(CEC) 、微柱液相色
谱(μ- HPLC) 、固相萃取等系统上, 成功地应用于生命科学、药
物学、环境科学等领域的分精离选分课件析PP。T
31
精选课件PPT
何为无死 体积柱头 连接？
无限直径 效应（无 限直径 柱）？
32
柱填料
硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。 此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无 机金属氧化物等。
tr nrti
● 基线校正和重叠峰的分离
在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能
完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂
移值参数来解决
精选课件PPT
25
色谱仪自动定性和定量分析
定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通 过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时, 一般通过保留 值来识别峰。但由于各种因素的影响, 在重复多次分析中, 保留 值会有一定的变化, 可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。
总之，HPLC与经典LC相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和 连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具 有较高的准确性和精密度。
经典LC的特点：简精便选课件，PPT填料一次使用。 9
高效液相色谱仪基本装置
进样阀 色谱柱
检测器
流动相 高压泵
● 通用检测器与选择型检测器
● 浓度型检测器和质量精选型课件检PPT测器
20
检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直
接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。
◆ 检测器的线性范围
大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性
响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y = a c , 只有在三 个数量级的浓度范围内满足0.98 1.02的线性响应的检测器 才是线性的。
高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电色谱(CEC) 、微柱液相色
谱(μ- HPLC) 、固相萃取等系统上, 成功地应用于生命科学、药
物学、环境科学等领域的分精离选分课件析PP。T
31
精选课件PPT
何为无死 体积柱头 连接？
无限直径 效应（无 限直径 柱）？
32
柱填料
硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。 此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无 机金属氧化物等。
tr nrti
● 基线校正和重叠峰的分离
在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能
完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂
移值参数来解决
精选课件PPT
25
色谱仪自动定性和定量分析
定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通 过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时, 一般通过保留 值来识别峰。但由于各种因素的影响, 在重复多次分析中, 保留 值会有一定的变化, 可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高效液相色谱法
第一节 概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱仪流程图 四、特点
1
一、HPLC与经典LC区别
✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1．经典LC：仅做为一种分离手段
或 H B / u C u （毛细管柱）
A 2 dp
A dp
B 2 Dm 2 Dg
B tR ，B Dg
Dg
T
或Dg
T M
C Cm Cs Cg Cl Cl
Cl
df 2 Dl
DL
T
9
续前
2. HPLC：H A C u
B 2 Dm
Dm
T
柱温T 低，流动相 大 B相忽略
11
续前
3）传质阻抗项及其影响
C Cm Csm Cs Cm Cs（m 忽略固定相传质阻抗 ） 注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
Cm
Csm
dp 2 Dm
C dp2 Dm
T
Dm
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效
➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）next
u 1cm / s时，H u
u H ，n 柱效 ，但tR
兼顾柱效和分析时间，选择u 1ml / min
2）涡流扩散项及其影响 next
A 2 dp
A dp
，dp A H ，n 柱效 10
图示
back
T Dm C ，但易产生气泡
T Dm ， ，柱阻
12
图示
13
三、HPLC法中分离条件的选择
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温250C左右
原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
17
续前
3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -
4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓
高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
6
第二节 基本理论和条件选择
热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——Vander方程
基础
一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择
7
一、塔板理论
✓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC • 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 • 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体
吸附的水→固定液
18
二、液液分配色谱法（LLC）
1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）
缺点：系统内部压力大，易流失，不实用
固定液——极性→NLLC
固定液——非极性→RLLC
3．正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（NLLC）
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
2
二、HPLC与GC差别
✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 ✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20%
HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
3
续前
3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
4
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
5
续前
四、HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
14
第三节 各类高效液相色谱法
一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（BPC）
15
一、液固吸附色谱法（LSC）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异
tR
t0 (1
K
S Vm
)
kK S Vm
➢ 分离前提：K不等或k不等
H理 L / n理
H eff L / neff
n理
(tR
)2
5.54( tR W1 2
)2
16(tR W
)2
neff
16(
t
' R
)2
W
5.54(
t
'Leabharlann R)2W1 2k
t
' R
t0
neff
n理
( 1
k
k
)
2
8
二、速率理论（与GC对比）
1. GC：H A B / u C u （填充柱）
16
续前
2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）
（1）硅胶
表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶 无定形 YWG
球形 YQG 堆积硅珠 YQG 3~4 μm
5~6μm 5×104 3~4μm 8×108
8×108 理想
原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物
（2）高分子多孔小球：YSG
第一节 概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱仪流程图 四、特点
1
一、HPLC与经典LC区别
✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1．经典LC：仅做为一种分离手段
或 H B / u C u （毛细管柱）
A 2 dp
A dp
B 2 Dm 2 Dg
B tR ，B Dg
Dg
T
或Dg
T M
C Cm Cs Cg Cl Cl
Cl
df 2 Dl
DL
T
9
续前
2. HPLC：H A C u
B 2 Dm
Dm
T
柱温T 低，流动相 大 B相忽略
11
续前
3）传质阻抗项及其影响
C Cm Csm Cs Cm Cs（m 忽略固定相传质阻抗 ） 注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
Cm
Csm
dp 2 Dm
C dp2 Dm
T
Dm
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效
➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）next
u 1cm / s时，H u
u H ，n 柱效 ，但tR
兼顾柱效和分析时间，选择u 1ml / min
2）涡流扩散项及其影响 next
A 2 dp
A dp
，dp A H ，n 柱效 10
图示
back
T Dm C ，但易产生气泡
T Dm ， ，柱阻
12
图示
13
三、HPLC法中分离条件的选择
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温250C左右
原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
17
续前
3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -
4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓
高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
6
第二节 基本理论和条件选择
热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——Vander方程
基础
一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择
7
一、塔板理论
✓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC • 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 • 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体
吸附的水→固定液
18
二、液液分配色谱法（LLC）
1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）
缺点：系统内部压力大，易流失，不实用
固定液——极性→NLLC
固定液——非极性→RLLC
3．正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（NLLC）
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
2
二、HPLC与GC差别
✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 ✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20%
HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
3
续前
3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
4
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
5
续前
四、HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
14
第三节 各类高效液相色谱法
一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（BPC）
15
一、液固吸附色谱法（LSC）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异
tR
t0 (1
K
S Vm
)
kK S Vm
➢ 分离前提：K不等或k不等
H理 L / n理
H eff L / neff
n理
(tR
)2
5.54( tR W1 2
)2
16(tR W
)2
neff
16(
t
' R
)2
W
5.54(
t
'Leabharlann R)2W1 2k
t
' R
t0
neff
n理
( 1
k
k
)
2
8
二、速率理论（与GC对比）
1. GC：H A B / u C u （填充柱）
16
续前
2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）
（1）硅胶
表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶 无定形 YWG
球形 YQG 堆积硅珠 YQG 3~4 μm
5~6μm 5×104 3~4μm 8×108
8×108 理想
原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物
（2）高分子多孔小球：YSG