利用高效弱阴离子交换色谱法纯化超氧化物歧化酶

表 １ 用不 同色谱柱时 Ｓ Ｄ的活性 回收率及活 力分布 Ｏ
流动相 浓度 ： 了考 察流动相浓度对 Ｓ Ｄ洗脱 为 Ｏ 效率 的影 响 ， 了不同盐浓度下 Ｓ Ｄ的活性 回收 测定 Ｏ 率（ ２。 图 由图 ２ 可看 出 ， Ｎ Ｃ 浓度增加 ， 随 ａｌ 交换平
衡移向有利于蛋白质解析的方向， 导致Ｓ Ｄ活性回 Ｏ
色谱 条件： 谱柱 为弱 阴离子 交换 柱 Ｓｉ－ａ ， 色 ｈ Ｐｃ ｍ ｋ
ＷＡ －， ０ Ｘ １ ５ｍｍ ４６ ｍ ． 流 动 相 Ａ Ｈ Ｏ， ．ｍ ｉ ．ｄ ．２ Ｂ １ ｏ／ Ｎ Ｃ－．２ ｏ／ Ｎ ２ Ｐ ４ Ｈ ６ ； ．．ｍ ｌ ａ Ｉ ０ｍ ｌ ａＨ Ｏ （ ７ ）阶式 Ｌ ０ Ｌ Ｐ ． 梯度洗脱 ６ ｉ ＝０ ６ ２ｍｎ ｍｎＢ ６ ｉ Ｂ从 到 １０ 流 ０ ％； 速 ： ．ｍ ／ ｉ患 测 器 ： １２ Ｌ ｍｎ 检 ＵＶ ＝ ２０ｍ ； 样 ： ８ｎ 进 ５ ０Ｌ Ｄ粗提 液。 Ｓ Ｏ
收 率增大 。当 Ｎ Ｃ 浓度增 加到 １ ｏ／ ａｌ ．ｍ ｌ Ｌ时 ，Ｏ ＳＤ 活性 回收率最高 ， 超过此值 回收率 开始下降 。 在离子 从 活性 回收率看 ， 水柱 回收率最低 ， ７％ ， 疏 为 ９ 其它三种柱型均在 ９％以上 。 ３ 从分离情 况和活力分 布来看 ， 排阻柱 、 尺寸 疏水柱 和强阴离子交换 柱分离 不 完 全 而 且 活力 分 散， 弱 阴 离 子 交 换 柱 在 用 １．８ ｉ得 到一个活力集 中的尖锐 峰。 ３３ｍｎ 该峰虽然未
关键词 高效阴离子交换色谱法 ， 超氧化物歧化酶 ， 牛血
１ 前言
超 氧化物歧化酶 （ 简称 Ｓ Ｄ 是 一 种能 够清 除 Ｏ ） 体 内超氧 自由基的金属酶 ， 医学 上具 有很高药 用 在
为 了使 Ｓ Ｄ与其 它杂蛋 白有效地分离 ， Ｏ 色谱条 件的选择应遵循三个原则 ： 酶的活性 回收率 高 ， 力 活 分布集 中和分辨能力强 。 据这三个标准 ， 们分别 根 我 选择 了固定相 、 流动相和洗脱方法 。
谱纯化后的Ｓ Ｄ达到电泳均一性。由于Ｓ Ｄ由两 Ｏ Ｏ 个亚基组成， 因此整个Ｓ Ｄ的分子量为 ３ ４６ － Ｏ ２ ｄｌ ３ ａ
ｔｎ这个值与我们用 尺寸排阻色谱 法测定的分 子量 ｏ，
３ １３ ｔ ３ ｄｌｎ比较一致。为了进一步检查精制后 １ ａｏ
Ｓ Ｄ的纯 度， Ｏ 将弱 阴离子 交换 柱后 收 集 的 Ｓ Ｄ 馏 Ｏ 分再用尺寸排阻色谱法离析 ， 仅显示 一条 Ｓ Ｄ活性 Ｏ
４９， ．５为了使 Ｓ Ｄ变为能与固定相交换的带电阴离 Ｏ 子， 流动相的ｐ Ｈ至少应高于Ｐ 一个单位。 Ｉ 考虑到硅 胶基质在过高ｐ Ｈ的溶失， 流动相ｐ Ｈ应控制在６ ～ ８ 狭窄范围内。图 ３ 表示Ｓ Ｄ回收率与流动相ｐ Ｏ Ｈ
的关系 。 由图 ３ 可看 出， 在试验的 ｐ 区间 ， ｐ Ｈ 随 Ｈ的 增加 ， 白质阴 离子化 程度增 大 ， 蛋 交换 能力增强 ， 在
新鲜牛血→溶血→除血红蛋 白→丙酮沉淀→高 效弱阴离子交换色谱→透析→浓缩→冷冻干燥 。 利用该 法在 室温下从 牛血 中提 取 Ｓ Ｄ各 步纯 Ｏ
化效率见表２ 。
速为１２ Ｌｍｎ Ｓ Ｄ活性回收率最大， ．ｍ ／ｉ时，Ｏ 此后随
流速 的增加而回收率却减少 。 ３２ 纯化结果的评价 ．
新建立的丙酮沉淀－ 高效液相色谱法提取Ｓ Ｄ Ｏ
３１１ 固定相选择 为了选择适宜的固定相， ．． 分别
用弱阴离子交 换柱 （ｈｍ Ｐｃ ， Ｘ １、 寸排 阻 Ｓｉ －ａｋＷＡ － 尺 柱 （ｈ －ａｋ Ｄｏ ３０ ｍ Ｓ ｉ Ｐｃ ｉ－０ ２０ ｍ ７９ｍ ｉ ． 、 ｍ ｌ ５ ． ｍ ｄ ）强 ．
３ 结果与讨论
３１ 色谱分离亲件 的选择 ．
级结 构有关 。已知 Ｓ Ｄ是 由 ３２ 氨基 酸分子 组 Ｏ ０个 成 ， 中仅含两个在 ２０ｍ 处可吸光 的芳香族 氨基 其 ８ｎ 酸残基即酪氨酸 ， 而无色氨酸 。 蛋 白质在色谱柱上 的活力分散是生物大 分子色 谱分离 中常遇到 的一种 现象 ， 因尚不清楚 。 其原 可能 由于 固定 相的多 点结合 引起色 谱峰分 裂 ， 也许 由于 蛋 白质构象的微小变化 和寡聚体的形成造成保 留值 的差异 ， 或者 由于蛋 白质色谱 过 程的热 力学和 动力 学因素产生 ， 些问题有待进一步研 究 。 这 ｐ 的选 择 ： Ｈ 牛血 Ｃ Ｚ －Ｏ 的 等 电 点 Ｐ 为 ｕ ｎＳ Ｄ Ｉ
利用高效弱阴离子交换色谱法纯化超氧化物歧化酶
郑
提要
莹
北京 １０８ ０００
周信基
李华儒 ＊
７０６ ） １０ ９
（ 中科院化工冶金研究所
（ 西北大学化工系 西 安
利用高效弱阴离子交换色谱法简化了超氧化物歧化 酶 Ｓ Ｄ 的纯化手续 。 Ｏ ） 在丙酮沉淀后 ， 仅用一步色谱
分 离就能使来自 牛血的Ｃ ｎ Ｏ ｕＺ－ Ｄ达到电泳纯， 性回收 Ｓ 活 率为 ８． ， 活为 ７１Ｕ ｍ ６４ 比 ７１ ／ ｇ纯化 倍数提高至 ５ ２ 倍。 此外， 尽讨论了 详 色谱分离的条件。
１ ｏ／ Ｎ Ｃ－．２ ｌＬ ｒ ｐ ７ ） ③ ．ｍ ｌ Ｌ ａＩ ０ ｍ ／ Ｔ ｉ Ｈ ．６ ； ０ ｏ ｓ（ ０６ ｏ Ｌ Ｓｐ ７６作梯度洗脱试验。结果表 ．ｍ ｌ Ｐ （Ｈ ） ／ Ｂ ．
明， 用 体系③ ，Ｏ 不被保 留； 使 ＳＤ 用② ，Ｏ 与杂 蛋 ＳＤ 白分 不开而且 回收率 较低 ； 用① ， 活性 回收 率高 ， 分
交换色谱中的这种反常行为， 可能与固定相的多功
能性有关 。 事实上 ， 许多离子 交换 剂不仅具有离 子交 换能力 ， 也具有疏水性质 。 在低浓度盐中主要显示交 换作用 ， 当盐浓度增大到一定 程度 ， 水作用开始占 疏 支配地位 。此 时随盐浓度的增加 ， 疏水作用 增强 ， 蛋 白质 与固定相 结合更加牢固 ， 于是 回收率下 降。
的过程如下： 表 ２ 丙酮沉淀－ 高效弱阴离子交换色谱 Ｈ Ｗ Ｅ ＊ Ｐ ＡＣ
由表 ２ 出， 弱 阴离子交 换色 谱法具 有较 看 高效
软基 质色 谱法 纯化 Ｓ Ｄ 不仅 可提高 纯化 效率 ， Ｏ ， 而 且简化 了纯化手续 ， 缩短了纯化时 间。 前者活性 回收 率 为 ８．％ ， 键 操 作 仅 ３步 ， 制 一 步 仅 用 ６４ 关 精 ３ｍｎ ０ ｉ。后 者 回收率在 ４％ ０ ７ ％， ０ 操作至少 ５ ， 步 精制一步需 十几 小时［。该法的应 用 目前还仅限于 ５ ］ 分析规模 ， 级分离纯化还 有待进一步研究 。 制备 致谢 雷 闫盈、 粉艳 、 张 袁景凌 同志参 与 Ｓ Ｄ粗 品 Ｏ 制备 ， 常建华副 教授为 研究工作 提供疏 水柱和 强 阴 离子柱 ， 在此一并致 谢 。
高纯化效率， 总活性回收率为 ８．％， ６４ 最终产品比 活为７１Ｕ ｍ 蛋白， ７１ ／ｇ 纯化倍数提高至 ５． 倍。经 ２１
Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ －Ａ Ｅ电泳分析 ，Ｏ Ｓ Ｄ粗提液原 样在 电泳图上 有十一条谱带 ， 用高效 阴离 子色谱 纯化后 仅 有一条 分子量为 １ ２８ ｔ ６ ｄｌ ｎ的 Ｓ Ｄ亚基 （ １ ａｏ Ｏ 图略）表 明色 ，
参 考
文 献
１ Ｃ ｒ ＪＭ ， ｒ ｏ ｉ Ｉ Ｂｏ Ｃｈｍ ，９ ９ ２４ ６４ Ｍｃ ｏｄ Ｆ ｉ ｖｃ ．Ｊ ｌ ｅ １ ６ ；４ ：０ ９ ｄ ｈ ｉ
峰， 表明用该法纯化后的Ｓ Ｄ具有较高纯度。 Ｏ 将该法纯化结果与软基质其它纯化方法比较，
得到表 ３ 数据。 表３ 几 种纯化Ｓ Ｄ方法的比较 Ｏ
离效果也较好。 用体系③时，Ｏ Ｓ Ｄ之所以不被保留，
可能由于流动相中大量 Ｐ Ｏ 衡离子紧密结合 的缘故 。 与阴离子 交换剂上 抗
３１３ 洗脱方法 为了获得最佳分离效果和纯化 ．．
百度文库
效率 ， 本研究采用阶式梯度洗脱方式进行 冲洗 。 利用 流 动相 Ａ进行等浓度 洗脱 ，Ｏ Ｓ Ｄ不会 流 出； 利用 流 动相 Ｂ 即使 ００ｍ ｌ 的磷 酸缓 冲液也 会因离 子 ， ．２ ｏ／ Ｌ 强度过高而使 Ｓ Ｄ不被保 留。 Ｏ 如用图 １ 出的阶式 给 梯 度洗脱 ，Ｏ Ｓ Ｄ与其它杂 蛋 白得 到很好 分离 。图 ４ 表示梯度时间对活性 回收率 的影 响。 由图 ４ 可看 出， 梯度 时间为 ２ｍｎ时活性 回收率 最高 ， ０ｉ 梯度 时 间过 短或过长都会导致纯化效率 的下降 。在不 同流速 下 还 测定了酶的活性 回收率 ， 究 了流速对纯 化效率 研 的影响 ， 发现随流速的增加 ， 回收率增大 。当流 活性
血中的血红蛋白［， ３ 上清液用丙酮沉 淀， ］ 离心后 用水 溶解沉淀成 Ｓ Ｄ粗提液 。 Ｏ 在备有弱 阴离子交 换柱 的 高效 液相色谱仪 （Ｃ６ 型 ， 本 岛津） Ｌ－ Ａ 日 上按 图 １ 的 色谱条件进行分离。根据色谱 图收集 Ｓ Ｄ馏分 ， Ｏ 用 连苯 三酚 自氧化法 测定酶活［， ］ 并与 未过柱 样 品进 行 比较 ， 计算色谱后 酶的活性 回收率 。
３１２ 流动相的选择 流动相组成： ．． 由于该研究采
用阶式梯度 洗脱 ， 因此对流动相 Ａ和 Ｂ应分别 作 出 选 择 。为 了 选 择 合 适 的 流 动 相 Ａ， 们 分 别 用 我 ００ｍ ｌ Ｔ ｉ ｐ ７６ ，．２ ｏ Ｌ Ｓ ｐ ７６ ．２ ｏ／ ｒ （Ｈ ）００ｍ ｌ Ｐ （Ｈ ） Ｌ ｓ ． ／ Ｂ ． 和蒸馏水进行试验 ， 发现用前两种 溶剂 Ｓ Ｄ均 不保 Ｏ 留 ， 明二者 离子 强度过高 。而用 去离子 水作流 动 表
阴离子交换柱（ｈａ１ ｍ ４６ ｍ ｄ， Ｃ ｓ－ １０ ｍ ．ｍ ｉ ．自制） ０ ．
和疏水柱 （Ｊ １０ ３６ ０ｍｍ ４６ ｍ ｄ ， ．ｍ ｉ ． 自制） 同浓 ． 对 度 Ｓ Ｄ粗提液进行色谱试验 ， Ｏ 得到表 １ 的结果 。
＊ 通讯联系人 本又收稿 日 ：９４ １ 月 ３ 期 １９ 年 ０ ０日， 回 日 １９ 年 １ １ 修 期 ９５ 月 ０日
较慢。 为了简化纯化手续， 提高纯化效率， 缩短纯化 时间， 我们将丙酮沉淀法制备的Ｓ Ｄ粗提液， Ｏ 用硬
基 质 弱 阴离 子 交换 柱进 行 了 分 离 ， 得 高 纯 度 获 Ｓ Ｄ 活性 回收率得到很大提高 。 Ｏ ，
２ 实验部分 按照Ｔｕｈ ａｈ法用９％乙醇－ ｓｃｉ ｓｉ ｈ ５ 氯仿除去牛
达到基线分离， 但从生物大分子色谱分离的角度考
虑， 只要仔 细收集馏 分的有效部分 ， 仍可获得 满意结 果。 事实上 ， 收集馏分经活性测定在该柱 上几 乎无活 力 损 失 ， 纯 度 用 Ｓ ＳＰ Ｇ 分 析 达 到 电泳 级 。 而 Ｄ －Ａ Ｅ
Ｓ Ｄ在波长 ２０ｍ下较低的响应， Ｏ ８ｎ 显然与Ｓ Ｄ— Ｏ
ｐ ７６ Ｈ 达到最大回收率，Ｈ ０ ． ｐ ８ 以后由于固定相部 ． 分溶失， 回收率开始下降。因此 ｐ ７６ Ｈ 应是流动相 ．
酸度 的最佳选 择。
相， 不仅Ｓ Ｄ可以在柱上滞留， Ｏ 还可以除去部分杂
蛋白 。正因为蒸馏水具有这种优 良的洗脱特性和 廉 价 的来源 ， 故被选为 流动相 Ａ。 为了选择 流动相 Ｂ 我 们使用三种溶剂 体系 ： ， ① １ ｏ／ Ｎ Ｃ－．２ ｌＬ Ｂ （Ｈ ．６ ； ．ｍ ｌ Ｌ ａ Ｉ ０ ｍ ／ Ｐ Ｓ ｐ ７ ） ② ０ ｏ
价值， 可以治疗许多与超氧自由基相关的疾病， 尤其
对关节炎和类风湿关节炎有特殊疗效 。 此外 ， 还可以 抗辐射、 抗肿瘤和抗衰老 ， 是一种很有发展前途 的蛋 白药物。
自１６ 年Ｍｃｏｄ Ｆｉ ｖｈ 首次从牛血 ９９ Ｃｒ 和 ｒｏｉ ｄ ｃ
红细 胞分离 出 Ｓ Ｄ以来 ， 国科学 工作 者对 Ｓ Ｄ Ｏ 各 Ｏ 的深度纯化作了大量工作 ， 常用 的方法有 阴离子 交 换色谱法［ ， 色谱 法［ ２４ 疏水 ５ ］凝胶 过滤 色谱法［和 ］ 金属螯合亲和色谱法［等 。所有这些分离方法都 是 ７ ］ 用软基质材料作为色谱介质 ， 少使 用高效色 谱 而很 填料 。 软基质填料的缺点是纯化效率不高 ， 离速 度 分