利用高效弱阴离子交换色谱法纯化超氧化物歧化酶
猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳
1.SOD的提取
[1]取新鲜猪血20ml于50ml离心管，6000r/min，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，6000r/min，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，6000r/min，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。
[2]向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样500ul（样1）。然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/min，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，留样500ul（样2）。
b3= ×10× =112.414U/ml
样1、样2和样3的酶液总体积分别为V1=10.0 ml、V2=9.5 ml和V3=8.5 ml，故其酶总活性分别为：
c1=b1V1=304.873U/ml×10.0 ml=3048.276 U
c2=b2V2=173.103U/ml×9.5 ml=1644.483 U
总活性(U)＝单位活性×酶原液总体积
[4]蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）：
⑴标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：
试剂
试管编号
1
2
3
4
5
6
蛋白质标准液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。
其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。
本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。
1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。
常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。
-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。
-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。
2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。
常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。
-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。
-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。
3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。
常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。
-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。
4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。
常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。
高效阴离子交换色谱
高效阴离子交换色谱阴离子交换色谱是一种应用于水质净化、食品工业、生物工程、环境保护、医药卫生等领域的高效分离纯化技术。
在国外早已得到广泛应用，如美国、加拿大、日本、德国等均将其作为一种基础和常规分析方法应用于水质分析。
随着我国经济的发展，人民生活水平的提高，对食品、饮料、保健品、环境、能源及化学工业等部门的要求也越来越严格，而采用分析方法是获取信息的最有效手段。
目前使用的分析方法大多需要耗费大量的人力和财力，并且有时由于操作不当或不配合，还会造成不良的后果。
为此开发高效、快速、简便、准确的检测方法，是我国分析仪器行业的重要课题之一。
正离子交换色谱法一般是将含有大量正电荷的阳离子交换剂放在一个离子交换柱中，在流动相中加入一定量的去离子水，与含有一定负电荷的阴离子交换树脂进行反复多次的交换和洗脱，从而达到分离样品的目的。
它的基本原理与吸附柱色谱法基本相同，只是柱上的填充物由固体变为液体，并且选择性较差。
由于这种分析方法只考虑了各种离子的相对亲和力，因此无法区分混合离子，也不能识别离子之间的非特异性反应。
一般来说，正离子交换色谱法适用于分析含有阳离子的溶液，对于溶液中既有阳离子又有阴离子的混合离子，就无法使用该方法分离。
另外，如果离子交换树脂孔隙率过低或填料过少，将影响交换容量；相反，离子交换树脂孔隙率过高，则会降低流动相的渗透压，从而增大树脂对交换剂的负载量，甚至使树脂破碎失效。
此外，正离子交换色谱法虽然操作简便，但因其是在被测离子与交换树脂之间进行一次性吸附-解吸附过程，故灵敏度不高，而且对不同类型离子的选择性差别很大，即使是相同的离子，所得的响应值也是不相同的。
1、原理正离子交换色谱法以正离子交换树脂为固定相，离子交换树脂是带有功能基团的嵌段共聚物，具有良好的吸附性能，可以与水中的阳离子和阴离子进行交换。
通过改变功能基团的种类和数量来调节吸附性能。
树脂通过其功能基团可以吸附一定种类的离子，根据亲和力不同，树脂可以选择性地吸附特定离子。
超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定、同工酶电泳
超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳实验⼆猪⾎中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳⼀、实验原理超氧化物岐化酶SOD⼴泛存在于⽣物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的⾦属类酶。
它作为⽣物体内重要的⾃由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离⼦，在防御⽣物体氧化损伤⽅⾯起着重要作⽤。
SOD是⼀种酸性蛋⽩，对热、pH和蛋⽩酶的⽔解较⼀般酶稳定。
根据⾦属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见是(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中。
CuZn-S0D酶蛋⽩的分⼦量约为3.2×104，每个酶分⼦由2个亚基通过⾮共价键的疏⽔基相互作⽤缔合成⼆聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原⼦各⼀个，活性中⼼的核⼼是铜。
SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之⼀，可以直接清除过量的超氧⾃由基，阻⽌机体的过氧化，对机体有较⾼的防护作⽤及保健价值。
本实验采⽤有机溶剂沉淀法以新鲜猪⾎为原料，从中提取SOD硬进⾏纯化。
酶活⼒测定可⽤以下⽅法：黄嘌呤氧化酶法、细胞⾊素C法、肾上腺素⾃氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚⾃氧化法等。
⽽该实验SOD酶活性采⽤邻苯三酚⾃氧化法测定。
酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%时的酶量定义为⼀个活⼒单位。
SOD同⼯酶奠定采⽤不连续聚丙烯酰胺-的作⽤，因此，电泳分离SOD后，凝凝胶电泳技术分离鉴定。
⽤“负”显⾊法显⽰。
由于SOD能够抑制O2胶上⽆SOD处显⽰为蓝⾊，⼜SOD处为⽆⾊透明，由此可以鉴定SOD同⼯酶酶谱。
⼆、实验试剂与器材ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%⼄醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等以及752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离⼼机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术摘要通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。
跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。
实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力不断减小，比活力不断上升，总纯化倍数为1.87，活性得率为0.3768%。
一、前言超氧化物歧化酶(superoxide dsdismutase，SOD)是需氧化物中以超氧阴离子为底物的一种酶，广泛存在于各种生物中。
SOD不仅在生物体内对抗氧化、解毒起重要作用，也有延缓机体衰老、抗肿瘤及抗免疫性疾病等功能，因而受到极大关注。
SOD属于金属酶，其理化性质不仅取决于蛋白质部分，而且还取决于结合到活性部位的金属离子。
按照结合的不同金属离子，生物体中SOD有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD和Fe—sOD三种，但近几年发现低等生物中尚存在含Ni的SOD。
在已发现的酶中，超氧化物歧化酶(SOD)是需氧生物和耐氧生物的体内清除超氧化物自由基的酶超氧自由基在体内的过多积累将可能引发脂质过氧化损伤DNA，使脱水酶失活，使线粒体中的NADH脱氢酶NADH氧化酶磷酸腺苻酶(ATPase)失活，从而易引起生物体发疾病或衰老。
自从1968年McCord与Fridovich发现SOD及其催化超氧化物自由基歧化为O2与H2O以来，SOD一直以來被认为是生物体内最重要的抗氧化酶。
根据近10年的研究报告表明，SOD具有清除超氧化物自由基，防止其对机体直接或间接的损伤；使O2成为细胞内自由基的排污漕；调节机体内O 的水平；调节机体内NO水和催化反应产物H2O2等作用。
现在在日常生产应用中，多以动物血液中提取SOD。
但是动物血液中的疾病很多，价格也比较昂贵。
从植物中提取SOD就可以相应的解决上述问题，类似绿豆芽这种植物，其成本低廉，且SOD 的含量丰富，又无污染，将其大量应用于生产有着很好的发展前景。
离子交换层析(ion exchange chromatography)纯化超氧化物歧化酶
离子交换层析(ion exchange chromatography)纯化超氧化物歧化酶原理]本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质，在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白，进而除去杂蛋白。
实验中选用DE-32离子交换纤维素。
[试剂和器材]1、试剂（1）DE-32（2）缓冲液Ⅰ：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6）（1）缓冲液Ⅱ：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6）2、器材（1）层析柱(2.5cm × 25cm)（2）部分收集器（2）梯度洗脱仪（3）紫外分光光度计（4）试管、透析袋[方法和步骤]1、DEAE-纤维素的预处理：（1）称取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的烧杯中，室温放置30min，不时轻轻搅拌。
（2）将糊状物移入3号砂芯漏斗中，用蒸馏水淋洗。
如此重复，每加一次去离子水，浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液pH等于4即可（pH试纸试）。
（3）将糊状物移入烧杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不时轻轻搅拌，弃去上清液，依同法用0.5mol/L NaOH再处理一次。
（4）将交换剂移入3号砂芯漏斗中，反复用去离子水淋洗，直至洗涤液pH为8.0（可用pH试纸测试）。
（5）将DEAE-纤维素浸泡在150mL去离子水中。
用0.5mol/L 盐酸把pH 调至7.6，滴定可在pH计上进行，须使悬液最终pH在10min内无变化，然后抽滤。
（6）将上述滤块置于100毫升量筒中，加入75mL缓冲液I，慢慢搅混之后，静置20min，用倾斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液pH与缓冲液I几乎一致。
2、装柱（1）层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。
关上螺旋夹，柱内装入缓冲液I，微开螺旋夹。
让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。
超氧化物歧化酶活性的测定
超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内一种重要的抗氧化酶，它能够将有害的超氧自由基（superoxide radical, O2•⁻）转化为氧和过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2），从而防止细胞和组织受到氧化应激的损伤。
因此，超氧化物歧化酶活性的测定对于研究氧化应激与各种疾病的关系具有极大的重要性。
超氧化物歧化酶活性的测定方法有多种，以下主要介绍两种常用的方法：一、停止法停止法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，用发生超氧自由基的化学反应（如PMS-NADH系统）制造超氧气自由基以模拟体内超氧自由基的生成，观察并测定经超氧化物歧化酶处理后剩余的超氧自由基量的下降速率，通过计算算出SOD活性。
步骤：1、准备试剂：PMS（N-甲基-苯肼）溶液、NADH（辅酶Ⅰ）溶液、EDTA-Na2溶液、碳酸氢钠-硫酸溶液、紫外分光光度计。
2、制定反应液：取适量PMS溶液和NADH溶液加入缓冲液中，使最终浓度分别为100μM和780μM，混匀。
3、制备样品：用生理盐水或缓冲液将要测定的样品进行稀释，并在4℃下保存备用。
4、制备标准品：以SOD标准品（0-10U/mL）为浓度系列，每组分别加入50μL的样品和反应液，在37℃水浴中反应30min。
5、反应终止：以碳酸氢钠-硫酸溶液均匀混合停止反应。
6、测定吸光度：用紫外分光光度计测定反应液的吸光度，波长设置在340 nm。
7、计算超氧化物歧化酶活性：计算标准品的反应速率（Vx）和酶反应的反应速率（Vt），按照以下公式计算超氧化物歧化酶活性：SOD活性（U/mL）=（Vt–Vx）/Vx×标准品的酶活力二、降解法降解法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，将超氧自由基产生物质注入试管中，随着时间的推移，样品中的超氧自由基将越来越少。
超氧气自由基和非酶物质将通过电子色谱法被检测和测量。
1、制备反应液：将样品加入含有相应浓度的降解剂中，使反应液中超氧气自由基的浓度达到稳定状态。
超氧化物歧化酶的分离、纯化和活性测定
综合实验超氧化物歧化酶的分离、纯化实验背景超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD) 广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶，生物体内重要的自由基清除剂，防御生物体氧化损伤。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型：铜锌金属辅基(CuZn-SOD) ，蓝绿色，存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙；锰离子(Mn-SOD)，粉红色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，以及植物的叶绿体基质和类囊体膜上；Fe-S0D，黄色或黄褐色，存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
实验一超氧化物歧化酶的活性测定一、实验原理SOD的活力测定方法：化学法：黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，N BT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等；免疫法；等电点聚焦法；本实验采用邻苯三酚自氧化法邻苯三酚自氧化法：邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
二、试剂和器材1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
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表 １ 用不 同色谱柱时 Ｓ Ｄ的活性 回收率及活 力分布 Ｏ
流动相 浓度 ： 了考 察流动相浓度对 Ｓ Ｄ洗脱 为 Ｏ 效率 的影 响 ， 了不同盐浓度下 Ｓ Ｄ的活性 回收 测定 Ｏ 率（ ２。 图 由图 ２ 可看 出 ， Ｎ Ｃ 浓度增加 ， 随 ａｌ 交换平
衡移向有利于蛋白质解析的方向， 导致Ｓ Ｄ活性回 Ｏ
利用高效弱阴离子交换色谱法纯化超氧化物歧化酶
郑
提要
莹
北京 １０８ ０００
周信基
李华儒 ＊
７０６ ） １０ ９（Fra bibliotek中科院化工冶金研究所
（ 西北大学化工系 西 安
利用高效弱阴离子交换色谱法简化了超氧化物歧化 酶 Ｓ Ｄ 的纯化手续 。 Ｏ ） 在丙酮沉淀后 ， 仅用一步色谱
分 离就能使来自 牛血的Ｃ ｎ Ｏ ｕＺ－ Ｄ达到电泳纯， 性回收 Ｓ 活 率为 ８． ， 活为 ７１Ｕ ｍ ６４ 比 ７１ ／ ｇ纯化 倍数提高至 ５ ２ 倍。 此外， 尽讨论了 详 色谱分离的条件。
价值， 可以治疗许多与超氧自由基相关的疾病， 尤其
对关节炎和类风湿关节炎有特殊疗效 。 此外 ， 还可以 抗辐射、 抗肿瘤和抗衰老 ， 是一种很有发展前途 的蛋 白药物。
自１６ 年Ｍｃｏｄ Ｆｉ ｖｈ 首次从牛血 ９９ Ｃｒ 和 ｒｏｉ ｄ ｃ
红细 胞分离 出 Ｓ Ｄ以来 ， 国科学 工作 者对 Ｓ Ｄ Ｏ 各 Ｏ 的深度纯化作了大量工作 ， 常用 的方法有 阴离子 交 换色谱法［ ， 色谱 法［ ２４ 疏水 ５ ］凝胶 过滤 色谱法［和 ］ 金属螯合亲和色谱法［等 。所有这些分离方法都 是 ７ ］ 用软基质材料作为色谱介质 ， 少使 用高效色 谱 而很 填料 。 软基质填料的缺点是纯化效率不高 ， 离速 度 分
交换色谱中的这种反常行为， 可能与固定相的多功
能性有关 。 事实上 ， 许多离子 交换 剂不仅具有离 子交 换能力 ， 也具有疏水性质 。 在低浓度盐中主要显示交 换作用 ， 当盐浓度增大到一定 程度 ， 水作用开始占 疏 支配地位 。此 时随盐浓度的增加 ， 疏水作用 增强 ， 蛋 白质 与固定相 结合更加牢固 ， 于是 回收率下 降。
级结 构有关 。已知 Ｓ Ｄ是 由 ３２ 氨基 酸分子 组 Ｏ ０个 成 ， 中仅含两个在 ２０ｍ 处可吸光 的芳香族 氨基 其 ８ｎ 酸残基即酪氨酸 ， 而无色氨酸 。 蛋 白质在色谱柱上 的活力分散是生物大 分子色 谱分离 中常遇到 的一种 现象 ， 因尚不清楚 。 其原 可能 由于 固定 相的多 点结合 引起色 谱峰分 裂 ， 也许 由于 蛋 白质构象的微小变化 和寡聚体的形成造成保 留值 的差异 ， 或者 由于蛋 白质色谱 过 程的热 力学和 动力 学因素产生 ， 些问题有待进一步研 究 。 这 ｐ 的选 择 ： Ｈ 牛血 Ｃ Ｚ －Ｏ 的 等 电 点 Ｐ 为 ｕ ｎＳ Ｄ Ｉ
４９， ．５为了使 Ｓ Ｄ变为能与固定相交换的带电阴离 Ｏ 子， 流动相的ｐ Ｈ至少应高于Ｐ 一个单位。 Ｉ 考虑到硅 胶基质在过高ｐ Ｈ的溶失， 流动相ｐ Ｈ应控制在６ ～ ８ 狭窄范围内。图 ３ 表示Ｓ Ｄ回收率与流动相ｐ Ｏ Ｈ
的关系 。 由图 ３ 可看 出， 在试验的 ｐ 区间 ， ｐ Ｈ 随 Ｈ的 增加 ， 白质阴 离子化 程度增 大 ， 蛋 交换 能力增强 ， 在
ｐ ７６ Ｈ 达到最大回收率，Ｈ ０ ． ｐ ８ 以后由于固定相部 ． 分溶失， 回收率开始下降。因此 ｐ ７６ Ｈ 应是流动相 ．
酸度 的最佳选 择。
相， 不仅Ｓ Ｄ可以在柱上滞留， Ｏ 还可以除去部分杂
蛋白 。正因为蒸馏水具有这种优 良的洗脱特性和 廉 价 的来源 ， 故被选为 流动相 Ａ。 为了选择 流动相 Ｂ 我 们使用三种溶剂 体系 ： ， ① １ ｏ／ Ｎ Ｃ－．２ ｌＬ Ｂ （Ｈ ．６ ； ．ｍ ｌ Ｌ ａ Ｉ ０ ｍ ／ Ｐ Ｓ ｐ ７ ） ② ０ ｏ
离效果也较好。 用体系③时，Ｏ Ｓ Ｄ之所以不被保留，
可能由于流动相中大量 Ｐ Ｏ 衡离子紧密结合 的缘故 。 与阴离子 交换剂上 抗
３１３ 洗脱方法 为了获得最佳分离效果和纯化 ．．
效率 ， 本研究采用阶式梯度洗脱方式进行 冲洗 。 利用 流 动相 Ａ进行等浓度 洗脱 ，Ｏ Ｓ Ｄ不会 流 出； 利用 流 动相 Ｂ 即使 ００ｍ ｌ 的磷 酸缓 冲液也 会因离 子 ， ．２ ｏ／ Ｌ 强度过高而使 Ｓ Ｄ不被保 留。 Ｏ 如用图 １ 出的阶式 给 梯 度洗脱 ，Ｏ Ｓ Ｄ与其它杂 蛋 白得 到很好 分离 。图 ４ 表示梯度时间对活性 回收率 的影 响。 由图 ４ 可看 出， 梯度 时间为 ２ｍｎ时活性 回收率 最高 ， ０ｉ 梯度 时 间过 短或过长都会导致纯化效率 的下降 。在不 同流速 下 还 测定了酶的活性 回收率 ， 究 了流速对纯 化效率 研 的影响 ， 发现随流速的增加 ， 回收率增大 。当流 活性
达到基线分离， 但从生物大分子色谱分离的角度考
虑， 只要仔 细收集馏 分的有效部分 ， 仍可获得 满意结 果。 事实上 ， 收集馏分经活性测定在该柱 上几 乎无活 力 损 失 ， 纯 度 用 Ｓ ＳＰ Ｇ 分 析 达 到 电泳 级 。 而 Ｄ －Ａ Ｅ
Ｓ Ｄ在波长 ２０ｍ下较低的响应， Ｏ ８ｎ 显然与Ｓ Ｄ— Ｏ
的过程如下： 表 ２ 丙酮沉淀－ 高效弱阴离子交换色谱 Ｈ Ｗ Ｅ ＊ Ｐ ＡＣ
由表 ２ 出， 弱 阴离子交 换色 谱法具 有较 看 高效
软基 质色 谱法 纯化 Ｓ Ｄ 不仅 可提高 纯化 效率 ， Ｏ ， 而 且简化 了纯化手续 ， 缩短了纯化时 间。 前者活性 回收 率 为 ８．％ ， 键 操 作 仅 ３步 ， 制 一 步 仅 用 ６４ 关 精 ３ｍｎ ０ ｉ。后 者 回收率在 ４％ ０ ７ ％， ０ 操作至少 ５ ， 步 精制一步需 十几 小时［。该法的应 用 目前还仅限于 ５ ］ 分析规模 ， 级分离纯化还 有待进一步研究 。 制备 致谢 雷 闫盈、 粉艳 、 张 袁景凌 同志参 与 Ｓ Ｄ粗 品 Ｏ 制备 ， 常建华副 教授为 研究工作 提供疏 水柱和 强 阴 离子柱 ， 在此一并致 谢 。
１ ｏ／ Ｎ Ｃ－．２ ｌＬ ｒ ｐ ７ ） ③ ．ｍ ｌ Ｌ ａＩ ０ ｍ ／ Ｔ ｉ Ｈ ．６ ； ０ ｏ ｓ（ ０６ ｏ Ｌ Ｓｐ ７６作梯度洗脱试验。结果表 ．ｍ ｌ Ｐ （Ｈ ） ／ Ｂ ．
明， 用 体系③ ，Ｏ 不被保 留； 使 ＳＤ 用② ，Ｏ 与杂 蛋 ＳＤ 白分 不开而且 回收率 较低 ； 用① ， 活性 回收 率高 ， 分
较慢。 为了简化纯化手续， 提高纯化效率， 缩短纯化 时间， 我们将丙酮沉淀法制备的Ｓ Ｄ粗提液， Ｏ 用硬
基 质 弱 阴离 子 交换 柱进 行 了 分 离 ， 得 高 纯 度 获 Ｓ Ｄ 活性 回收率得到很大提高 。 Ｏ ，
２ 实验部分 按照Ｔｕｈ ａｈ法用９％乙醇－ ｓｃｉ ｓｉ ｈ ５ 氯仿除去牛
３１１ 固定相选择 为了选择适宜的固定相， ．． 分别
用弱阴离子交 换柱 （ｈｍ Ｐｃ ， Ｘ １、 寸排 阻 Ｓｉ －ａｋＷＡ － 尺 柱 （ｈ －ａｋ Ｄｏ ３０ ｍ Ｓ ｉ Ｐｃ ｉ－０ ２０ ｍ ７９ｍ ｉ ． 、 ｍ ｌ ５ ． ｍ ｄ ）强 ．
３ 结果与讨论
３１ 色谱分离亲件 的选择 ．
谱纯化后的Ｓ Ｄ达到电泳均一性。由于Ｓ Ｄ由两 Ｏ Ｏ 个亚基组成， 因此整个Ｓ Ｄ的分子量为 ３ ４６ － Ｏ ２ ｄｌ ３ ａ
ｔｎ这个值与我们用 尺寸排阻色谱 法测定的分 子量 ｏ，
３ １３ ｔ ３ ｄｌｎ比较一致。为了进一步检查精制后 １ ａｏ
Ｓ Ｄ的纯 度， Ｏ 将弱 阴离子 交换 柱后 收 集 的 Ｓ Ｄ 馏 Ｏ 分再用尺寸排阻色谱法离析 ， 仅显示 一条 Ｓ Ｄ活性 Ｏ
色谱 条件： 谱柱 为弱 阴离子 交换 柱 Ｓｉ－ａ ， 色 ｈ Ｐｃ ｍ ｋ
ＷＡ －， ０ Ｘ １ ５ｍｍ ４６ ｍ ． 流 动 相 Ａ Ｈ Ｏ， ．ｍ ｉ ．ｄ ．２ Ｂ １ ｏ／ Ｎ Ｃ－．２ ｏ／ Ｎ ２ Ｐ ４ Ｈ ６ ； ．．ｍ ｌ ａ Ｉ ０ｍ ｌ ａＨ Ｏ （ ７ ）阶式 Ｌ ０ Ｌ Ｐ ． 梯度洗脱 ６ ｉ ＝０ ６ ２ｍｎ ｍｎＢ ６ ｉ Ｂ从 到 １０ 流 ０ ％； 速 ： ．ｍ ／ ｉ患 测 器 ： １２ Ｌ ｍｎ 检 ＵＶ ＝ ２０ｍ ； 样 ： ８ｎ 进 ５ ０Ｌ Ｄ粗提 液。 Ｓ Ｏ
参 考
文 献
１ Ｃ ｒ ＪＭ ， ｒ ｏ ｉ Ｉ Ｂｏ Ｃｈｍ ，９ ９ ２４ ６４ Ｍｃ ｏｄ Ｆ ｉ ｖｃ ．Ｊ ｌ ｅ １ ６ ；４ ：０ ９ ｄ ｈ ｉ
峰， 表明用该法纯化后的Ｓ Ｄ具有较高纯度。 Ｏ 将该法纯化结果与软基质其它纯化方法比较，
得到表 ３ 数据。 表３ 几 种纯化Ｓ Ｄ方法的比较 Ｏ
３１２ 流动相的选择 流动相组成： ．． 由于该研究采
用阶式梯度 洗脱 ， 因此对流动相 Ａ和 Ｂ应分别 作 出 选 择 。为 了 选 择 合 适 的 流 动 相 Ａ， 们 分 别 用 我 ００ｍ ｌ Ｔ ｉ ｐ ７６ ，．２ ｏ Ｌ Ｓ ｐ ７６ ．２ ｏ／ ｒ （Ｈ ）００ｍ ｌ Ｐ （Ｈ ） Ｌ ｓ ． ／ Ｂ ． 和蒸馏水进行试验 ， 发现用前两种 溶剂 Ｓ Ｄ均 不保 Ｏ 留 ， 明二者 离子 强度过高 。而用 去离子 水作流 动 表
收 率增大 。当 Ｎ Ｃ 浓度增 加到 １ ｏ／ ａｌ ．ｍ ｌ Ｌ时 ，Ｏ ＳＤ 活性 回收率最高 ， 超过此值 回收率 开始下降 。 在离子 从 活性 回收率看 ， 水柱 回收率最低 ， ７％ ， 疏 为 ９ 其它三种柱型均在 ９％以上 。 ３ 从分离情 况和活力分 布来看 ， 排阻柱 、 尺寸 疏水柱 和强阴离子交换 柱分离 不 完 全 而 且 活力 分 散， 弱 阴 离 子 交 换 柱 在 用 １．８ ｉ得 到一个活力集 中的尖锐 峰。 ３３ｍｎ 该峰虽然未
关键词 高效阴离子交换色谱法 ， 超氧化物歧化酶 ， 牛血
１ 前言
超 氧化物歧化酶 （ 简称 Ｓ Ｄ 是 一 种能 够清 除 Ｏ ） 体 内超氧 自由基的金属酶 ， 医学 上具 有很高药 用 在