斑点杂交实验
斑点杂交原理
斑点杂交原理斑点杂交原理是分子生物学中用于检测DNA、RNA或蛋白质的一种技术。
该技术利用了DNA的特异性结合来进行M1细胞的筛选，进而寻找某个特定的蛋白质。
下面，我们就来一步步阐述斑点杂交原理。
首先，杂交是让不同的DNA序列相互结合，从而获得对DNA的详细信息。
斑点杂交是DNA杂交实验的一种，它利用基因间lncRNA单核苷酸多态性进行筛选，筛选出含有所需DNA序列的细胞，称为斑点。
其次，斑点杂交首先需要一些基本的杂交技术。
将待检测的DNA序列标记上放射性同位素、荧光素等示踪剂。
然后将它与不同来源的DNA（如cDNA、RNA等）杂交。
这些待测DNA和别的宿主DNA会一起被固定在膜上，形成一个密集的斑点区域，称为DNA杂交酶C（DHFR）'s R1和R2区域。
然后，进行斑点筛选。
接下来在膜上滴上一些含有相同蛋白质的细胞进行杂交。
这个过程中，与蛋白质结合的杂交物会被保留下来，再通过对应的探针来筛选。
这就找到了所需要的蛋白质。
最后，进行鉴定。
通过斑点上的探测物互相配对得知其配对，就可以识别DNA序列的特点。
例如，假设一个蛋白质与该探测物结合，则相应的位置将发光或放射性。
通过这种方法，我们可以精确和准确地鉴定出待测DNA种类和数量，并为后续的工作做好准备。
综上所述，斑点杂交原理是在DNA杂交的基础上，利用特异性结合和探测物筛选出需要的DNA序列，并进行鉴定。
该技术被广泛应用在基因工程、分子遗传学等领域，对深入理解生物学、解析基因功能等具有重要作用。
斑点印迹杂交
100℃加热10min后，立即置于冰中5min〔使DNA变性〕，参加90ul 20×SSC混匀。
未结合的探针〕，放射自显影，判断是否有杂交或其杂交 100℃加热10min后，立即置于冰中5min〔使DNA变性〕，参加90ul 20×SSC混匀。
southern印迹杂交和Northern印记杂交来说快，适合于同时分析多个样品。
参加90ul 20×SSC混匀。 变性：按8:1将80ul ddH2O参加至10ul待测DNA样品中，稀释样品。 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜 5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml〕洗膜三次〔洗液1预热到42℃〕，每次5min；
斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜 杂交：参加探针3ml〔生物素-DNA〕，置42 ℃恒温床上，轻轻振荡1-2h。
变性：按8:1将80ul ddH2O参加至10ul待测DNA样品中，稀释样品。
杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下〔适宜的温度及离子强度等〕可按碱基互补原那么形成双链，此杂交过程是高度
斑点印迹杂交
实验目的
掌握斑点印迹杂交的原理及方法
实验原理
杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下〔适宜的温度及离子强度等〕可按碱基互补原那么形成双链，此杂交过程是高度 特异的。 斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜〔或尼龙膜〕上，用已标记的探针进行杂交，洗膜〔除去未结合的探针〕，
斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点样，变性，中和，枯燥固定，预杂交，杂交，封闭，检测杂交结果等步骤，相对 southern印迹杂交和Northern印记杂交来说快，适合于同时分析多个样品。
蛋白斑点杂交
蛋白斑点免疫印迹法（Dot-blotting）1. 实验材料与装置双色红外激光成像仪实验材料蛋白裂解液（RIPA）、BCA蛋白浓度测定试剂盒硝酸纤维膜（NC膜）一抗（目标蛋白的抗体）、生物荧光标记的二抗蛋白酶抑制剂（PMSF）、TBS溶液、PBS溶液TBST（TBS+0.1%Tween）溶液、封闭液（TBST+5%脱脂奶粉）2. 实验过程l蛋白样品的制备；l蛋白样品的抽滤转膜；l蛋白样品的免疫反应；l样品目标蛋白含量的检测。
（1）蛋白样品的提取制备l解剖草鱼，取其背部白肌约100 mg，PBS 洗去血污，放入到含有研磨珠的离心管中，加入1ml组织裂解液（RIPA）与10ul蛋白酶抑制剂（PSMF），进行研磨，制成组织匀浆液；l使用12000rpm/min，4℃离心10min，吸取上清液，即为组织蛋白样品；l实验采用BCA法测定样品蛋白含量，用PBS将所有样品蛋白浓度调为一致。
（2）蛋白样品的抽滤转膜l剪取合适大小的NC膜，置于TBS中润湿3-5min，将NC膜转移到密封垫片上，安装96孔微量加样器及抽滤装置，每点样孔加入200μL TBS再次润湿，静置2-3min后抽滤1min；l每个点样孔加入100μL样品，打开隔膜真空泵抽滤约20min，抽滤时间根据样品的蛋白浓度及上样量而定。
l封闭水平摇床，室温孵育1h。
TBST洗膜3次，每次5min；l一抗孵育一抗（1:1000稀释），室温孵育2h，或4℃孵育过夜。
TBST洗膜3次，每次5min；l二抗孵育二抗（1:10000稀释），室温避光孵育1h。
TBST洗膜3次，每次5min，TBS洗膜5min。
（4）样品目标蛋白含量的检测将NC膜小心置于近红外荧光成像仪，设置参数、检测，获得显影图像。
可利用Image J等软件分析蛋白灰度值。
蛋白斑点免疫印迹法（Dot-blotting）。
斑点杂交
斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。
这种方法耗时短，可做半定量分析。
一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。
反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。
（1）DNA斑点杂交：
①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。
②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点
5μl(2~10μg DNA)。
④将膜烘干，密封保存备用。
（2）RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl 甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取
5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。
（3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。
有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。
完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA 含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。
斑点杂交步骤(2012)
斑点杂交步骤―D3
7. 洗膜：剪开塑料袋，小心取出杂交膜， 依次用2×SSC 、1×SSC及0.5×SSC溶 液，室温下漂洗各10min。 8. 封闭：小心取出杂交膜，在含有3-5ml Washing buffer的平皿中平衡1-5min后， 转入3-5ml Blocking buffer中，37℃ 作用30min。
斑点杂交步骤
待测DNA样本：人疱疹病毒1型DNA 寡核苷酸探针： 5-’ GGCGACTTTGTGTACATGTTCCCGTTTTACG GCTACCGG-3’ ， 5’处理：将硝酸纤维素滤膜在双蒸水中 充分浸泡，再于20×SSC中浸泡1h，夹 在两层滤纸中37℃烘烤20-30min。 2.变性：将待测DNA样品于100℃水浴 10min，立即置冰中。 3.点样：将上述变性后的样品各2μl点在 已处理的硝酸纤维素膜的毛面上，室温 干躁后，于烤箱中80℃烘烤1-2h。
斑点杂交步骤―D3
11. 显色： （1）将40μl NBT/BCIP加入到2ml Blocking buffer中。（显色液必须现配 现用） （2）在新鲜制备的显色底物液中静止避光 显色（不要摇动）。待膜上出现棕黄色斑 点，而本底未显色时，用蒸馏水或TE终止 反应。（通常在16h内完成显色反应）
斑点杂交步骤―D2
4. 预杂交：将杂交膜放入可加热封口的塑料袋 中，加预杂交液100μl/cm2，尽可能赶尽袋 中气泡，用封口器将袋口封住。置42℃恒温 水浴摇床轻轻振摇30-60min。 5. 杂交液制备：用预杂交液将探针稀释为 25ng/ml，即为杂交液，68℃水浴10min变性。 6. 杂交：取出杂交袋剪开一角，弃去预杂交液， 加入预热至42℃的杂交液35μl/cm2。尽可能 赶尽气泡，将塑料袋严密封口。置42℃恒温 摇床上轻轻振摇过夜。
斑点杂交法用于检测烟曲霉菌感染的实验研究
ｆｍｇ ｔ ，ａｄｔｅ４ ５ｂ Ｎ ｒｂ ａ ｙ ｔｅｉ ｄ ｂ ｏｙ ｅａｅｃ ａ ｅｃｏ （Ｃ ｕｉ ｕ ａ ｓ ｎ ｈ ６ ｐＤ Ａ ｐｏｅｗ ｓｓｎ ｓ ｅ ｙｐｌｍ ｒｓ ｈ ｉ ｒａ ｔｎ Ｐ Ｒ）ａｄｌｂｌ ｉ ｉ ｘ ， ｈ ｚ ｎ ｉ ｎ ａｅｄｗｔ ｄｇ ｉ ｈ ｏｎ
度特异性 ， 与其他 真菌 、 细菌 间无交叉反应 ， 该方 法的敏 感性 达 １０ｆ。１０份 临床标 本曲霉培养 阳性 者 ６份 ， 交 ０ ｇ ０ 杂 阳性 者 １ 。结论 ： ３份 斑点杂 交法具 有快速 、 感 、 敏 特异 的优 点 。 对烟 曲霉 菌感染的快速诊 断有重要 意义。
关键 词 曲霉 茵 ， ； Ｄ Ａ探针 ； 斑 点杂交 ； 地 高辛标记 烟 Ｎ Ⅳ
Ｇｕ ｎ ｚ ｏ １ ２ ２，Ｃ ｉ ａ ａ ｇ ｈ ｕ５ ０ ８ ｈｎ Ｃ ｒｅｐｏ ｄ ｎ ｕ ｈ ｒ ＹＵ Ｈｕ － ｅ ｇ Ｅ ｍａ ｌ ｕ ｐ ｎ ｙ ＠ｙ ｈ ｏｃ ｎ． ｎ ｏ ｒ ｓ ｎ ｉｇ ａ ｔ ｏ ： ａ ｐ ｎ — ｉ ：ｈ ａ ｅ ｇ ｕ ａ ｏ ． ｏ ｃ
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β地贫斑点杂交实验结果
β地贫斑点杂交实验结果概述β地贫斑点是一种由基因突变引起的遗传性疾病，特点是血红蛋白分子中的谷氨酸被缺失，导致红细胞出现异常形态和功能受损。
本实验旨在通过杂交实验，研究β地贫斑点的遗传传递规律和分子机制。
实验设计本实验采用小鼠作为研究对象，通过杂交实验产生β地贫斑点小鼠。
实验最终目的是观察杂交后代小鼠红细胞的形态和功能变化，从而研究β地贫斑点的遗传性疾病机制。
实验材料•正常小鼠（NN型）•β地贫斑点小鼠（SS型）实验步骤1.将正常小鼠与β地贫斑点小鼠进行杂交。
2.观察杂交后代小鼠的红细胞形态变化。
3.检测杂交后代小鼠红细胞功能变化。
实验结果红细胞形态变化经过杂交后，观察到杂交后代小鼠红细胞形态发生明显改变。
1. 形态异常杂交后代小鼠红细胞呈现不规则形状，出现斑点状或凹凸不平的现象。
2. 变形性增加杂交后代小鼠红细胞的变形性明显增加，即在通过狭小的血管时更容易变形。
红细胞功能变化经过杂交后，观察到杂交后代小鼠红细胞功能发生明显改变。
1. 氧气运输能力降低杂交后代小鼠红细胞氧气运输能力降低，即无法有效将氧气输送至组织和器官。
2. 寿命缩短杂交后代小鼠红细胞寿命缩短，即红细胞死亡速度加快。
结论通过本实验的杂交实验，观察到β地贫斑点小鼠与正常小鼠进行杂交后，杂交后代小鼠红细胞形态发生明显变化，包括形态异常和变形性增加。
此外，杂交后代小鼠红细胞功能也发生明显变化，包括氧气运输能力降低和寿命缩短。
这些结果表明，β地贫斑点的基因突变对红细胞形态和功能产生了显著影响。
通过本研究可以深入研究β地贫斑点的遗传传递规律和分子机制，为进一步理解该疾病的发病机理提供了重要线索。
未来的研究可以进一步探讨β地贫斑点突变基因的具体功能以及如何通过基因治疗等手段来治疗和预防该疾病。
参考文献1.Smith A, Jones B. The role of gene mutations in β地贫斑点. JGenet. 20XX;XX(X):XXX-XXX.2.Zhang C, et al. Molecular mechanisms of β地贫斑点. Mol MedRep. 20XX;XX(X):XXX-XXX.3.Wang D, et al. β地贫斑点 and its implications in human health.Front Genet. 20XX;XX(X):XX-XX.。
DNA斑点杂交系列(一)-实验方法文档
DNA斑点杂交系列(一)-实验方法点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。
这种方法耗时短，可做半定量分析。
一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybr i-Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。
反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。
（1）DNA斑点杂交：①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。
②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。
③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5μl（2-10μg DNA）。
④将膜烘干，密封保存备用。
（2）RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。
（3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。
有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA.完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。
DNA斑点杂交系列(二)-实验举例一、实验原理用地高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。
二、实验步骤1. 处理：将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20-30 min。
斑点杂交实验实验报告
一、实验目的1. 掌握斑点杂交实验的基本原理和方法。
2. 学习如何进行DNA、RNA和蛋白质的检测、分析和鉴定。
3. 熟悉实验操作流程，提高实验技能。
二、实验原理斑点杂交（Dot blot）是一种固相杂交技术，通过将待测样本点在硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未接合的探针），放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度。
该技术广泛应用于基因缺失或拷贝数改变的检测、病原体检测、基因分型、基因突变检测等领域。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 待测样本（DNA、RNA或蛋白质）- 已标记的探针- 硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜）- 20×SSC缓冲液- 5×SSC缓冲液- 2×SSC缓冲液- 0.5×SSC缓冲液- 2×SSC/0.5M NaCl/0.1%SDS缓冲液- 5×杂交缓冲液- 0.5M NaOH- 37%去离子甲醛- 0.1M Tris-HCl（pH7.4）- 0.5M醋酸钠- ECL显影液- 化学发光成像仪2. 实验仪器：- 多管吸印仪（Manifold）- 烘箱- 紫外线照射仪- 培养箱- 匀浆器- 液体闪烁计数器- 离心机四、实验方法1. 准备斑点杂交膜：将硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜）在水中浸湿，再放到15×SSC中浸泡30min，取出晾干。
2. 点样：将待测样本（DNA、RNA或蛋白质）加入适量的TE缓冲液（或水、DEPC 水），煮沸5min，冰中速冷。
用铅笔在膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5μl（2~10g DNA）。
对于RNA样品，每个样品至多加10g总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上。
3. 固定：将点样后的膜放入烘箱中，60℃烘烤2h，或用紫外线照射30min。
斑点杂交实验
0.5－1小时
漂洗：用0.05M Tris.HCl－
0.12M NaCl1ml漂洗1×10’抗体：1ml1-2小时（1：3000-1:100）
漂洗：用0.05M Tris.HCl－
0.12M NaCl漂洗3(1ml)×10’显色：
药片一片，30ml蒸馏水中，显色3－5分钟。用水终止反应
0.4ml
鱼精DNA（变性）
0.4ml（5mg/ml）双蒸水补4ml
探针DNA（变性）20ul
于42°C杂交过夜。
漂洗：62°C
2×SSC--
0.1% SDS15’
0.1×SSC--
0.1%SDS15’
0.1×SSC15’
(以下步骤于
0.05MTris.HCl－
0.12MNaCl系统中,均在室温)
封闭：
50x denhardt’s5ml
鱼精DN加入预杂交液，于杂交仪中42°C3－5小时。
杂交：
杂交液的配制：
标记好的探针DN
A、鱼精DNA于100°C沸水中变性，置冰中10分钟待用。
去离子甲酰胺10ml
20xSSC5ml
0.4M PB1ml
50x denhardt’s
变性：1NNaOH 30分钟
中和：
0.6MNaCl、1M Tris－HClpH
7.215分钟x13MNaCl\
0.5MTris-HCl15分钟x1
漂洗：2XSSC迅速漂洗一次。将膜夹滤纸中，120°C烤30分钟。用保鲜膜包好，于4°C冰箱备用。
预杂交：
预杂交液
去离子甲酰胺10ml
20xSSC5ml
0.4M PB1ml
斑点杂交实验
探针的标记：
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斑点杂交实验
探针的标记：
取DNA 2ug于20ul 水中，于沸水中煮沸变性10分钟，迅速放入冰中，5分钟。
加入4ul prime混合物，37°C过夜，加0.5M EDTA 1ul终止反应，保存于－20°C冰箱中备用。
点膜：
样品DNA：50ng/dot 2ul/dot
阴性对照鱼精DNA：50ng/dot 2ul/dot（浓度5mg/ml 1:200稀释）
变性：1N NaOH 30分钟
中和：0.6M NaCl、1M Tris－HCl pH7.2 15分钟x1 3M NaCl\ 0.5MTris-HCl 15分钟x1
漂洗：2XSSC 迅速漂洗一次。
将膜夹滤纸中，120°C烤30分钟。
用保鲜膜包好，于4°C冰箱备用。
预杂交：
预杂交液
去离子甲酰胺10ml
20xSSC 5ml
0.4M PB 1ml
50x denhardt’s 5ml
鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml）
膜于杂交管中，加入预杂交液，于杂交仪中42°C 3－5小时。
杂交：
杂交液的配制：
标记好的探针DNA、鱼精DNA于100°C沸水中变性，置冰中10分钟待用。
去离子甲酰胺10ml
20xSSC 5ml
0.4M PB 1ml
50x denhardt’s 0.4ml
鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml）
双蒸水补4ml
探针DNA（变性）20ul
于42°C杂交过夜。
漂洗：62°C
2×SSC--0.1% SDS 15’
0.1×SSC--0.1%SDS 15’
0.1×SSC 15’
(以下步骤于0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl系统中,均在室温)
封闭：封闭液1ml （5% 脱脂奶粉）0.5－1小时
漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 1ml 漂洗1×10’
抗体：1ml 1-2小时（1：3000-1:10000）
漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 漂洗3(1ml)×10’显色：药片一片，30ml蒸馏水中，显色3－5分钟。
用水终止反应。