PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测副-中国食品卫生杂志
地高辛杂交方法
地高辛杂交方法：一、探针标记1.随机引物标记：模板定量：先用分光光度计测OD值，再用试剂盒中未标记的DNA（瓶2）作标准对照，递度稀释，跑电泳定量模板。
（10ngDNA量就可以在UV灯下看见）2.1ug-1.5ug左右的DNA模板（10ul）加重蒸水到15ul，沸水浴中煮10min，立即放置冰上，然后在模板中依次加入如下试剂：Hexanucleotide Mix, 10×(瓶5) 2uldNTP labeling Mix (瓶6) 2ulKlenow enzyme labeling grade(瓶7) 1ul3.混匀，在37℃标记16-18hr，用2ul 0.5M EDTA (PH＝8.0) 终止反应。
二、转膜除碱转以外的转法，如中性转，紫外交链。
三、杂交预杂交，42℃杂交炉中预杂交3-4hr，加入变性过的探针，杂交16hr以上。
2×SSC洗5min，5min，1×SSC洗，10min，（洗膜时在42℃摇床上洗，能洗净膜背面的杂质）。
四、免疫显色检测(所有操作时需要在摇床上摇动)1.洗膜后,在washing buffer中漂洗1-5min2.加100ml 新配制的1×封闭液洗30min, 速度不要太快,膜能飘动就可以3.加20ml Antibody solution(二抗),30min, 注意: 二抗稀释1:10000以上, 摇床速度不要太快,膜能飘动就可以,4.加100ml wanshing buffer, 分别洗5min,5min,10min,15min,摇床速度可以加快,5.加20ml Detection buffer洗2-5min,平衡PH作用,6.加10ml新配制的显色液, 滴加时多块膜放在不同容器中, 先在条带位置快速地从左到右滴加,以防止显色时间差异.7.当条带出现需要的结果时,用TE buffer 或者蒸馏水快速漂洗终止显色反应.8.将结果拍摄下来即可.附: 免疫显色需准备得试剂1.杂交前需配制的试剂(以下溶液均按1L算，灭菌)washing buffer: 0.1M 马来酸(Maleic acid), 0.15M NaCl, PH 7.5, 灭菌后加Tween 20终浓度为0.3℅(v/v).Maleic acid buffer: 0.1M马来酸(Maleic acid), 0.15M NaCl, 加NaOH 固体调PH 7.5, 灭菌Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, PH 9.5TE-buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,PH 8.02.显色时需配制的试剂10×封闭液:瓶10号的脱脂奶粉用马来酸溶解,浓度为10℅(w/v),65℃加热搅拌直至溶解,液体时不透明的，存在2-8℃，以备使用。
地高辛标记探针的Southern杂交
地高辛标记探针的Southern 杂交（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ，Cat.No.11 745 832 910，Roche Diagnostics GmbH，Germany）1. 探针标记步骤（20µl 体系）：1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。
2)沸水浴或干浴锅98 ℃ 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。
3)充分混匀DIG-high Primer （1#管），并取4 µl至变性DNA管，混匀并离心。
4)37 ℃温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。
5)停止反应，加2 µl 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ℃加热10分钟。
2. 探针标记效率检测：将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。
操作步骤如下：1)根据表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl (原始浓度是5ng /μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量表2)将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1μl点膜3)120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟4)将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温振荡2分钟5)将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟6)将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟7)用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟8)在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟9)将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。
新型分子诊断技术在动物疫病检测中的应用与发展
新型分子诊断技术在动物疫病检测中的应用与发展庄向婷;白军;张振仓【摘要】快速有效的病原体检测对于动物疫病的防控和治疗有着非常重要的作用.近年来基于PCR扩增技术的新型分子诊断技术与传统的分子诊断技术相比,对病原体的检测更加快速、特异、敏感、准确,逐步向着分子检测的自动化、高通量和现地使用方向发展.日渐成熟的新型分子诊断技术对于动物疫病检测与鉴别以及出入境检验检疫等领域有着广阔的应用前景,同时可进行大范围的流行病学调查和分析,为动物疫病的科学防控奠定基础.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2018(039)006【总页数】5页(P108-112)【关键词】新型分子诊断技术;PCR扩增技术;病原体;检测;防控【作者】庄向婷;白军;张振仓【作者单位】杨凌职业技术学院,陕西杨凌 712100;杨凌职业技术学院,陕西杨凌712100;杨凌职业技术学院,陕西杨凌 712100【正文语种】中文【中图分类】S851.4;S855;Q78随着生命医学和科学技术的快速发展，基于分子生物学技术对病原体进行测定的分子诊断技术，大大提高了动物病原体的检测水平，从分子水平探讨疾病发生和发展的机制，为动物疫病的预防、诊断和治疗提供信息和决策的依据。
分子诊断技术发展至今，主要分为传统分子诊断技术（核酸杂交技术、聚合酶链反应技术和限制性酶切技术等）和新型分子诊断技术（实时荧光PCR技术、基因芯片技术和核酸扩增技术等）。
近些年来，一些新型分子诊断技术逐步实现了分子检测的自动化和高通量，并应用于动物疫病诊断，有效提高了疫病确诊速度与准确性，为及时控制疫情提供了决策依据。
该文就目前所应用的几类新型分子诊断技术在动物疫病检测中的原理及实践应用进行简单介绍和评论，并对其发展趋势与前景作出展望。
1 新型分子诊断技术在病原检测中的分类及应用病原体的检测是动物疫病确诊的基石，对采取防控措施、提高疗效、改善预后、降低费用有着极其重要的作用。
地高辛标记探针检测卫氏并殖吸虫的方法
地高辛标记探针检测卫氏并殖吸虫的方法【摘要】目的制备卫氏并殖吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COⅠ)基因和核糖体DNA第二间隔区(ITS2)地高辛标记探针,探讨其对并殖吸虫的种别鉴定和诊断的作用。
方法利用引物分别体外扩增获得卫氏并殖吸虫目的基因后凝胶电泳鉴定并且胶回收纯化上述两个基因片段。
将酶切后的COⅠ基因和ITS2基因回收,地高辛标记成探针,尼龙膜上行斑点杂交观察。
结果 COⅠ探针有较好的特异性和敏感性。
ITS2探针缺乏特异性。
结论尼龙膜斑点杂交结果显示卫氏并殖吸虫的COⅠ基因片段可以作为种群鉴定的后备探针。
【关键词】卫氏并殖吸虫; 地高辛; DNA探针; DNA,核糖体; 序列分析,DNA; 克隆,分子; 核酸杂交; 基因ABSTRACT: Objective To prepare digoxigenin-Paragonimus westermani COⅠ and ITS2 genes labeled probe and evaluate for species identification. Methods The genes were labeled with digoxigenin and used as probes. DNA from the various parasites and rabbit control were applied to nylon transfer membranes, hybridized with labeled probes, and visualized according to the manufacturer’s instructions. Result The COⅠ probe hybridized well with DNA from Paragonimus westermani, but not with DNA from other species. In contrast, ITS2 could hybridize with DNA from both Paragonimu westermani and other species. Conclusion The CO Ⅰ gene of the Paragonimus westermani labeled with digoxgeninprobes can be used for species identification.KEY WORDS: Paragonimus westermani; digoxin; DNA probes; DNA,ribosomal; sequence/malysis,DNA; cloning,molecular; mucleic acid hybridization; genes并殖吸虫在全世界广泛分布,在亚洲、非洲、拉丁美洲30余国家及我国23个省市和自治区不同程度流行［1］。
PCR法测定转基因ぶ参锸称芳安艏偈称费芯
PCR法测定转基因ぶ参锸称芳安艏偈称费芯摘要:通过对我国目前食品行业中的问题以及对PCR 法测定转基因植物食品以及检测掺假食品的研究现状的分析,提出我国目前食品质量监督部门应推广采用已成熟的基因检测技术,用于食品质量检测,打击假冒伪劣产品,维护消费者利益。
关键词:PCR法;转基因植物食品;掺假;食品质量监督中图分类号:R155.5文献标识码:A文章编号:16723198(2009)20029102?お?1我国目前食品行业中的问题植物基因工程如果从上世纪70年代处建立重组DNA技术开始,已有30多年的历史,目前世界上转基因植物多达一百多个物种,有近千例转基因植物被批准进入田间试验,其中有许多转基因产品已经通过商业开发进入国际市场。
近年来,我国粮食呈净进口格局,2004年-2006年3年累计净进口1450亿斤,平均每年净进口500亿斤,其中就有相当部分含有转基因成分。
转基因的高生产力、高品质性和高抗逆性,是传统品种无法比拟的,在人口、环境的压力下,转基因产品仍将具有较大的市场空间。
由转基因食品市场化引发的安全问题也越来越成为人们关注的焦点。
同时,伴随着我国食品工业的飞速发展,不法分子的掺假方式越来越多、范围越来越广、内容越来越复杂。
掺假的方式包括掺兑、混入、抽取、假冒、粉饰等手段。
掺假范围可涉及粮油、肉类和加工制品、乳制品、果蔬、糖及糖制品、饮料类等各领域。
掺假的例子不胜枚举。
粮食中常见的掺假为新米掺入陈米、廉价的米混入价高的米、面粉中混入滑石粉等。
据检查发现食用植物油中花生油和芝麻油的掺杂、掺假尤为严重。
食用植物油中可能会掺兑地沟油以及其他非食用油(如桐油、青油、蓖麻油、巴豆油、矿物油等),出售牟取非法暴利,严重影响了消费者的健康。
掺假香油主要是掺兑水、冬瓜汤、米汤、猪油、棉籽油、菜籽油或其他的油等,有的香油是由色拉油与香油精勾兑的。
掺假麻酱是用炒过的莜面粉再加上色拉油配制而成的。
尤以私营企业及地方小油料加工厂的散装粮油以及小的粮油店掺假现象较为严重。
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
其化学结构如图1 所示。
采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。
RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。
寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。
地高辛标记探针检测重组人干扰素α2b中DNA残留量的研究
地高辛标记探针检测重组人干扰素α2b中DNA残留量的研究背景DNA残留量的监测是生物制剂研发及生产中的一个重要环节。
在重组蛋白生产中，DNA残留一般来源于细胞培养过程中的细胞死亡和裂解，也可能是生产过程中的细胞DNA污染等。
虽然DNA残留一般不会对生物制剂的活性和安全性造成影响，但是在药品质量控制中的监测和控制是必不可少的。
因此，发展一种简便、高灵敏度的DNA残留检测方法具有重要意义。
干扰素α2b作为一种常见的重组蛋白，被广泛用于治疗多种疾病，如乙型病毒性肝炎、黑色素瘤等。
在干扰素α2b的生产过程中，DNA残留的检测是必不可少的。
近年来，地高辛标记探针已成为一种常用的DNA残留检测方法，其灵敏度和特异性均较高，但目前很少有研究探讨其在干扰素α2b中的应用。
实验目的本研究旨在建立一种基于地高辛标记探针的检测方法，用于检测重组人干扰素α2b中的DNA残留量，并评估该方法的准确性、灵敏度和特异性。
实验设计1.设计合成适用于干扰素α2b的地高辛标记探针；2.确定探针的最佳工作浓度和探针/干扰素α2b样品的最佳比例；3.以不同浓度的重组干扰素α2b样品作为模拟样品，测试该方法的灵敏度；4.以其他重组蛋白（人白细胞介素2，重组人肝素等）作为干扰样品，评估该方法的特异性；5.评估该方法的准确性，对比该方法的结果和HPLC等方法的结果。
实验步骤1.合成适用于干扰素α2b的地高辛标记探针：–设计合成地高辛标记探针的引物；–制备探针的DNA模板；–进行PCR扩增并纯化产物；–用地高辛检测试剂盒检测探针纯化后的DNA产物。
2.确定最佳工作浓度和探针/样品的最佳比例：–用不同浓度的探针溶液检测一定量的重组干扰素α2b，确定最佳的探针工作浓度；–以不同比例的探针和样品进行反应，选取最佳的探针/样品比例。
3.测试方法的灵敏度：–以一定体积的重组干扰素α2b样品为模拟样品，用上述方法进行检测；–取不同浓度的模拟样品，检测其DNA残留量，评估该方法的灵敏度。
生物制品中残留DNA检测
生物制品中DNA残留检测系列1. 生物制品中残留DNA检测标准的变化2015年3月底，中国食品药品检定研究院网站的国家药品标准物质目录中新增加了一个编号为410001的产品：CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。
这个由中检院与中科院联合研发，由生物制药企业参与标定的试剂盒与现行美国药典（USP）建议的检测方法同步，但与2010版药典附录中外源性DNA 残留量测定法有所不同，可能会对国内生物制品的研发和生产的上下游企业产生影响。
生物制品中宿主细胞残留DNA具有潜在致瘤和传染风险，所以各国药品监管部门对DNA杂质的限量要求非常严格。
美国药典在General Chapter <1130>介绍了三种常用技术，但将在2015年颁布的新版（USP38–NF33）中增加全新章节（General Chapter <30>）来进一步规范残留DNA检测的方法和标准物质。
与1000号以上的章节不同的是，USP编号1000以内的章节详细规定了检测技术、系统适应性标准和标准物质。
新版USP中将唯一推荐qPCR法作为生物制品中宿主残留DNA的标准方法。
qPCR法的技术优势在于序列特异性高、灵敏度高、重现性好，可以为生物制药工业在工艺研究和成品质量控制方面提供可靠的检测手段。
我国参照WHO、FDA和欧盟的标准，很早以前开始就对生物制品中残余DNA 含量进行限制。
从卫生部颁布的《人用重组DNA制品质量控制要点》到近年的《中国生物制品规程》都对DNA含量做了严格要求，部分标准高于国际标准。
2010年版中国药典附录收录了DAN探针杂交法和荧光染料法，这两种方法都存在技术缺陷，很难达到杂质限量检测的灵敏度，已经被欧美药典摒弃。
目前，仍有很多国内企业沿用这两种方法检测残留DNA，致使生产工艺和产品质量很难达到国际一流水平。
根据残余DNA检测技术的发展趋势，小编预计我国2015版药典或增补版本中将出现qPCR方法。
地高辛标记的黄鳝F64基因cRNA探针的制备及其应用
地高辛标记的黄鳝F64基因cRNA探针的制备及其应用蒋骄云1田文斐3冯龙4曲宪成2【摘要】以黄鳝F64基因序列为模板设计引物，扩增用于cRNA探针合成的模板，构建F64/pGM-T重组质粒并线性化，利用RNA聚合酶体外转录合成正、反义cRNA探针，并对其进行地高辛标记，利用原位杂交方法检测F64基因在黄鳝性腺发育过程中的表达变化情况。
结果显示，正义探针未检测到阳性信号，反义探针检测到该基因在黄鳝性腺发育早期不表达，于V期性腺开始表达。
研究结果表明，体外转录法可以有效合成cRNA探针，制备的cRNA探针可以准确检测F64基因的时空表达。
【期刊名称】生物技术通报【年(卷),期】2016(032)003【总页数】5【关键词】黄鳝F64基因；性腺发育；cRNA探针；原位杂交黄鳝（Monopterus albus），隶属硬骨鱼纲（Osteichthyes）辐鳍亚纲（Actinopterygii）合鳃目（Synbranchiformes）合鳃科（Symbranchidae）黄鳝属（Monopterus）。
其整个发育史的表现是首先发育为雌性个体，待发育成熟，排卵后性逆转为雄性个体，具有典型先雌后雄的性腺发育过程［1］，是研究鱼类性别调控机制的良好模式动物。
黄鳝因其性腺发育的特殊性，一直以来都是科研工作者的研究热点之一。
为了探知黄鳝性别调控机制，国内外学者开展了大量的研究。
在内分泌调控方面，周秋白等［2］分析了产卵和未产卵黄鳝雌二醇（E2）的变化特征，结果表明E2水平对黄鳝性腺发育起重要作用，浓度的降低是黄鳝启动性逆转的前提。
郭威等［3］的研究结果显示黄鳝血清E2在黄鳝间期性腺发育到雄性过程中显著下降，而T（睾酮）则显著上升，表明激素在黄鳝性腺发育中扮演重要角色。
在分子调控机制方面，芳香化酶是生物体内C19雄激素转化为C18雌激素的关键条件因子［4］，与大多数硬骨鱼类一样，黄鳝中芳香化酶基因（CYP19）具有两种不同的拷贝，分别为cyp19a1a和cyp19a1b，进一步分析表明这两个基因在黄鳝性逆转过程中呈现多态性表达，可能在黄鳝性逆转过程中起到一定作用［5-7］。
地高辛标记探针的Southern印迹方案
地高辛标记探针的DNA印迹方案Southern blot using DIG Prober(分子生物学实验室)Step I 采用地高辛高效标记混合物(ROCHE) 标记DNA探针1 以质粒为模板，PCR扩增序列特异性片段，回收片段，并测定浓度浓度测定：将回收产物取1μl稀释5倍，标准分子量的标记物MAKER分别点1μl，2μl，4μl，6μl.然后比较回收产物的条带亮度与MAKER比较后，可以粗略估算浓度。
2 取1μg模板（第1步扩增回收产物）于1.5ml的eppendorf管中，加入灭菌双蒸水至终体积为16μl。
3 沸水浴处理10min后迅速于冰上冷却使DNA变性（1）摇匀DIG-High Prime（vial 1），取4μl加入已热变性的模板DNA中，混匀后，瞬时离心，37℃保温20h，65℃处理10min终止反应。
4取１μl电泳检测，标记后的条带稍大于标记前片断。
５标记好的DNA探针－20℃保存。
Step II 基因组DNA酶切1 提取高质量的基因组DNA，浓度>1μg/μl ; 测定浓度的方法同测定探针浓度方法一样。
2 选择合适的内切酶（酶切的DNA量20μg左右。
注意考虑到纯化的损失，约30%，酶切DNA浓度过大时，可以考虑多做几管做浓缩）。
50μl酶切反应体系：EcoR I (15U/μl ) 5μl10×M buffer 5μlgDNA 10μl（约10-20μg）ddH2O up to 50μl注：有些内切酶需加BSA，请参照内切酶说明（包括最适酶切温度）。
3 37℃酶切12h （电泳检测），视酶切情况可延长酶切时间，直至酶切完全。
65℃保温10min停止酶切反应。
Step III 预电泳和电泳1 配制0.8 %的琼脂糖凝胶（大胶40ml左右，胶薄较好，利于转膜）。
2 加入适量上样缓冲液（Loading Buffer）点样，点上质粒做对照。
注：两边的点样孔尽量空出来；点上marker,再单独一点样孔用溴酚兰做指示，防止跑过。
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论著
中国食品卫生杂志 CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE
2009 年第 21 卷第 4 期
PCR 法制备地高辛标记 DNA 探针斑点杂交检测副溶血性弧菌 tlh 基因
曹小红1 朱雪兰1 陈 艳2 刘秀梅2 (1. 天津科技大学食品营养与安全重点实验室 ,天津 300457 ; 2. 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 ,北京 100021)
摘 要 :目的 建立检测副溶血性弧菌种特异性 tlh 基因的斑点杂交方法 。方法 采用 PCR 法制备地高辛标记
DNA 探针 ,建立斑点杂交条件 。杂交反应条件优化如下 :杂交温度65 ℃,杂交时间 9～12 h ,探针使用浓度 100～ 125 pgΠml 。结果 地高辛标记 tlh 基因探针长度为 450 bp ,标记产量为 50μgΠml 。探针具有较高的灵敏度和特异性 , 可重复使用 4 次 。结论 本方法具有快速 、简便 、高效的特点 ,适用于副溶血性弧菌菌株的鉴定 。
基金项目 :国家科技部“十一五”攻关项目 (2006BAK02A15) 作者简介 :曹小红 女 教授 通讯作者 :刘秀梅 女 研究员
异性标志物[4] 。为此 ,本研究采用 PCR 法制备地高 辛 (DIG) 标记 DNA 探针 ,在国内率先建立并优化针 对副溶血性弧菌 tlh 基因的斑点杂交方法 ,可以有 效地缩短样品检验周期 ,减少工作量 。
1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 菌株
副溶 血 性 弧 菌 ( Vibrio parahaemoly2ticus ) ATCC 17802 和 ATCC 33847 , 拟 态 弧 菌 ( Vibrio mimicus ) ATCC 33653 ,购自中国科学院微生物研究所 。铜绿 假单胞菌 ( Pseudomonas aeruginosa) ATCC 15442 ,金黄 色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) ATCC 6538 , 蜡样 芽胞 杆 菌 ( Bacillus cereus ) ATCC 63301 , 溶 藻 弧 菌 ( Vibrio alginolyticus ) VA1 , 大 肠 埃 希 菌 ( Escherichia coli) O157∶H7 ,麦氏弧菌 ( Vibrio metschnikovii) ,肠球菌 ( Enterococcus) 由福建省疾病预防控制中心赠送 ; 溶 藻弧菌 ( Vibrio alginolyticus) VA2 由words : Vibrio Parahaemolyticus ; DNA Probe ; tlh ; Dot2Blot Hybridization
副溶血性弧菌 ( Vibrio parahaemolyticus) 是革兰阴 性嗜盐菌 , 广泛存在于世界各地近海岸的海水 、海 底沉积物和海产品中 ,是一种重要的食源性致病菌 。 副溶血性弧菌可引起急性胃肠炎 ,甚至原发性败血 症 ,疾病的发生与生食海产品或交叉污染的食物有 关[1] 。国家食源性疾病监测网发现 ,沿海省份零售 市场海产品的污染较为严重 ,副溶血性弧菌食源性 感染已成为我国的重要公共卫生问题之一[2 ,3] 。建 立高效的食品中副溶血性弧菌分析方法 ,有助于提 高病原菌的检出率 ,降低食源性副溶血性弧菌感染 的发病率 ,保障食品安全 。目前 ,我国国家标准 GBΠ T 478917 —2003 仍采用传统的微生物增菌 、培养的 生化试验方法 。已有研究表明 , tlh 基因存在于所有 的副溶血性弧菌中 ,可以作为副溶血性弧菌的种特
and Technology , Tianjin 300457 , China)
Abstract: Objective To establish a dot2blot hybridization method to detect the species2specific tlh gene of Vibrio parahaemolyticus. Method PCR was carried out to prepare the digoxingenin (DIG) 2labeled DNA probe , and the dot2blot technique was established subsequently. The dot2blot reaction conditions were optimized as follows : the hybridization was allowed at 65 ℃for 9 to 12 h , and the concentration of probe in the final hybridization reaction were from 100 to 125 pgΠml. Results The DIG2labeled DNA fragment was 450 bp in length at a concentration of 50μgΠml. The DNA probe gave high sensitivity , specificity and repeatability. Conclusion This method was rapid , simple and effective for the detection of the isolated strains of V.
关键词 :弧菌 ,副溶血性 ; DNA 探针 ; tlh 基因 ; 斑点杂交
Detection of the tlh Gene of Vibrio Parahaemolyticus by Dot2blot Hybridization
CAO Xiao2hong , ZHU Xue2lan , CHEN Yan , LIU Xiu2mei ( Tianjin Key Laboratory of Food Nutrition and Safety , Tianjin University of Science