原位杂交-经典方法-地高辛标记探针
地高辛杂交方法
地高辛杂交方法：一、探针标记1.随机引物标记：模板定量：先用分光光度计测OD值，再用试剂盒中未标记的DNA（瓶2）作标准对照，递度稀释，跑电泳定量模板。
（10ngDNA量就可以在UV灯下看见）2.1ug-1.5ug左右的DNA模板（10ul）加重蒸水到15ul，沸水浴中煮10min，立即放置冰上，然后在模板中依次加入如下试剂：Hexanucleotide Mix, 10×(瓶5) 2uldNTP labeling Mix (瓶6) 2ulKlenow enzyme labeling grade(瓶7) 1ul3.混匀，在37℃标记16-18hr，用2ul 0.5M EDTA (PH＝8.0) 终止反应。
二、转膜除碱转以外的转法，如中性转，紫外交链。
三、杂交预杂交，42℃杂交炉中预杂交3-4hr，加入变性过的探针，杂交16hr以上。
2×SSC洗5min，5min，1×SSC洗，10min，（洗膜时在42℃摇床上洗，能洗净膜背面的杂质）。
四、免疫显色检测(所有操作时需要在摇床上摇动)1.洗膜后,在washing buffer中漂洗1-5min2.加100ml 新配制的1×封闭液洗30min, 速度不要太快,膜能飘动就可以3.加20ml Antibody solution(二抗),30min, 注意: 二抗稀释1:10000以上, 摇床速度不要太快,膜能飘动就可以,4.加100ml wanshing buffer, 分别洗5min,5min,10min,15min,摇床速度可以加快,5.加20ml Detection buffer洗2-5min,平衡PH作用,6.加10ml新配制的显色液, 滴加时多块膜放在不同容器中, 先在条带位置快速地从左到右滴加,以防止显色时间差异.7.当条带出现需要的结果时,用TE buffer 或者蒸馏水快速漂洗终止显色反应.8.将结果拍摄下来即可.附: 免疫显色需准备得试剂1.杂交前需配制的试剂(以下溶液均按1L算，灭菌)washing buffer: 0.1M 马来酸(Maleic acid), 0.15M NaCl, PH 7.5, 灭菌后加Tween 20终浓度为0.3℅(v/v).Maleic acid buffer: 0.1M马来酸(Maleic acid), 0.15M NaCl, 加NaOH 固体调PH 7.5, 灭菌Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, PH 9.5TE-buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,PH 8.02.显色时需配制的试剂10×封闭液:瓶10号的脱脂奶粉用马来酸溶解,浓度为10℅(w/v),65℃加热搅拌直至溶解,液体时不透明的，存在2-8℃，以备使用。
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
其化学结构如图1 所示。
采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。
RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。
寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
地高辛标记探针的Southern-杂交技术
地高辛标记探针的Southern 杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。
将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。
它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。
还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。
核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。
其基本过程包括以下几步。
首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印〞上去的，这个过程称为核酸印迹〔nucleic acid blotting〕转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法〔dot and slot blotting〕、菌落和嗜菌斑印迹法〔colony and plaque blotting〕；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。
根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术〔Dot blot〕、Southern杂交技术〔Southern blot〕、Northern杂交技术〔Northern blot〕。
前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。
本实验主要介绍Southern杂交技术。
1主要内容1. Southern Blot方法的原理。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳。
3. DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜与膜处理。
原位杂交步骤-自己整理的1
荧光原位杂交试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）：1×PBS：NaCl 8g∕L、KCl 0.2 g∕L、Na2HPO4 1.44 g∕L、KH2PO4 0.24 g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH 计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。
（注：本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使用前加入0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
地高辛标记dna探针原理
地高辛标记dna探针原理
地高辛标记DNA探针是一种通过标记染色体上的特定DNA序列用于鉴定、检测和定位目标DNA的技术。
其原理主要涉及两方面，一是DNA杂交，二是标记检测。
首先，标记DNA探针通过与目标DNA发生杂交反应，将DNA探针上的特定DNA序列与目标DNA上的互补序列结合，使探针与靶标DNA 形成双链DNA杂交物。
这种杂交反应通常在高温下进行，以便将DNA 双链分离，随后在低温下进行，以便使探针和目标DNA结合。
其次，标记检测通过将探针的DNA序列与荧光染料等标记物进行连接，以获得可见的信号。
在探针杂交反应后，如果探针成功与目标DNA结合，则标记物也会随之结合，反之则不会结合。
通常通过显微镜或荧光成像系统观察标记信号来确定目标DNA的存在。
因此，地高辛标记DNA探针的原理主要基于DNA杂交和标记检测技术，可以用于检测和定位目标DNA，为分子生物学等领域的研究提供了有力的支持。
原位杂交-DIG
原位核酸分子杂交技术原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。
这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。
可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。
原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。
临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。
随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。
第一节原位核酸分子杂交技术的发展原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。
与此同时，Buongiorno Nardelli 和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。
Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。
原位杂交具体步骤
原位杂交流程以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针 对石蜡切片进行mRNA检测的流程图。
这些实验操作方法很多参考书中均有 但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的 因此特加以综合供同行参考 在具体操作过程中很多地方可酌情变更。
在临床应用中 常常可以买到已经标记好的商品探针 那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去 从石蜡切片处理做起即可。
下面介绍的方法笔者已亲手做过数次 可获满意结果。
主要操作步骤制备感受态细菌用含目的基因的质粒转化细菌小量培养转化的细菌小量提取质粒小量酶切质粒电泳鉴定大量培养转化的细菌大量提取质粒大量酶切质粒电泳分离、回收及纯化标记探针石蜡切片的处理预杂交、杂交杂交后处理抗体连接、显色制备感受态细菌【试剂及配制】1 LB液体培养基在900ml三蒸水中加入胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g酵母提取物(bacto-extract) 5gNaCl 10g磁力搅拌使完全溶解 用5mol NaOH调节pH至7.0 如用进口试剂则不必调 。
定容为1000ml 高压灭菌20min。
2 0.1mol CaCl2溶液1.1g无水氯化钙 溶于90ml三蒸水中 定容至100ml 用0.22μm滤器过滤除菌置于灭菌试剂瓶中 4℃保存。
【材料】大肠杆菌单菌落或冻存菌种 也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。
【操作方法】1 从37℃培养12 16h的平板中用无菌的接种环 用前酒精灯烧红晾凉 挑一单菌落 转入含有5ml LB培养基的无菌试管 37℃振摇 200r/min 过夜。
次日取菌液1ml 加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶 37℃振摇培养 200 300r/min 约2 3h将烧瓶取出立即置冰浴10 15min2 以下均为无菌操作。
在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心管中3 4℃离心 5000g ×10min 回收细菌4 弃去培养液 将管倒置于滤纸上1min 流尽培养液5 用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体 置冰浴30min6 4℃离心 5000g ×10min 弃上清 倒置于滤纸上1min7 加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 重悬菌体 动作要轻8 置4℃冰箱12 24h 即可用于转化。
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原位杂交
(In situ hybridization)
一、目的
掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。
二、原理
原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。
其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
三、仪器设备
烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。
四、材料和试剂
1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。
2．试剂：
Davidson’s AFA固定液:
330 ml 95％乙醇
220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液）
115 ml 冰醋酸
335 ml H2O
混匀后封口，室温放置；
DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）；
TNE：50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base
10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl
1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTA
ddH2O 900 ml （定容至1L）
用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存；
0.4% 甲醛：37～39％% 甲醛 5.4 ml
ddH2O 495 ml；
蛋白酶K溶液(Pr.K，10 mg/ml)：10 mg Pr.K 溶于1 ml TNE中（用时现配）；
20×SSC：3 mol/L NaCl 175.32 g NaCl
0.3 mol/L柠檬酸钠88.23 g 柠檬酸钠
ddH2O 900 ml （定容至1L）
调pH至7.0，高压灭菌，4℃保存；
2×SSC：20×SSC 100 ml
ddH2O 900 ml
0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；
20×Denhardt’s溶液：
0.4％牛清血蛋白0.4 g牛清血蛋白
0.4％聚蔗糖0.4 g聚蔗糖
0.4％聚乙烯吡咯烷酮0.4 g聚乙烯吡咯烷酮
ddH2O 100 ml
0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；
25％硫酸葡聚糖：25 g硫酸葡聚糖溶于80 ml ddH2O（定容至100 ml），-20℃保存；杂交液：4×SSC
50% 甲酰胺
1×Denhardt’s
5% 硫酸葡聚糖
0.5 mg/ml鲑精DNA
4℃保存；
BufferI：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base
150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl
用HCl调pH至7.5，定容至1L，高压灭菌，4℃保存，；
BufferII：0.5% Blocking agent 0.5 g Blocking agent
BufferI 100 ml
低温加热溶解，4℃保存一星期；
BufferIII：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base
100 mmol/L NaCl 5.84 g NaCl
50 mmol/L MgCl2 10.16 g MgCl2•6H2O
ddH2O 990 ml（定容至1L）
用HCl调pH至9.5，0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；
BufferIV：10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/LEDTA；
显色液（NBT/BCIP使用液）：20 µl NBT/BCIP + 1ml BufferIII。
水性封片剂：甘油明胶
明胶(gelatine) 8 g
酚(phenol) 0.5 ml
甘油(glycerin) 50 ml
dH2O 48 ml
（酚可选用）
五、实验方法和步骤
1、固定
现场取感染病毒、濒死的斑节对虾，于第2、3腹节间和头胸部注射Davidson’s AFA 固定液全身固定，切取头胸部，从额剑将头胸部分成2部分，再置Davidson’s AFA固定液中固定12-24h ，转入70%乙醇中保存；或者取感染病源体的鱼类、两栖类、爬行类等的各器官，按同样方法固定。
取材厚度一般5 mm。
固定液的量一般不少于所固定组织体积的10倍。
2、脱水和包埋（按常规组织切片技术操作）
脱水：用不同的乙醇浓度脱水
70%乙醇2次1h/次可停留
80%乙醇2次1h/次可停留
95%乙醇2次1h/次
无水乙醇2次45min /次
透明：
1/2无水乙醇+ 1/2二甲苯1次20 min
二甲苯2次 5 min /次
1/2二甲苯+ 1/2石蜡1次30 min
透腊：3次
石蜡I 45min～1h
石蜡II 45min～1h
石蜡III 45min～1h
3、切片
①载玻片和盖玻片的准备：3% HCl + 95%乙醇浸泡30min以上，擦干备用。
硅化载玻片：将载玻片分别浸入下列溶液处理
2% APES(APES溶于丙酮中) 2min
丙酮1min
dH2O 1min
烘干备用
②切4-6 µm厚的切片于载玻片上，42℃展片过夜。
4、杂交
①烘片：将切片放入烘箱内，60℃，烘45min。
②脱蜡：
二甲苯2次10min /次
1/2无水乙醇+ 1/2二甲苯1次5min
③水化：
无水乙醇2次2～3min /次
95%乙醇2次2～3min /次
80%乙醇2次2～3min /次
70%乙醇2次2～3min /次可停留
dH2O 1次2～3min /次
③消化：1×TNE 5min
Pr.K ( 10µg/ml) 200μl/片37℃10 min （湿盒内）
(10 mg/ml母液用TNE稀释1000倍)
④后固定：0.4% 甲醛5min
⑤杂交：2×SSC 5min
探针先于100℃变性5～10 min，立即置冰上5min;
含10～25ng/100µl探针的杂交液100µl/片，覆盖盖玻片，用矿物油封片。
整个玻片于95℃变性6 min，立即置冰上5min，42℃杂交过夜（湿盒内）。
5、冲洗与显色
2×SSC 2次 5 min /次37℃
1×SSC 2次 5 min /次37℃
BufferI 5min 室温
BufferII 5min 室温200µl/片（湿盒内）
Ap使用液30～45min 37℃100µl/片（湿盒内）
(用BufferII 稀释Ap原液2000倍)
BufferI 2次 5 min /次室温
BufferIII 5min 室温
NBT/BCIP使用液2h～过夜室温200µl/片（湿盒内）
避光勿动！
BufferIV 15min 室温停止显色
dH2O 2～3min
六、注意事项
1、杂交条件：杂交的特异性依赖于探针的结构、杂交温度（高温严谨）、pH及杂交液
中甲酰胺（高浓度）和盐离子的浓度（低盐）。
2、Pr.K消化时间一定要严格控制，时间太长，会掉片；时间太短，则消化不够，影响
探针进入，可能造成假阴性结果。
3、杂交时将盖玻片轻轻放在载玻片上，放好后，不可移动，以免破坏盖玻片下面的样
品，影响观察。
七、思考题
1、如何利用原位杂交技术检测组织细胞中的特定RNA（RNA病毒或者组织细胞内的
RNA）？
2、杂交液中甲酰胺的作用是什么？。