地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记及检测试剂盒I(POD)说明书
DIG Random Labeling and Detection KitⅠ（POD）(for color detection withDAB)DNA探针标记和检测试剂盒Ⅰ产品编号：MK1008保存期：一年-20℃冰冻保存。
用途：用于DNA探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。
工作量：可用于标记0.1—3μg的探针6次及1000张切片的原位杂交或12次10×10cm膜上杂交检测。
原理所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。
如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。
在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow 酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。
以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。
一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。
敏感性很高。
可用于膜上杂交和原位杂交。
试剂盒内容：1. DIG Random Labeling Mix(高效)，25μl2.Biotin—MouseAnti—Digoxin200μl3. SABC—POD200μl4. DAB Stock Solution5ml5. Blocking Reagent，5g特点：（1）标记属高效标记反应。
以1μg DNA探针为例，1小时反应即可产生0.8μg标记探针，20小时可产生2μg左右的标记探针。
（2）试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow酶等混合在一起。
一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。
（3）标记反应适于下述对象：a.DNA从10ng—3μg。
b.不等的DNA长度100bp—10kb。
地高辛标记探针的Southern杂交
地高辛标记探针的Southern 杂交（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ，Cat.No.11 745 832 910，Roche Diagnostics GmbH，Germany）1. 探针标记步骤（20µl 体系）：1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。
2)沸水浴或干浴锅98 ℃ 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。
3)充分混匀DIG-high Primer （1#管），并取4 µl至变性DNA管，混匀并离心。
4)37 ℃温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。
5)停止反应，加2 µl 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ℃加热10分钟。
2. 探针标记效率检测：将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。
操作步骤如下：1)根据表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl (原始浓度是5ng /μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量表2)将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1μl点膜3)120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟4)将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温振荡2分钟5)将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟6)将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟7)用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟8)在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟9)将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。
[生物学]地高辛标记系统
![[生物学]地高辛标记系统](https://img.taocdn.com/s3/m/7cdf6708bceb19e8b8f6ba9d.png)
DIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3 20-25bp 可插入一个DIG-dUTP
随机引物法标记的探针是基于模板的不同 区段、不同长度的DNA 片段
可以探测0.03-0.1pgDNA
标记步骤(20µl)
将10ng-1µg 模板DNA用无菌去离子水补足至16µ l。 沸水浴或干浴98 ºC 10分钟，使DNA变性成单链并
Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20℃)0 15-25℃ stable. Dilution of Blocking solution.
Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20℃). 15-25℃ stable. Ajustment of pH to 9.5.
用作探针模板的DNA应是线型的，大于100bp，如果模板 DNA >5kb则应用4碱基的限制性内切酶切割成较小片段 （切割后要纯化）
模板的量：10ng-3μg，如果要检测复杂基因组中的单拷贝 基因，标记模板的最低量要300ng（探针浓度：25ng/ml 杂交液）
如果做基因组DNA southern blotting, 应将克隆倒载体上 的DNA 酶切后琼脂糖电泳分离或PCR扩增，得到的片段 都需要用试剂盒纯化
操作基本要求
工作环境及试剂要干净：（1）试剂要高 压灭菌；（2）含有SDS 的试剂要过滤灭 菌；（3）TWEEN20应加到预先灭菌过的 试剂中
用具要干净：用之前一定要清洗得非常干 净
操作尼龙膜时要小心（1）戴无尘手套； （2）用干净的镊子夹取膜的边缘
in situ hybridization
原位核酸分子杂交技术原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。
这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。
可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。
原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。
临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。
随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。
第一节原位核酸分子杂交技术的发展原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。
与此同时，Buongiorno Nardelli 和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。
Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。
地高辛标记核酸病理形态学检测方法的建立及应用
地高辛标记核酸病理形态学检测方法的建立及应用杨雪;勾文峰;丁蕾;肖丽君;高野康雄;郑华川【摘要】目的建立地高辛标记原位杂交(ISH)和原位PCR(ISP)方法,探讨其在病理形态学检测中的应用.方法以细胞cDNA或质粒DNA为模板制备地高辛探针,ISH 检测肺癌、胃癌或结直肠癌切片上JCV T抗原DNA、beclin 1和SERCA3 mRNA表达水平.在肺癌和胃癌切片上扩增地高辛标记的JCV T抗原DNA.杂交或标记后,进行抗地高辛碱性磷酸酶反应并行NBT/BCIP或Fuchsin显色.结果 PCR 扩增获得高纯度地高辛标记DNA探针,甲酰胺杂交液杂交显示JCV T抗原存在于JCI细胞的细胞核中,beclin 1和SERCA3 mRNA阳性信号见于结肠癌和癌旁黏膜上皮细胞质中.ISP扩增了地高辛标记的JCV T抗原DNA,显色后发现JCV T抗原主要定位在JCI细胞、肺泡上皮细胞和肺癌细胞核、胃癌及癌旁黏膜细胞核中.NBT/BCIP显色比Fuchsin显色更为敏感,甲基绿复染使得上述2种显色更加清晰.结论地高辛标记的ISH和ISP操作简便,敏感度高,NBT/BCIP显色和甲基绿复染图像美观.%Objective To introduce the methodology of in situ hybridization (ISH) and PCR (ISP) by digoxin labeling and explore their application in pathomorphological detection and research studies. Methods The digoxin-labeled probes were prepared using cell cDNA or plasmid as template. JC virus (ICV) T antigen DNA,beclin 1 and SERCA3 mRNA were examined on the slides of lung,gastric or colorectal carcinoma by ISH. Additionally, JCV T antigen DNA was amplified and labeled by digoxin on the tissue sections of lung and gastric carcino-ma as well as their adjacent normal tissue by ISP. Anti-digoxin alkaline phosphase was reacted and colored by NBT/BCIP or Fuchsin. Re-sults The preparation ofdigoxin-labeled probes is simple using PCR. ISH showed that JCV T antigen DNA was localized in the nuclei of JCI cells after hybridization in formamide buffer. ISH results also confirmed the distribution of beclin 1 and SERCA3 mRNA in the cytoplasm of colorectal carcinoma cells. JCV T antigen DNA was labeled by digoxin and observed in the nuclei of alveolar cells,gastric epithelial cells, lung and gastric cancer cells by ISP. NBT/BCIP color development was more sensitive than Fuchsin and methyl green staining was beautiful for both NBT/BCIP and Fuchsin. Conclusion Digoxin-labeling ISH and ISP methods were simple and sensitive. Beautiful figures could be obtained using NBT/BCIP color development and methyl green staining. ISH and ISP established in this study were available and applicable for most laboratories.【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2012(041)011【总页数】4页(P977-980)【关键词】原位杂交;原位PCR;核酸;病理形态学检测【作者】杨雪;勾文峰;丁蕾;肖丽君;高野康雄;郑华川【作者单位】中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学研究室,病理与病理生理研究所,沈阳110001;中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学研究室,病理与病理生理研究所,沈阳110001;解放军463医院检验科,沈阳110042;承德医学院基础部免疫教研室,河北承德067000;日本神奈川县立癌中心临床研究所,横滨241-0815;中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学研究室,病理与病理生理研究所,沈阳110001【正文语种】中文【中图分类】Q503原位检测核酸的病理学方法主要有原位杂交（in situ hybridization，ISH）和原位 PCR（in situ polymerase chain reaction，ISP）。
原位杂交-经典方法-地高辛标记探针
原位杂交(In situ hybridization)一、目的掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。
二、原理原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。
其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
三、仪器设备烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。
四、材料和试剂1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。
2．试剂：Davidson’s AFA固定液:330 ml 95％乙醇220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液）115 ml 冰醋酸335 ml H2O混匀后封口，室温放置；DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）；TNE：50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTAddH2O 900 ml （定容至1L）用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存；0.4% 甲醛：37～39％% 甲醛 5.4 mlddH2O 495 ml；蛋白酶K溶液(Pr.K，10 mg/ml)：10 mg Pr.K 溶于1 ml TNE中（用时现配）；20×SSC：3 mol/L NaCl 175.32 g NaCl0.3 mol/L柠檬酸钠88.23 g 柠檬酸钠ddH2O 900 ml （定容至1L）调pH至7.0，高压灭菌，4℃保存；2×SSC：20×SSC 100 mlddH2O 900 ml0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；20×Denhardt’s溶液：0.4％牛清血蛋白0.4 g牛清血蛋白0.4％聚蔗糖0.4 g聚蔗糖0.4％聚乙烯吡咯烷酮0.4 g聚乙烯吡咯烷酮ddH2O 100 ml0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；25％硫酸葡聚糖：25 g硫酸葡聚糖溶于80 ml ddH2O（定容至100 ml），-20℃保存；杂交液：4×SSC50% 甲酰胺1×Denhardt’s5% 硫酸葡聚糖0.5 mg/ml鲑精DNA4℃保存；BufferI：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl用HCl调pH至7.5，定容至1L，高压灭菌，4℃保存，；BufferII：0.5% Blocking agent 0.5 g Blocking agentBufferI 100 ml低温加热溶解，4℃保存一星期；BufferIII：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base100 mmol/L NaCl 5.84 g NaCl50 mmol/L MgCl2 10.16 g MgCl2•6H2OddH2O 990 ml（定容至1L）用HCl调pH至9.5，0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；BufferIV：10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/LEDTA；显色液（NBT/BCIP使用液）：20 µl NBT/BCIP + 1ml BufferIII。
地高辛标记的cDNA探针检测 IL-6mRNA表达的方法
地高辛标记的cDNA探针检测 IL-6mRNA表达的方法姜蓉;王莎莉;王亚平;郑敏;王勇【期刊名称】《解剖学杂志》【年(卷),期】2001(024)002【摘要】@@ IL-6(interleukin-6)是一种由多种细胞分泌的细胞因子,在血液病及心、脑疾病时有异常表达.IL-6被认为是目前治疗各种血小板减少症的最佳药物,在治疗白细胞减少症及抗白血病、抑制肿瘤转移及骨髓移植方面也有重要作用.迄今,IL-6的检测多采用以细胞培养为基础的生物学活性检测,该方法不仅难以反映IL-6基因转录水平,而且特异性和灵敏度均受到限制.本文采用随机引物法对人IL-6cDNA探针进行地高辛标记,核酸分子原位杂交技术,建立了在转录水平上直观检测IL-6mRNA表达的实验技术,为研究IL-6的基因表达与调控奠定了基础.【总页数】3页(P189-191)【作者】姜蓉;王莎莉;王亚平;郑敏;王勇【作者单位】重庆医科大学基础医学院;重庆医科大学基础医学院;重庆医科大学基础医学院;重庆医科大学基础医学院;重庆医科大学基础医学院【正文语种】中文【中图分类】R329【相关文献】1.地高辛(DIG)和碱性磷酸酶标记cDNA探针检测PRSV [J], 姜玲;张红艳;张明涛;刘小梅;伏卉2.地高辛标记的cDNA探针检测GM-CSFm RNA表达 [J], 王亚平;王勇;郑敏;姜蓉;李静3.地高辛标记cDNA探针检测苹果茎痘病毒 [J], 杨俊玲;董雅凤;李世访;张尊平;何峻4.地高辛标记cDNA探针检测植物谷胱甘肽过氧化物酶基因表达及方法研究 [J], 苗雨晨;王建政;宋纯鹏5.地高辛标记cDNA探针检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 [J], 李广明;姜平;李玉峰;秦承学因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
地高辛标记及检测试剂盒说明书
仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用只能在体外使用地高辛DNA标记和检测试剂盒1和NBT/BCIP一起用于颜色检测通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910此试剂盒储存条件-15o C—-25o C此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应可检测100cm2面积的杂交膜24张指导手册2009.11版1前言1.1内容表1前言 (2)1.1内容表 (2)1.2试剂盒内容 (3)2简介 (5)2.1产品概述 (5)3步骤和所需材料 (8)3.1开始之前 (8)3.2地高辛DNA标记 (9)3.3 标记效率的测定 (11)3.4 DNA 的转移和固定 (14)3.5杂交 (16)3.6免疫检测 (18)3.7 DNA印记的洗脱和再杂交 (20)4结果 (21)4.1典型的结果 (21)5附录 (23)5.1故障排除 (23)5.2引用 (24)5.3订购信息 (25)1.2 试剂盒内容附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。
在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。
*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得2 介绍2.1 产品概况实验原则此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行检测，如人，大麦和小麦。
样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者λDNA超螺旋的DNA实验时间此表格列出了每一步实验所需的反应时间检测数量一个试剂盒足够用于：不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应和100cm2有24个斑点的检测质量控制根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。
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地高辛标记核酸探针的标
记方法
Last revision on 21 December 2020
地高辛标记核酸探针的标记方法
核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
其化学结构如图1 所示。
采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA
探针中。
RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。
寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。
1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法
1. 1 DNA 探针的标记方法
1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。
以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。
少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。
1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。
为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。
100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。
处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
1. 1. 3 切口平移法切口平移法DNA 探针技术快速简便，且已非常成熟。
先用适量的DNase I 在双链DNA 上打开若干个单链缺口，然后在E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 外切活性和聚合活性的共同作用下，在缺口的5' 端切除单链DNA 序列，随之由新合成的带有地高辛标记的脱氧核苷酸链取代。
本法适用于环形DNA 或大于1kb DNA 片段的标记。
用于原位杂交的核酸探针，通过切口平移法标记最为有效。
因为此方法可通过控制DNase I 的酶活性得到适当的缺口，从而得到长度大小适宜的探针，而探针的大小是原位杂交的一个重要参数，足够小的探针才可能穿透组织或细胞。
1. 2 寡核苷酸探针的标记方法
合成的寡核苷酸探针被广泛应用于筛选基因文库、Southern 印迹、Northern印迹、斑点印迹及原位杂交试验。
地高辛标记寡核苷酸有三种方法:3' 末端标记、5' 末端标记以及在探针3' 端加上数个DIG-11-dUTP 分子的尾巴(图2) 。
1. 2. 1 3' 末端标记法 3' 末端标记法的主要特点是在每个合成的寡核苷酸(长度为14～100bp) 的3' 末端只添加一个地高辛残基(DIG-ddU TP)。
用此方法标记寡核苷酸时,除末端转移酶外,无需其它特别的寡核苷酸合成试剂,方便快捷。
所合成的探针适合于要求探针具有较高的特异性而灵敏度一般的试验,如Southern 印迹、Northern 印迹、斑点印迹及菌落P噬菌斑杂交实验。
1. 2. 2 5' 末端标记法 5' 末端标记法是通过化学方法将地高辛标记于寡核苷酸的5' 末端。
首先在5' 末端连接上一个氨基连接臂残基,将合成的寡核苷酸纯化后,再使DIG-NHS 与5' 末端的氨基残基发生共价结合,从而形成标记探针。
这类探针的一个主要优点是其3' 端在DNA 合成反应中充当引物,使反应产物得以标记。
1. 2. 3 3' 末端加尾法 3' 末端加尾法是由末端转移酶在探针3' 末端加上数个地高辛残基的尾巴。
此方法标记的探针灵敏度较3' 末端标记法要高出10 倍左右,但由于存在长尾巴,往往会出现较严重的非特异性背景。
1. 3 RNA 探针的标记方法
通过RNA 聚合酶SP6 、T7 或T3 经体外转录可将地高辛标记于RNA 探针上。
用地高辛标记的RNA 探针具有很强的信号能力,且非特异性背景少,在Southern 印迹和Northern 印迹实验中,效果明显优于同为地高辛标记的DNA 探针,可与放射性同位素标记探针相媲美。
另外,在筛选菌落P噬菌斑及原位杂交的实验中,RNA 探针也同样具有良好的效果。
而且,由于DIG与UTP之间的键合对碱性不敏感,可通过碱处理方法得到所需大小的探针。
2 影响探针标记方法选择的因素
使用地高辛系统时,可根据地高辛系统的不同用途、所获得的用以制备探针的模板类型、以及探针可达到的灵敏度,选择探针标记方法。
总体而言,DNA 模板的纯度越高,标记的效率也越高。
在进行标记前,应使用苯酚、氯仿抽提DNA 模板。
此外,对于随机引物标记DNA 的方法而言,在标记反应之前,先将模板线性化并加热变性是至关重要的;而对寡核苷酸来说,在其3' 末端加上DIG-11-dUTP 的尾巴前,应该先经过凝胶或HPLC 纯化。
3 杂交技术
使用地高辛标记的核酸探针进行分子杂交,其杂交动力学、杂交条件与放射性同位素标记的探针相似。
探针的性质不同,杂交温度和时间也不同:DNAP不含甲酰胺:杂交温度为68 ℃,时间
≥6h ;DNAP含50 %甲酰胺:杂交温度为42 ℃,时间≥6h ;寡核苷酸P不含甲酰胺:杂交温度为54 ℃,时间1～6h ;RNA - RNA 杂交(RNA 探针) :杂交温度为68 ℃,时间≥6h ;RNA - DNA杂交(DNA 探针) :杂交温度为50 ℃,时间≥6h 。
地高辛标记探针的一个最重要的优点就是稳定性很强。
分子杂交后,杂交液中仍旧含有大量没有退火的地高辛标记探针,只要将这些剩余溶液倒回塑料试管中,分别在- 20 ℃(DNA探针) 和- 70 ℃(RNA 探针) 妥善储存,其稳定性至少可以保持一年之久。
在使用这些探针时只需解冻后加热至95 ℃,变性10min 即可。
如果杂交液中含有甲酰胺,则需68 ℃变性10min。
此外,在杂交这一环节中,为了避免探针浓度过高而产生干扰背景,有必要在正式杂交前先进行一次模拟杂交,以筛选最适的浓度。
4 地高辛标记探针的显色检测
4. 1 化学发光检测
化学发光检测能通过X 光片记录下很轻微的信号,其检测过程分四个步骤完成。
首先使用封闭剂对杂交后的膜进行处理,以阻止抗体对膜的特异性吸引,然后加入结合有碱性磷酸酶的抗地高辛半抗原的抗体(Anti-DIG-AP) ,形成酶联抗体- 半抗原复合物,再加入化学发光底物CSPD 或CDP-StarTM(Boehringer Mannheim 公司的产品) ,使其与膜上的杂交探针所结合的抗体复合物充分反应,最后在X 光片上曝光,以记录化学发光信号。
化学发光检测在尼龙膜上的效果优于在纤维素膜上的效果。
4. 2 化学显色
化学显色同化学发光检测的显色原理相同，都是通过类似ELISA 实验的程序加以检测，不同的是化学显色加入的显色底物是5-溴-4-氯-3 吲哚酚磷酸盐(也称X-磷酸盐，BCIP) 和氮蓝四唑盐(NBT)，它与酶联抗体- 半抗原(DIG) 复合物在酶促作用下发生反应，于数分钟内开始呈现蓝紫色，随时间延长，颜色逐渐变深，通常于24h 终止反应。
(责任编辑：大汉昆仑王)。