探针标记
化学生物学中的分子探针技术
化学生物学中的分子探针技术化学生物学是化学和生物学交叉领域的一个研究方向，主要研究生物分子的结构、构象、功能及其与其他分子之间的相互作用等。
而在近几年的化学生物学领域里，分子探针技术成为了一种非常重要的实验方法。
本文主要介绍分子探针技术的相关知识，以及在化学生物学中的应用。
一、分子探针技术的概念分子探针技术，又称为分子探查技术，指的是利用分子识别，结合特异性现象和化学反应等手段，对生物体中特定结构或化学组分进行定位、测量和研究的一种实验手段。
通俗来讲，就是一种可以帮助我们找到分子的“导航仪”。
二、分子探针技术的应用分子探针技术在化学生物学中的应用非常广泛，涉及到很多领域和方面，例如：1. DNA、RNA测序分子探针技术可以通过高通量测序、原位测序等方法，对DNA、RNA的序列和拷贝数进行测定。
同时可以利用不同的标记方式对特定序列进行检测，如荧光标记、放射性标记等。
2. 药物筛选分子探针技术可以通过对药物与靶分子之间相互作用的研究，快速筛选出具有生物活性且具有潜在药物作用的化合物。
这种研究方式一般可以采用亲和层析、表面等离子共振(SPR)等技术。
3. 酶活性测定分子探针技术可以通过对酶与底物之间的相互作用，测定酶的活性和底物的含量。
例如，荧光标记底物可以通过检测荧光强度的变化，判断酶的活性及底物的浓度。
4. 细胞分子定位使用分子探针技术，可以通过荧光标记等方法，直接对生物体内的物质进行定位。
例如，可使用分子探针来成像肿瘤细胞表面的分子，以便快速接收有效信息并帮助诊断和治疗。
三、分子探针技术的类型按照标方法式的不同，可以将分子探针技术分为许多不同的类型，以下是其中常用的几种。
1. 标记分子探针标记分子探针是指使用特定标记的探针，例如荧光标记、酵素标记等，以便于检测某个分子或生物组分。
例如使用荧光标记的分子，可以发出荧光信号，从而实现对分子的定位和测量。
2. 催化分子探针催化分子探针是指通过某些特定的反应机理，实现对分子或生物组分的测量和识别。
DNA3’端生物素标记
1、准备工作：A、取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。
B、取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。
如果待标记的EMSA探针为双链，95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA 探针浓度为0.5μM。
2、DNA探针的标记：Ultrapure water 29μlTdT Buffer(5X) 10μl待标记探针(1μM) 5μlBiotin-11-dUTP(5μM) 5μlTdT(10U/μl) 1μl总体积50μlA、参考上述设置反应体系。
注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。
B、用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。
37℃孵育30分钟。
C、加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
3、TdT的去除：A、探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。
B、12000-14000g离心1-2分钟。
吸取上清备用。
上清即为被生物素标记的单链DNA探针。
4、探针的纯化(选做)：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。
有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。
如需纯化，可以按照如下步骤操作：A、对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。
B、-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。
C、4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。
小心去除上清，切不可触及沉淀。
D、4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。
核酸探针的原理及应用
核酸探针的原理及应用1. 导言核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。
它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。
本文将介绍核酸探针的原理和应用。
2. 核酸探针的原理2.1 核酸杂交原理核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。
当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。
杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。
2.2 核酸标记技术核酸探针通常需要标记以便于检测。
常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。
这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。
2.3 核酸探针的设计核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。
探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。
此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。
3. 核酸探针的应用3.1 基因组学研究核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。
通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。
同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。
3.2 生物医学研究核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。
例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。
此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。
3.3 临床诊断核酸探针在临床诊断中有着广泛应用。
通过对特定的核酸序列进行检测，可以实现对疾病的早期筛查和诊断。
常见的应用包括艾滋病病毒检测、乙肝病毒检测、人类乳头瘤病毒（HPV）检测等。
核酸探针的应用具有高度特异性和灵敏性，可以提供准确的诊断结果。
4. 总结核酸探针作为一种重要的生物技术工具，具有广泛的应用前景。
分子生物学中的探针与标记
分子生物学中的探针与标记分子生物学是生物学的一个重要分支，它主要研究生物分子如何在细胞中发挥作用。
具体来说，分子生物学主要研究DNA、RNA和蛋白质等分子的结构、功能以及相互作用。
在研究这些分子的时候，探针和标记是不可或缺的工具。
探针和标记的概念探针是可供精准识别和检测某一个分子的物质。
在分子生物学中，常常需要对一些特定的序列进行检测和定位，这时就需要以这些序列为基础设计探针，用来检测它们在样本中的存在和位置。
探针的种类很多，包括DNA探针、RNA探针、蛋白质探针等。
标记是将一个分子或一组分子和另外一个化合物或分子结合起来，以便其能够被检测到或追踪。
在分子生物学中，标记也是不可或缺的工具。
标记技术主要被用来追踪、定位或者检测分子的存在与否。
常用的标记包括荧光标记、放射性标记等。
探针和标记的应用在DNA和RNA检测中，探针和标记被广泛应用。
比如，基于PCR（聚合酶链反应）技术，可以快速复制出许多相同的DNA分子。
但是，在进行PCR反应之前，需要用探针将要检测的DNA 序列标记起来。
标记后的DNA片段能够被PCR扩增。
另外，在基因芯片技术中，也广泛应用探针和标记。
基因芯片是一种高通量的检测技术，采用芯片上固定的探针对样本中的DNA进行定量分析。
在这个过程中，标记被用来标出探针（或样品）。
这种技术可以用来同时检测成千上万个基因片段的表达情况。
除了DNA和RNA检测，标记技术还应用在蛋白质检测中。
例如，放射性同位素标记常用于酶和蛋白质的研究。
这种标记使得科学家可以准确地定位和测量这些分子在细胞中的存在及其相互作用。
当然，在应用探针和标记的过程中，仍然存在一些技术难点。
比如，标记的选择需要对分子生物学的特性有深入的了解，标记的选择不当会导致结果不准确。
结语总的来说，分子生物学的探针和标记技术为生物科学家提供了有力的工具，极大地推动了分子生物学的研究进展。
在未来的探究中，随着技术的不断创新和发展，探针和标记技术将会更加准确、高效和普遍应用。
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
其化学结构如图1 所示。
采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。
RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。
寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。
《基因工程》名词解释
名词解释：1.Gene Engineering基因工程：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。
2.HGP人类基因组计划：是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。
其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。
3.Gene Therapy 基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。
.基因诊断：是利用重组DNA 技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷。
Vector载体：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。
plasmid质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。
shuttle vector穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。
质粒不相容性;同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性.multiple cloning sites，MCS多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。
能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
α-互补：LacZ’基因的互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。
粘性末端：指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。
并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。
使用荧光显微镜研究细胞器活动与交互作用的操作方法
使用荧光显微镜研究细胞器活动与交互作用的操作方法荧光显微镜是一种常用的实验工具，用于观察和研究细胞内各种生物分子的活动和相互作用。
本文将介绍使用荧光显微镜研究细胞器活动与交互作用的操作方法。
第一步：样品准备在进行荧光显微镜实验之前，首先需要准备好样品。
可以选择细胞培养物或组织切片作为观察对象。
对于细胞培养物，可以将细胞培养在培养皿中，待细胞生长至适当密度后，进行下一步操作。
对于组织切片，需要将组织切割成适当大小的薄片。
第二步：标记荧光探针为了观察细胞器的活动和交互作用，需要使用荧光探针标记目标分子。
荧光探针是一种可以与特定分子结合并发出荧光信号的化合物。
选择适当的荧光探针对目标分子进行标记。
例如，可以使用荧光染料如荧光素、荧光素同工异构体、荧光蛋白等。
第三步：荧光显微镜设置在进行实验之前，需要合理设置荧光显微镜的参数。
首先，选择适当的荧光滤光片，以过滤掉非目标波长的光线。
其次，调整荧光显微镜的聚焦和放大倍率，以获得清晰的图像。
此外，根据实验需求，可以设置时间序列拍摄或者三维成像等功能。
第四步：观察细胞器活动将标记了荧光探针的样品放置在荧光显微镜的台板上，调整焦距，观察细胞器的活动。
可以通过实时观察或者录像的方式记录下细胞器的运动轨迹和相互作用情况。
在观察过程中，可以通过调整荧光显微镜的参数来获得更清晰的图像。
第五步：数据分析观察完成后，需要对获得的图像和数据进行分析。
可以使用图像处理软件对图像进行增强、合并或者分割等处理。
通过对图像的分析，可以得到细胞器的形态、数量、分布等信息。
此外，还可以进行定量分析，如测量细胞器的大小、速度、亮度等参数，以研究细胞器的活动和交互作用。
第六步：结果解读和讨论根据数据分析的结果，可以对观察到的细胞器活动和交互作用进行解读和讨论。
可以比较不同样品或条件下的差异，探究细胞器的功能和调控机制。
此外，还可以与已有的研究结果进行对比和验证，进一步加深对细胞器活动和交互作用的理解。
地高辛标记核酸探针
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
地高辛标记的探针是一种非放射性探针。
1设计 Digoxigenin 标记探针的引物。
每种血清型在保守区域设计一对通用引物。
2 标记探针合成(引物来源上述）
（1）各血清型阳性质粒模板的扩增。
（2）利用引物，通过PCR《参照罗氏公司 PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书》，合成标记探针。
（3）电泳、回收、纯化和定量
3 核酸斑点杂交检测
（1）其他病毒核酸作对照，12种血清型PCR扩增产物。
（2）将12种探针和探针PM（混合探针）与同一血清型不同含量的核酸用常规方法进行核酸杂交。
4.显色。
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核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
第四节非放射性标记的核酸探针放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。
目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。
酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。
化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA 或RNA分子上。
非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下：一、生物素标记核酸探针方法生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。
实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。
在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。
这种标记方法称为缺口平移法。
用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。
缺口平移法标记生物素DNA探针：在硅化Eppendorf管（放入冰浴中）加下列反应液：待标记DNA 0.1μg/μl 5μl10×NTB1μlDNase I 2pg/μl 1μl消毒三蒸水3μl 总体积达10μl混匀，37℃，15min。
离心10000r/min 1min后，放入冰浴中，继续加入下列反应液：dNTP(ACG)0.5μg/ml2μlBio –11 –dUTP 0.5μg/ml2μl10×NTb4μl消毒三蒸水31μl混匀，短暂离心后，加入DNA聚合酶I（5u/μl）1μl总体积50μl混匀，14℃过夜（10h以上），加入终止液2μl经Sephadex –G –50柱分离，回收生物素标记DNA。
10×NTB配法：500mmol/l Tris –HCl, Ph7.5；100mol/L MgCl2；80mmol/L β-巯基乙醇，500μg/ml BSA。
终止液：0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA和10mmol/l Tris –H Cl (pH7.5)。
缺口平移法标记探针少量多次标记效果较好，即每次标记DNA 不超过1μ.Bio –11-dUTP要浓贮，分装，-20。
C保存，反复冻融常会降解失活。
Bio –11- dUTP贮存液：10mmol/L即100μg Bio-11-dUT P中加入11.6μl Bio-11 –dUTP稀释液，分装成3μl/支，-20℃保存。
地高辛-dUTP标记DNA也可按此法进行。
乙醇沉淀分离回收标记DNA比较方便，即加入5μl4mmol/l LiC l,125μl冷乙醇，混匀，-20℃放置30min,12000r/min离心5min，去上清，用70%乙醇和无水乙醇洗沉淀物，倒置离心管，晾干，用消毒三蒸水5μl溶解沉淀物（0.1μg/μl）-20。
C保存。
用LiCl 可较好地分离DNA和可溶性核苷酸，因为dNTPS的锂盐在乙醇中比钠盐溶解性更大。
二、光敏生物素标记核酸探针光敏生物素有一个连接臂，一端连接生物素，另一端有芳基叠氮化合物。
在可见光照射下，芳基叠氮化合物可能变成活化芳基硝基苯，很易与DNA或RNA的腺嘌呤N—7位置特异结合，大约每50个碱基结合一个生物素，所以只用于标记大于200个核苷酸的片段。
光敏生物素的醋酸盐很易溶于水，与核酸形成的共价结合很稳定。
此法有以下优点：方法简便易行，快速省时，不需昂贵的酶和dUTP等；只需光照，探针稳定，-20℃可保存12个月以上。
适用于DNA和RNA，抗体和酶等的标记。
在原位分子杂交，斑点杂交和Southern印迹杂交中应用，其特异性和灵敏性较高，价廉易购，国内已有试剂盒供应，军事医学科学院放射医学研究所马立人教授等研制和生产的光敏生物素核酸探针和检测试剂盒使用良好。
方法步骤：在一灭菌Eppendorf管中加待标记DNa 5μg/10μl，在暗室中加入5μg/5μl光敏生物素，充分混匀，插入冰浴中，置特制光源下10cm处照射20min。
加入100mmol/l Tris –HCl pH9.0, 1.0mmo l/L EDTA 10μl混匀。
再加入等体积仲丁醇，混匀。
离心1min（100 00r/min）吸去上层仲丁醇，弃去。
再加入仲丁醇25μl，重复提取游离的光敏生物素。
吸去上层无色仲丁醇后，加入5μl 3mol/L醋酸钠，充分混匀，加入冷无水酒精100μl充分混匀，沉淀标记DNA，置-20℃过夜（或-70℃15min）15000r/min离心20min，沉淀物再用70%乙醇洗一次，离心，抽干，溶于0.1mmol/l EDTA或TE中，测定探针浓度，分装，保存于-20℃。
三、生物素-补骨脂素（Biotin -psoralen）标记法生物素-补骨脂素是另一种生物素光敏物质，在长波长紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应，加成到DNA中，去除小分子后，得到生物素标记核酸探针。
此法可标记单链或双链DNA或RNA，及寡核苷酸。
灵敏度与放射性探针相当。
标记方法：取DNA或片段0. 5μg加50μlTE（pH8.0）缓冲液中，再加入5μlg生物素-补骨脂素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射20min，距离5cm，加等体积T E，移入用TE平衡的Sephadex G—50 柱（高1.0cm），离心法过柱，收集液体即为Bio –DNA探针。
四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法此法是在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基，使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA 探针。
此法优点是采用通用试剂和技术，检出敏感。
Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰，此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。
在合适的条件下，可有3%～4%的碱基被修饰。
新鲜配制亚硫酸氢钠-乙二胺混合液，两者混合液含量分别为1mol/L和3mol/l （pH6.0），加入对苯二酚，使终浓度为1mg/ml。
将DNA用超声打成500～800bp长度的片段，煮沸法变性，取1份DNA与9份上述混合液混合，42℃水浴3.5h。
用5mmol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5）在40℃下充分透析，浓缩DNA，再溶于200μl 0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5），再加入4mm ol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂，室温反应2h，用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）在40℃下充分透析，纯化，-20℃保存。
五、缺口平移法标记生物素DNA探针（二步法）取HBV质粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水补足体积至10μl，37℃，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bi o –11- dUTP各2μl，10×NBt 4μl，三蒸水补足体积至10μl,37℃，15 min；三蒸水补足体积至49μl，DNA聚合酶i 5u，混匀，14℃过夜，加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl终止反应。
已标记探针的提纯：10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (p H7.5) 150μl,2.5倍体积的95%乙醇，置液氮中15min或-20℃过夜。
1 5000r/min，离心10min，真空干燥后，溶于适量三蒸水中，即为纯化的探针，-20℃备用。
使用闭环或线性双链质粒DNA，或分离的双链DNA片段均可进行此法标记，全质粒标记敏感性较高，因为标记物可同时掺入载体D NA。
此法也可用于放射性同位素和地辛标记DNA法。
六、生物素随机引物标记探针方法以HBV DNA为例。
取HBv DNA质粒0.5μg，随机引物（Phar macia）2μg，用TE（pH8.0）补足体积至10μl；100℃，热变性5min，骤冷10min。
加10×缓冲液（500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/ L MgCl2, 10mmol/L β巯基乙醇），BSa 500μg/ml 5μl，5mmol/l d ATP/dGTP dCTP各1μl，按不同比例加入Bio –11-Dutp,和dTTP，用三蒸水补足体积至48μl，加DNA聚合酶（SABC）8u，混匀，37℃，2h，加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl，终止反应。
在随机引物标记体系中，加入不同梯度浓度比值的Bio-11-dUTP /dTTP(%)，发现二者比值明显影响探针标记率和显色灵敏度。
Bio-11 -Dutp/dTTP（%）比值为35%时，其标记率最高，显色灵敏度达0.2p g，杂交灵敏度为1～2pg。
二步法缺口平移标记HBv DNA探针，其灵敏度低于随机引物标记。
Mackeg等（Focus,1992；14：21）证实了用随机引物标记探针具有放大的效应。
随机引物中加入一定比例的d TTP，能增加HBv DNA探针的标记率和灵敏度。