地高辛随机引物法标记探针的Southern杂交技术优化
地高辛标记LEA3蛋白基因探针的制备及其在转基因草莓核酸杂交中的应用
地高辛标记LEA3蛋白基因探针的制备及其在转基因草莓核酸
杂交中的应用
王俊丽;葛会波;彭士琪;张红梅;续九如
【期刊名称】《果树学报》
【年(卷),期】2004(21)4
【摘要】用地高辛对胚胎发生晚期丰富蛋白LEA3基因片段(1.0 kh)进行了探针标记。
斑点杂交表明,该探针的检测灵敏度为5 Pg。
用地高辛标记和未标记的标准分子量DL 2000进行杂交时,只检测到2.00、1.00、0.75、0.50 kb4条杂交带。
应用LEA3探针对转基因草莓(Fragaria ananassa Duch.)进行了Southern blot分析,检测到1.0 kh杂交带,表明外源LEA3基因整合到草莓染色体上。
【总页数】3页(P331-333)
【关键词】地高辛;LEA3基因;探针标记;转基因草莓
【作者】王俊丽;葛会波;彭士琪;张红梅;续九如
【作者单位】河北大学生命科学学院;河北农业大学园艺学院;北京林业大学生物科学与技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】S668.4
【相关文献】
1.转基因油菜地高辛标记DNA探针杂交检测方法的建立 [J], 刘烜;郑文杰;赵卫东;贺艳;唐丹舟;刘辉
2.地高辛标记核酸探针技术在家兔视网膜C-sis原癌基因检测中的应用 [J], 刘旭阳
3.一种简便且灵敏的核酸杂交新方法——地高辛配基标记探针细胞原位杂交法应用于癌基因表达研究 [J], 鲍家驹;沈德瑜
4.地高辛标记核酸探针技术在家兔视网膜C－sis原癌基因检测中的应用 [J], 刘旭阳
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分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。
2.学习碱裂解法提取质粒的原理。
3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。
4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。
PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。
DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。
最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。
对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。
一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。
通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
southern步骤
一、地高辛标记DNA（一）酶切pEHH-HBV质粒1.酶切37℃过夜（时间尽量长一些，以酶切完全）体系DNA 10µgXhoⅠ6µl10×H buffer 10µlddH2O 补至100µl2.胶回收0.8%的胶，80V，50-60min，电泳buffer最好换新的会有6000bp、3182bp、2800bp三条条带3.定量（二）地高辛标记1.体系(或等比例扩大)2-4µgDNA补加ddH2O至16µl2.沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中3.充分混合DIG-High Prime(1号管)，并取4μL加入到变性DNA中，混合并简单离心。
37℃孵育过夜4.加入2μl 0.2M EDTA(pH8.0) 终止反应。
（三）标记效率检测1.将地高辛标记DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上。
取0.2µl标记的DNA，用DNA稀释液稀释1000倍，再取稀释后的DNA0.2µl，再用DNA稀释液稀释1000倍，根据计算量，点0.1-0.5pg到尼龙膜上。
同时从标记对照DNA的2-9号管中取出1μL点在尼龙膜上。
2.通过紫外交联30分钟将DNA固定在膜上。
3.将膜转移到一个装有20mL马来酸缓冲液的塑料容器中在15-25℃中振荡孵育2分钟。
4.在10mL封阻液中孵育30分钟5.在10mL抗体溶液中孵育30分钟6.用10mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟7.在10mL检测缓冲液中平衡2-5分钟8. 同western发光，将膜上带有DNA的一面朝下，放在点有1mL的随时即用的CSPD(5号管)的Parafilm膜上，孵育5分钟。
正面朝上，放在暗盒里的保鲜膜上，立即将保鲜膜另一面盖到膜上，均匀的铺平底物，且膜上不能有气泡。
9.X光片曝光15-25分钟10.如果0.1pg的点可见，那么说明标记的探针达到了预期的标记效率，能够满足杂交所需的探针浓度二、DNA转移与固定1．DNA 琼脂糖凝胶电泳(120V,30-45min)将待检DNA（DNA可做一个浓度梯度）与核酸上样缓冲液按照比例混匀后，加样于0.8%琼脂糖凝胶孔中电泳（可同时配一块添加EB的胶，以便知道DNA跑到哪个位置），估计待检样本电泳至凝胶中间部分时终止电泳，用刀片切去凝胶左上角作标记来判断凝胶的反正面。
转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化
转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化崔学强;张树珍;沈林波;冯翠莲【摘要】对甘蔗Southern杂交体系的优化，旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。
以转基因甘蔗为材料，就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面，对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。
结果表明，改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求；PCR法标记探针的效率较随机引物法标记探针的效率高，更适合用于Southern杂交；40μg的DNA在400μL酶切体系中，酶切10 h可获得良好的酶切效果；杂交温度40℃，杂交18 h，可获得清晰的杂交条带。
%Using sugarcane as materials, the DIG-labeled Southern blot was optimized through several key aspects:the comparison of different-labeled probe methods, extraction of sugarcane genome DNA, the amount of enzyme digestion of genome DNA, enzyme digestion time and a serial of procedures in the process of the hybrid. The results showed that sugarcane DNA extracted by the improved CTAB method met the requirements of the latter experiments, the efficiency of PCR-labeled probe was higher than that of random primer-labeled probe, so PCR-labeled probe method was suitable for the Southern blot, 40μg DNA samples in enzyme digestion system of 400μL for 10 hours could achieved desirable digestionresult;while hybrid temperature was 40℃ and hybridizing time was 18 h, a clear hybridization band could be observed. The optimization of sugarcane Southern blot provides a reference for the analysis of Southern blot of transgenic sugarcane.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】5页(P105-109)【关键词】甘蔗;Southern杂交;地高辛;PCR法标记探针;酶切【作者】崔学强;张树珍;沈林波;冯翠莲【作者单位】海南大学农学院，海口 570228; 中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗研究中心农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗研究中心农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗研究中心农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗研究中心农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101【正文语种】中文Southern印迹杂交是一种在分子生物学研究中用来检测基因组DNA中特定序列的通用方法，是研究DNA图谱的基本技术。
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
其化学结构如图1 所示。
采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。
RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。
寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。
具体了解Southern杂交技术
Southern Blotting的过程
1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交、杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测
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四、Southern杂交的应用
– DNA指纹分析
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滤膜（固相）杂交
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一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类： ③ 膜 杂 交 ： 用 标 记 DNA
或RNA探针检测固定在 硝酸纤维素（NC）膜 上 的 DNA 序 列 。 Brown 等应用这一技术评估 了 爪 蟾 rRNA 基 因 的 拷 贝数。
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三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备 ③探针的种类
cDNA 探针、基因组DNA探针、寡 核苷酸探针、RNA探针等。
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三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
④放射性探针标记物
[α-*N]-dNTP 、32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、 125I(60d)、14C、131I
胶电泳 3、凝胶中DNA的变性：碱变性 4、Southern转膜：
–硝酸纤维素膜 (NC) 、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空
转移法
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三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
具体了解Southern杂交技术
三、Southern 杂交的主要步骤
第16讲
核酸分子杂交 ------Southern杂交
华南农业大学农学院《生物技术》复习题(附答案)
华南农业大学农学院《生物技术》复习题（附答案）一、有关名词遗传标记指可稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多态性形式。
遗传多态性现代遗传学中是指基因组中任何座位上的相对差异或DNA序列的差异。
形态标记简单性状的遗传（普通遗传学）细胞学标记染色体变异与细胞学特征（细胞遗传学）生化标记同工酶与电泳技术（生化遗传学）同工酶是指具有功能相同而结构及组成有差异的一类酶分子标记DNA标记，以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。
PCR 聚合酶链式反应。
是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。
RFLP 限制性片段长度多态性。
不同样品DNA经限制性酶酶解所产生片段大小的差异。
RAPD 随机扩增多态DNA。
是以一个寡聚脱氧核苷酸单链作随机引物(primer) ，通过PCR扩增基因组DNA，获得长度不同的多态性DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增片段的多态性。
SSR 简单序列重复。
是一类由几个核苷酸组成的基序（motif）为重复单元串联组成的DNA序列，广泛分布于基因组的不同位置。
AFLP 扩增片段长度多态性。
是一种通过限制性内切酶酶切DNA产生不同长度DNA片段，再结合PCR 技术来检测DNA多态性的分子标记技术。
FM遗传图谱又称遗传连锁图谱。
指反映基因组内基因(遗传标记)在染色体上线性排列顺序及其相对位置的图谱。
分子遗传图谱不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况。
作图群体是指用于遗传作图的符合孟德尔定律的分离群体。
RIL群体即重组近交系群体，是由重组近交系组成的分离群体，由F2经多代自交一粒传使后代基因组相对纯合的群体。
DH群体是由通过对F1进行花药离体培养或通过特殊技术获得单倍体植株再经染色体加倍而获得的加倍单倍体群体。
主效基因又称主基因，是一类控制质量性状的基因，其性状表现为不连续的变异。
微效基因是一类控制数量性状的基因，因此通常称为数量性状座位QTL，其性状表现为连续的变异。
人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立(1)重点
人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立(1)】目的：建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型，为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具. 方法：通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1p53mt；采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中，然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管；取其产3 wk龄子代鼠进行PCR初选，再通过Southern杂交进一步确证；利用HE染色法观察4 mo龄转基因小鼠不同组织病理变化. 结果：将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射，然后植入30只假孕母鼠的输卵管中，其中26只母鼠怀孕，移植成功率为86.67%；共出生子代鼠179只;PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因，转基因阳性小鼠比例为5.03％(9／179)，Southern杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠；随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症，鼻咽黏膜上皮灶性增生. 结论：成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠，且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生，可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段.【关键词】突变型p53基因；LMP1基因；鼻咽癌前病变；转基因小鼠0引言鼻咽癌（NPC）是我国南方常见的一种恶性肿瘤，在我国南方如广东、广西、福建、湖南等省，发病率居世界首位. 在病理学上鼻咽癌表现为低分化，而临床上则表现为高转移性，其病因、发病机制尚不十分明了. 目前对鼻咽癌的预防效果不太理想，故将鼻咽组织癌变的早期诊断治疗作为鼻咽癌二级预防的主内容具有重大意义. 缺少合适的动物模型是鼻咽癌前病变研究的主障碍，利用基因工程技术复制鼻咽癌前病变动物可为探讨鼻咽癌前病变的机制和寻找鼻咽癌前病变的防治方法提供较理想的模型.1材料和方法1.1材料双基因真核表达质粒pLMP1p53mt由本研究组在前期工作中构建［1］，包括载体pLXSN，受human cytomegalovirus启动子（PCMV）控制的p53mt基因和受EDL2启动子（PEDL2）控制的LMP1基因（图1）. 小鼠供体、受体皆为F1杂交鼠（C57BL/6J雌×CBA雄），假孕雌鼠3 mo龄，结扎雄鼠6 mo龄，上海南方模式生物研究中心繁殖，饲养于SPF级动物房.限制性内切酶SpeⅠ(大连宝生物工程有限公司)；孕马血清促性腺激素(PMSG) (天津实验动物中心); 人绒毛膜促性腺激素(HCG) (上海生化制药厂)；M2，M16胚胎培养液、透明质酸酶及矿物油（Sigma公司）； PCR试剂盒（Promega公司）；小量质粒DNA抽提试剂盒（Plasmid Mini Kit tip 20）、凝胶纯化QIAGEN试剂盒（德国QIAGEN公司）；地高辛标记试剂盒、p53mt多克隆抗体和免疫组化检测试剂盒（博士德公司）；LMP1 mAb (美国Vector公司)；其他常规试剂均为国产分析纯试剂. 用Olympus倒置显微镜和体视显微镜，显微注射系统及制针设备（日本Narishige）、胚胎培养器皿（Falcon 3037，3003）、显微注射用针自制、紫外凝胶成像系统（美国BioRad公司）、紫外分光光度计（岛津，日本）、PCR扩增仪（PE公司）、高速冷冻离心机（Sigma公司）、CO2孵箱（BINDER）、超净工作台（苏净集团安泰公司）.应用PCGENE软件包根据注射线性载体序列资料自行设计，共选取2对引物用于转基因阳性鼠鉴定，由上海生工生物工程技术公司和上海申友生物技术公司合成. 引物1用于PCR检测转基因动物体内的p53mt基因，上游序列为：5′CAAGATGTTTTACCAACTGGCC3′，含p53基因的突变位点，下游序列为：5′CAGCTCGTGGTGAGGCTCC3′，产物为504 bp. 引物2检测LMP1基因的整合，上游序列为：5′CGGAATTCATGGCGGCGGTGATCCACA3′，下游序列为：5′GATAGGATCCCTCGAGAGTGAGGCACA3′，扩增目的条带为782 bp.作者：何迎春，田道法，卢芳国，毛积芳【关键词】鼻咽癌前病变Construction of transgenic mice containing huma本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。
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4期
周长发等 :地高辛随机引物法标记探针的 Southern杂交技术优化
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合到杂交膜上 ,显色后形成小黑点或小黑块样的 背景 (如图 1) ,影响杂交结果观察 。因此必须进 一步纯化回收产物或使用 0. 22 μm 的醋酸纤维 素膜预先将杂交液过滤 ,去除标记探针中的凝胶 小颗粒 ,可极大地降低背景值 ,获得较好的杂交 结果 。
将经碱性转移液浸泡的 W aterman 3 mm 滤纸 置于真空转印仪的多孔屏之上 ,然后将膜放到滤 纸上 ,再将中部裁成方孔的塑料衬垫置于膜和多 空屏上 ,方孔的每一边略比膜窄 5 mm ,按下密封 框 ,最后将凝胶放到膜上 ,倒入碱转液 ,液体要没 过凝胶 。开启真空泵 ,调节进气阀 ,使真空度维持 在 2 in. Hg (约 50 mm 水柱 ) ,真空转印 90 m in 后 ,再将真空度调至 5 in. Hg维持 30 m in。
(OD260 /OD280 = 1. 8～2. 1) 。棉花的基因组较大 , 要获得较强的杂交信号 ,样品 DNA 量在 30μg左 右为宜 。本实验采用改良 CTAB 法 [ 10 ]提取 DNA , 延长样品在 55℃提取液中水浴时间至 3 h,提取 的棉花基因组 DNA 量大 ,完整性好 ,如图 3。提 取多个样品需通过电泳或紫外分光光度计来保证 各样品之间的 DNA 含量基本相同 ,使杂交信号强 度一致 ,有可比性 。
Technolog ica l Im provem en t of Southern Blot Using D igox igen in 2labeled Probes w ith Random 2pr im ed M ethod
ZHOU Zhang2fa1, 2 , ZHANG Rui1 , ZHANG X iao2 , LUO Shu2p ing2 , GUO San2dui1
转膜结束后 ,将尼龙膜取下 ,用 2 ×SSC浸洗 两次 ,每次 5 m in,将膜洗至中性 ,并除去膜上的杂 质及琼脂糖碎片 。 1. 4. 5 固定 (此步骤选用 ) 将湿润的尼龙膜置 于干燥的滤纸上 ,在紫外交联仪中将转有 DNA 的 一面向上 ,以 1. 2 J / cm2交联 ,或者 120℃烘烤 0. 5 h或 80℃烘烤 2 h。尼龙膜暂不杂交时 ,可在 4℃ 下保存备用 (存放时间不宜超过半年 ) 。 1. 4. 6 杂交及显影 杂交及显影过程均按照罗 氏地高辛检测试剂盒的操作手册进行 ,略有改动 。
1. 4 方法 1. 4. 1 探针标记 以质粒 pG4AB 为模板 , BT12 F和 B T12R 为引物 PCR 扩增约 1. 2 kb的 B t基因 片段 ,琼脂糖电泳回收目的片段 ,采用随机引物法 标记 B t探针 。 1. 4. 2 棉花基因组 DNA 的提取 采用改良的 CTAB 法 [ 10 ]进行提取 ,略加改动 。 1. 4. 3 样品酶切及电泳 400 μL 酶切体系中含 30 μg 棉 花 DNA、300 U 限 制 性 内 切 酶 、40 μL 10 ×buffer,加 ddH2 O 补至 400μL ,酶切 16 h后取 4μL 电泳 ,观察棉花 DNA 是否酶切彻底 。然后 加 1 /10倍体积的 3 mol/L 的乙酸钠 , 0. 6～1倍体 积预冷的异丙醇 ,混匀 , 12 000 g离心 10 m in,沉 淀用 35 μL ddH2 O 溶 解 , 加 5 μL 10 ×loading
Southern 杂交是分析基因结构或检测 DNA 中是否含有特定序列的有效技术之一 , 1975年由 Southern E M 首创 [ 1 ] ,取其姓氏而命名 。该方法 是对转基因植株进行分子生物学鉴定的经典方 法 ,可在 DNA 水平上检测外源基因是否转入并整 合到植物染色体上 。 Southern杂交中探针有同位 素标记或非同位素标记 ,其中非同位素标记系统 主要有地高辛标记系统和生物素标记系统 。地高 辛标记系统与生物素标记系统相比 ,地高辛一般 不存在生物体中 ,因而消除了内源性背景 。随着 化学发光底物的运用与不断的改进 ,地高辛标记 系统灵敏度不断增强 ,甚至超过放射性同位素标 记系统 [ 2, 3 ] ,因而大多数实验室已将此项技术运
用在转基因植及分子标记 [ 8 ]等研 究方面 。
因为外源基因在转基因植物基因组中的排布 形式和载体骨架的整合方式与外源基因的遗传稳 定性和生物安全性密切相关 ,而 Southern杂交能 够分析 T2DNA 和载体骨架的不同区段在转基因 生物基因组中的整合与排列方式 ,以及多拷贝外 源基因在转基因生物基因组的整合及遗传行 为 [ 9 ] ,所以我国从转基因生物的安全出发 ,要求 转基因生物安全性评价报告中要包括外源基因的 Southern杂交结果 。但 Southern 杂交步骤繁琐 , 许多适宜国内实验室的细节 、注意事项并未在地 高辛标记探针的 Southern杂交试剂盒说明书中详
中国农业科技导报 , 2009, 11 (4) : 123 - 128 Journal of Agricultural Science and Technology
地高辛随机引物法标记探针的 Southern杂交技术优化
周长发 1, 2 , 张 锐 1 , 张 晓 1 , 罗淑萍 2 , 郭三堆 1
2 结果与分析
2. 1 探针的纯化及标记效率检测 采用随机引物法标记探针 ,探针模板的纯度
和含量直接影响标记探针的纯度和标记效率 。在 琼脂糖凝胶电泳回收单一目的条带时 ,一般回收 的探针量为 10 ng～3 μg。本实验发现探针量在 300～500 ng时 ,标记的探针浓度适宜 ,杂交时能 较好地控制标记探针加入量 。探针量过低或过 高 ,可导致标记效率过低或过高 ,均不利于控制杂 交时标记探针的加入量 。
buffer轻轻 混 匀 , 65℃水 浴 10 m in, 迅 速 至 冰 上 2～5 m in。将 DNA 上样到 0. 8%凝胶孔中 , 40 V 电泳 12 h。 1. 4. 4 转膜 切大小合适的带正电荷尼龙膜 ,将 膜浸入 ddH2 O 中至完全浸湿 ,然后转入碱性转移 液中 ( 0. 4 mol/L NaOH , 1 mol/L NaCl) 至 少 5 m in,切去一角做方位标记 。将凝胶浸泡在碱性转 移缓冲液中 ,变性 30 m in,室温下轻轻震荡 。
Abstract: Southern blot using digoxigenin (D IG) 2labeled p robes w ith random 2p rimed method and chem ilum inescent detection was used to detect B t C ry1A gene of transgenic insect2resistant cotton. A serial of p rocedure was modified by purifying the D IG2labeled p robes, using op timum p robes concentration, imp roving the p rocess of vacuum transferring, hybridization and immunoassay. Finally, we achieved good Southern blot result w ith low background and high sensi2 tivity. Key words: digoxigenin; chem ilum inescent detection; transgenic p lant
从事棉花基因工程研究 。 E2mail: gsdui@mail. caas. net. cn
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中国农业科技导报
11卷
细阐述 ,致使许多实验室获得的杂交结果并不能 令人满意 。因此本研究以 6 个不同的 B t抗虫棉 品种为材料 ,参考前人方法 ,并结合大量的实践经 验 ,优化了地高辛标记探针的 Southern杂交方法 。
(1. 中国农业科学院生物技术研究所 , 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 , 北京 100081; 2. 新疆农业大学农学院 , 乌鲁木齐 830052)
摘 要 :为检测转基因抗虫棉中的 B t C ry1A 基因的表达 ,采用地高辛随机引物法标记探针 、化学发光检测的 Southern杂交技术 ,通过纯化探针 、使用最适探针浓度 、优化真空转印 、杂交及免疫检测方法等一系列优化过 程 ,最终得到背景低 、信号强的 Southern杂交结果 。 关键词 :地高辛 ;化学发光法检测 ;转基因作物 中图分类号 : Q781 文献标识码 : A 文章编号 : 100820864 (2009) 0420123206
图 1 使用未纯化的探针进行 Southern杂交 F ig. 1 Southern blotting w ith unpurified p robe. M: DNA marker; 1:线性化的阳性质粒 ; 2 ～6: B t抗虫棉 DNA; 7:非转基因棉花 DNA. M: DNA marker; 1: Positive linearized p lasm id; 2 ～6: B t
( 1. B iotechnology Research Institute, National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Imp rovement, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2. Xinjiang Agricultural University, College of Agriculture, U rumqi 830052, China)
1. 3 试剂 碱转液 : 1 mol/L NaC l, 0. 4 mol/L NaOH; 漂