应用PCR-反向斑点杂交法快速检测和鉴定常见医学真菌
PCR方法快速检测一些常见医学真菌
PCR方法快速检测一些常见医学真菌
洪少林;郭英兰;雷鹏程
【期刊名称】《中国皮肤性病学杂志》
【年(卷),期】2000(14)4
【摘要】目的为选择一种快速、敏感和特异的方法来检测临床感染的真菌。
方法选取真菌 18SrDNA序列中两个片段设计引物 ,对 12种菌株进行PCR扩增 ,均扩增出长约 3 10bp产物。
对一些临床常见细菌扩增均无反应。
对酵母相真菌白念珠菌、新生隐球菌进行敏感性实验检测。
结果发现二者PCR最小检出量均为菌体数达每个反应体系 10 3 。
本实验过程总耗时 3 6h以内。
结论本实验方法可快速特异性检测一些常见医学真菌。
【总页数】3页(P227-229)
【关键词】真菌;聚合酶链反应;检测
【作者】洪少林;郭英兰;雷鹏程
【作者单位】北京医科大学第三医院皮肤科;中国科学院微生物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R379
【相关文献】
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pcr反向点杂交检测地中海分型报告
pcr反向点杂交检测地中海分型报告PCR反向点杂交检测地中海分型报告一、引言地中海贫血是一种常见的遗传性血液病，主要分为地中海贫血（β-地中海贫血）和地中海贫血症（α-地中海贫血）。
PCR反向点杂交（PCR-RFLP）是一种常用的分子生物学方法，可用于检测地中海分型。
本报告旨在详细介绍PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用。
二、PCR反向点杂交原理1. PCR原理PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的缩写，是一种通过体外扩增DNA片段的方法。
它利用DNA聚合酶酶活性，在特定条件下，使DNA模板得到高效扩增。
2. 反向点杂交原理反向点杂交是一种基于DNA序列特异性识别的方法。
它通过将目标DNA序列与特异性引物结合，并经过适当处理后，通过电泳或其他方法进行检测。
三、PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用1. 样本采集和DNA提取需要从受检者身上采集样本，如静脉血或口腔黏膜细胞。
通过常规方法提取DNA，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增。
对于β-地中海贫血，通常选择扩增β-地中海贫血突变的片段；对于α-地中海贫血，通常选择扩增α-地中海贫血突变的片段。
3. 酶切反应将PCR产物与适当的限制性内切酶一起进行酶切反应。
限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并在该序列上切割的酶。
4. 胶电泳分析将酶切产物经过胶电泳分离，并使用合适的染料染色。
在紫外光下观察和记录胶图。
根据不同基因型的特点，可以确定受检者的地中海分型。
四、结果解读根据PCR-RFLP结果，可以得出以下结论：1. 如果在PCR-RFLP分析中观察到明显的限制性内切酶位点差异，即PCR产物经过酶切后出现不同长度的片段，可以判断受检者为地中海贫血（β-地中海贫血）或地中海贫血症（α-地中海贫血）。
2. 通过比对PCR-RFLP结果与已知标准样本的电泳图，可以进一步确定受检者的具体地中海分型。
人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)
人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测标准操作规程1.目的：规范人乳头瘤病毒（HPV）反向点杂交（RDB）基因分型检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围: PCR实验室。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献:4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书5. 内容：5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。
5.2 实验原理：选取人乳头瘤病毒（HPV）基因组保守序列为扩增靶序列，设计通用引物和特异型别探针（包括16种中高危型和3种低危型HPV）,将RNA逆转录为cDNA后，利用生物素标记的通用引物对cDNA进行PCR 扩增，得到的产物与固定在膜上的特异型别探针按照碱基互补配对的原理杂交。
若PCR产物和探针完全配对，则膜条上相应探针位置捕获到标有生物素的PCR产物，并和亲和素–辣根过氧化物酶偶联，再与四甲基联苯胺（TMB）反应呈现较强的深蓝色，若与探针不完全配对，则经严格杂交和洗涤后膜条上相应探针位置不能捕获到标有生物素的PCR产物，结果无显色反应或显很淡的背景色。
5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.3.1 标本类型：尿道分泌物、宫颈脱落细胞、疣体细胞等。
5.3.2 标本采集：5.3.2.1 道分泌物：在无菌条件下，用棉拭子伸入尿道内,旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.2 宫颈脱落细胞:在无菌条件下，用宫颈刷伸入宫颈管内2cm,旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.3 疣体细胞: 用无菌棉拭子在疣体部位刮取上皮细胞。
5.3.3 标本保存：采集的标本置于盛有1ml生理盐水的小试管中，2～8℃保存。
5.3.4 运送条件：标本长途运送时采用冰壶。
5.3.5 标本拒收标准：污染标本。
10真菌与其他病原体的分子生物学检验
分子生物学检验的临床意义：
方法简便、快速、敏感、特异 适用于：无症状携带者检测、早期诊断、流行病学调查、
基因分析、耐药检测
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2、肺炎衣原体
chlamydia pneumoniae (CP) 1989年确定，重要的人兽共患病原体 人类感染很普遍，血清学证实50~90%的成年人
IgG抗体可用于回顾性诊断，对于肺炎支原体肺炎的早期 诊断价值不大
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肺炎支原体
分子生物学检测方法
PCR, qPCR：
几乎能检测所有已知的人类致病支原体，靶序列： 16S rRNA基因可变区、保守区，P1蛋白基因区
具有很高的敏感性和特异性，且检测方法快速、便捷 但感染后肺炎支原体的持续存在、无症状的支原体携
作复杂、敏感性低、特异性不高 抗原检测： UU抗原是解脲支原体感染时被识别的主要外
膜抗原，具有种特异性。报道方法有：用酶联免疫吸附试 验、荧光标记抗体、肺炎支原体膜蛋白单克隆抗体、反向 间接血凝法，直接检测分泌物和体液中支原体抗原，具有 很高的特异度和灵敏度 血清学方法：有支原体特异性血清学检测、支原体的非特 异血清学方法，对支原体肺炎能起辅助诊断的作用，但检 测特异性抗体的方法尚不能达到早期快速诊断的目的
特异性检测出新型隐球菌 区别变种，不受治疗影响 敏感性更高，可用于痰液、支气管和肺泡灌洗液的
检测
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二、衣原体的分子生物学检验
沙眼衣原体的分子生物学检验 肺炎衣原体的分子生物学检验
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衣原体
chlamydia，原核细胞型微生物， 自然界广泛分布，专性活细胞内寄生，广泛寄
基于PCR技术的真菌分子鉴定研究
基于PCR技术的真菌分子鉴定研究近年来，真菌分子鉴定研究成为了真菌学研究中的一个热点。
在科研领域，PCR技术被广泛应用于真菌鉴定中。
通过PCR技术，可以提取和扩增真菌DNA，从而确定真菌种类。
本文将介绍基于PCR技术的真菌分子鉴定研究。
一、 PCR技术原理PCR技术全称为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种基因扩增技术。
PCR技术可以在体外通过复制DNA序列来扩增DNA，其基本原理是将所需扩增的DNA序列反复加热和降温，使得DNA链分离，然后加入适量的引物和DNA聚合酶，在一定的条件下完成扩增过程。
PCR技术可以扩增出很少量的DNA序列，并且没有DNA序列长度的限制，因此这种技术被广泛应用于生物学研究领域。
二、 PCR技术在真菌鉴定中的应用在真菌鉴定中，PCR技术主要应用于引物设计和真菌DNA扩增。
通过针对真菌特异性基因序列设计引物，可以扩增出包含这些特异性基因序列的DNA片段。
然后，将扩增出的DNA片段进行测序、比对和分析，可以确定真菌的种类和亲属关系。
引物设计是PCR技术实现真菌分子鉴定的第一步。
引物是PCR扩增的关键。
设计良好的引物可以直接影响到PCR反应的扩增效率和特异性。
现在，很多专注于真菌鉴定的研究团队已经开始以仅有的真菌分类学研究中的基因信息为基础设计引物。
基于例如核酸编码的RNA聚合酶II（rRNA基因）和鳞伞菌多糖的生物合成相关基因等真菌特异性基因序列设计了越来越多的引物。
这些引物都可以用于PCR扩增相应的真菌DNA序列。
PCR技术在真菌鉴定中的应用不仅限于引物的设计，也包括真菌DNA的扩增。
通过PCR技术扩增出来的DNA片段可以进行以下一系列实验和分析，例如测序、同源性比对和系统进化分析等。
这些实验和分析可以得出真菌的系统分类、种级别鉴定和痕迹检测等方面的信息。
三、 PCR技术优缺点PCR技术在真菌鉴定中的应用虽然方式简单，但是该技术也存在着一定的优缺点。
真菌检测方法
真菌检测方法真菌是一类微生物，广泛存在于自然界中，包括土壤、空气、水体等环境中。
在生活和生产中，真菌不仅对人类和动植物健康造成威胁，还会对食品、饮用水、药品等产品质量产生影响。
因此，对真菌的检测至关重要。
本文将介绍几种常见的真菌检测方法。
首先，传统的真菌检测方法之一是培养法。
这是一种常用的方法，通过将样品接种在含有营养物质的培养基上，利用真菌在培养基上生长繁殖的特性，观察和统计培养基上的真菌数量和种类。
这种方法简单易行，对于一些真菌种类的检测效果较好，但是需要较长的培养周期，并且对于一些难以培养的真菌种类可能无法进行检测。
其次，PCR法是一种利用聚合酶链式反应（PCR）技术进行真菌检测的方法。
这种方法可以通过扩增真菌DNA或RNA的特定片段，来检测样品中的真菌数量和种类。
PCR法具有高灵敏度和高特异性的优点，可以快速准确地进行真菌检测，尤其适用于对样品中真菌种类进行快速筛查和鉴定。
另外，生物传感器技术也被广泛应用于真菌检测领域。
生物传感器是一种利用生物元件（如酶、抗体、细胞等）与传感器技术相结合的检测方法。
通过生物元件与目标真菌的特异性反应，可以实现对真菌的快速检测和定量分析。
生物传感器技术具有检测速度快、操作简便、灵敏度高等优点，对于一些需要快速检测的场合具有很大的应用潜力。
最后，近年来，基于光学技术的真菌检测方法也得到了广泛的关注和应用。
例如，荧光显微镜技术可以通过观察样品中真菌的荧光特性来进行检测；激光散射技术则可以通过检测样品中真菌颗粒的散射光信号来实现真菌的快速检测。
这些基于光学技术的检测方法具有操作简便、检测速度快的优点，对于真菌检测领域具有重要的应用价值。
综上所述，针对不同的真菌检测需求，可以选择合适的检测方法进行应用。
传统的培养法适用于一般真菌的检测；PCR法适用于快速准确的真菌鉴定；生物传感器技术和基于光学技术的检测方法则具有快速、灵敏的特点，适用于一些需要快速检测的场合。
在实际应用中，可以根据具体的检测需求和实际情况选择合适的真菌检测方法，以确保检测结果的准确性和可靠性。
第二代杂交捕获法与pcr反向点杂交法在人乳头瘤病毒检测中的应用比较
World Latest Medicne Information (Electronic Version) 2019 Vo1.19 No.81180投稿邮箱：zuixinyixue@·医学检验·第二代杂交捕获法与PCR 反向点杂交法在人乳头瘤病毒检测中的应用比较高丽敏1，郑义2（通讯作者），徐晓涵1，白瑞1，王英红1（1.石河子大学医学院第一附属医院 妇产科，新疆 石河子 832000；2.石河子大学第一附属医院 消化内科，新疆 石河子 832000）0 引言本研究将第二代杂交捕获法与PCR 反向点杂交法在人乳头瘤病毒进行比较，分析两种方法的优缺点以及检测结果的符合率等指标，提供选择依据[1]。
1 材料与方法1.1 研究对象 以我院2016至2018年间宫颈癌手术蜡块组织为研究对象，病理类型全部为宫颈鳞癌。
1.2 方法1.2.1 DNA 抽提：采用直接裂解法抽提样本DNA [4]，每例取5 µm 蜡块组织10张加入灭菌2.0 mLEP 管中，脱蜡水化后，加入500 µl 细胞裂解液，混匀，再加入蛋白酶K ，至终浓度为100 µg/ mL ，55℃水浴过夜，95℃ 10分钟灭活蛋白酶K ，10000 rpm 室温离心15 min ，所得样本-20℃保存待用。
1.2.2 杂交捕获二代的检测方法：采用美国DIGENE HC2检测试剂盒，用其配套的DIGENE D mL 2000检测仪，严格按照说明书进行检测，以RLU/CO>1.00为阳性界定标准。
1.2.3 PCR 反向点杂交检测方法：该检测方法采用深圳亚能生物科技的PCR 反向点杂交检测试剂盒，严格按照试剂盒操作流程进行检测。
该检测方法可检测出13个高危亚型，并可具体分型。
1.3 统计学分析。
采用SPSS 17.0进行统计学数据处理，根据两种检测方法进行分组，用χ2检验进行统计学分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
真菌检测方法
真菌检测方法真菌是一类微生物，它们在自然界中广泛存在，包括在土壤、水体、空气和生物体表面等各种环境中。
一些真菌对人类健康和环境造成了威胁，因此真菌的检测和监测显得尤为重要。
本文将介绍几种常见的真菌检测方法，帮助读者更好地了解真菌检测的原理和应用。
首先，常见的真菌检测方法之一是培养法。
培养法是一种传统的真菌检测方法，通过将样品放置在含有丰富营养物质的培养基上，利用真菌在特定条件下生长和繁殖的特性，观察和鉴定真菌的种类和数量。
这种方法简单易行，可以得到较为准确的结果，但需要较长的时间，通常需要数天甚至数周才能得到结果。
其次，PCR法也是一种常用的真菌检测方法。
PCR法是一种分子生物学技术，通过扩增目标真菌的特定基因片段，从而实现对真菌的检测和鉴定。
相比于传统的培养法，PCR法具有快速、高效、灵敏度高等优点，可以在短时间内得到结果，并且可以对样品中的微量真菌进行检测，是一种非常有效的真菌检测方法。
另外，免疫学检测法也是一种常见的真菌检测方法。
免疫学检测法是利用抗体与特定真菌抗原结合的原理，通过免疫学试剂盒或免疫层析法等技术，对真菌进行快速检测和鉴定。
这种方法具有操作简便、快速、准确性高等优点，广泛应用于食品、环境、医药等领域的真菌检测中。
最后，基因测序技术也逐渐被应用于真菌检测领域。
基因测序技术可以对真菌的整个基因组进行测序，从而全面了解真菌的种类、特性和遗传信息。
这种方法能够提供更为全面和深入的真菌检测结果，对于一些复杂的真菌样品具有独特的优势，但是其成本较高，操作复杂度也较大。
综上所述，真菌检测是一项重要的工作，不同的真菌检测方法各有特点，可以根据具体的应用需求选择合适的方法进行检测。
在实际应用中，可以根据样品的特点、检测的目的和要求，综合考虑不同方法的优缺点，选择最适合的真菌检测方法，以确保检测结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的真菌检测方法能够对读者有所帮助，为真菌检测工作提供参考和指导。
反向PCR技术原理和应用
反向PCR技术原理和应用摘要：PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。
反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。
随着现代医学和分子生物学的飞速发展，该技术在各个领域都发挥着重要的作用。
关键词：反向PCR;原理;不足之处;应用反向PCR是一种多聚合酶链式反应（PCR）应用的方法，可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。
用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于P CR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。
PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。
这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。
用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。
反向PCR所扩增的片段的大小由PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4 kb。
在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。
能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板（依赖于引物）的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点（例如，互补突头连接与钝头连接）。
对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别多个碱基位点的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。
如果用反向PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。
用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。
在一些实验中，为产生对反向PC R大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4 DNA聚合酶修理（钝化）。
PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者结核分枝杆菌耐药性的价值
中国防痨杂志2021 年1月第43 卷第1期Chin J A nthuberc，Jamiai~y 2021 ,Vol. 43，No. 1• 47 ••论著•PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者结核分枝杆菌耐药性的价值刘轾彬吴敏吴小翠韩敏肖和平张青【摘要】目的评估PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性的价值。
方法收集2015 年6月至2019年1月上海市肺科医院诊治的400例复治涂阳肺结核患者的痰标本，每份标本量均不少于2 ml;每 例患者采用同一标本进行PCR-反向点杂交法MTB耐药基因检测、GeneXpen MTB/RIF检测和BACTEC MGIT 960液体培养、菌种鉴定、微孔板法药物敏感性试验(简称“药敏试验”），最终纳入357例（株）为研究对象。
以微孔 板法药敏试验结果为参考标准，评价PCR-反向点杂交法的检测效能。
结果以微孔板法药敏试验结果为参考标准.PCR-反向点杂交法检测MTB对利福平耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和值分别为 97. 5%(115/118)、97. l%(232/239)、94. 3%(115/122)、98. 7%(232/235)、97. 2%(347/357)和 0•937,对异 烟肼耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kr//少/值分别为82.5%(113/137)、99.1% (218/220)、98.3%(113/115)、90.1%(218/242)、92.7%(331/357)和 0.841，对链霉素耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和 /<«沖a 值分别为 86.5%(115A33)、99. 1%(222/224)、98, 3%(115/117)、92.5%(222/240)、94.4%(337/357)和0.877,对乙胺丁醇耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和 值分别为 60.7%(37/61)、98.6%(292/296)、90.2%(37/41)、92.4%(292/316)、92.2%(329/357)和 0.682。