利用ITS序列鉴定真菌
棉花主要真菌病害病原菌ITS—RFLP快速鉴定方法
核糖 体 Ｄ ＮＡ 中的 １ ８ Ｓ 、 ５ ． ８ Ｓ和 ２ ８ ｓ的基 因组序 列在 大 多数 生 物 中 比较 保 守 ， 在 生 物种 间变 化 小 ； 而 内转 录间隔 区 Ｉ ＴＳ １ 和Ｉ Ｔ Ｓ ２作 为非 编码 区 ， 承受 的选 择 压 力 较 小 ， 相 对 变化 较 大 ， 并 且 能 够 提供 详 尽 的系统学 分析 所需要 的可遗 传 性状 ， 既 具 有保 守 性， 又均 在 科 属 种水 平 上 有 特 异性 序 列 ， 可 以作 为 真菌 分类鉴 定 的重要 依 据之 一 。Ｉ ＴＳ ＿ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ（ Ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ —
ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｉ ｓ ｍ， 基于 Ｉ Ｔ Ｓ的 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性） 鉴 定技术 在 一些大 型 真 菌上 已经 有所 应 用ｌ ＿ ７ ｊ 。
该技术 是选 用不 同 的内切 酶 ， 对 真 菌 体 内的 核糖 体
ＲＮＡ 基 因特 征 进 行 分 子 生 物 学 的进 一 步 区 分 ， 根 据产 物多态 性分 析来 鉴定 真菌种 类 。 本 研究 以棉 花主要 病原 真 菌 大丽 轮枝 菌 、 黑白 轮 枝菌 、 立枯 丝核 菌 、 串珠镰 刀 菌 、 粉红 单 端孢 和 尖 孢镰 刀 菌为 主要检 测对 象 ， 根 据对 各 自的 Ｉ Ｔ Ｓ序 列 和不 同酶切位 点 的分析 ， 制 作可 供 比对 的参 考 电子
± 塑 ： 棉花主要真菌病害病原菌 Ｉ Ｔ Ｓ － Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ快速鉴定方法 ・２ ０ １ ３ ， ４ ０ （ １ ２ ） ： １ ３ ～１ ６
棉 花 主 要 真 菌病 害病 原 菌 Ｉ ＴＳ — ＲＦ Ｌ Ｐ快 速 鉴 定 方 法
李 志芳 ， 冯 自力 ， 赵 丽红 ， 师 勇强 ， 王玲 飞 ， 朱 荷琴
ITS测序.
（4）4℃,10000g离心15min，取沉淀，用75%乙醇洗2次， 无水乙醇洗一次，真空干燥5min；
（5）将沉淀溶解在200μL pH8.0 TE Buffer中。 注：酚-氯仿-异戊醇于棕色瓶中4℃保存。
二、PCR加样体系
真菌DNA模版 10×buffer MgCl2（25mM） dNTP（各2.5mM） 上游引物ITS1 （10μM） 下游引物ITS4 （10μM） rTaq酶（5U/μL） ddH2O 总体积
利用ITS序列鉴定未知真菌
温永芳 2015.6.12
1：ITS鉴定原理 2：PCR原理 3：电泳原理 4：具体操作
目录
形态学鉴定：菌落形态、孢子形态等
微生物鉴定 分子鉴定
细菌：16s rDNA 真菌：ITS序列
生理生化
一、 ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS
二、PCR原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶 链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、 延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子 链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在 体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序 列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方 面。
电泳仪器和试剂
电泳仪、电泳槽、灌胶模具等 琼脂糖、TEVቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ冲液、样品缓冲液
一、真菌基因组DNA提取
CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与 脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并 使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。
its引物pcr体系学则
its引物pcr体系学则
PCR（聚合酶链反应）是一种在体外复制DNA片段的技术。
ITS （内转录间隔区）是真菌分类和鉴定的一种标记。
ITS引物PCR是一种基于PCR技术使用ITS序列进行菌种分类和鉴定的方法。
ITS引物PCR体系是包含DNA模板，引物，酶和缺失DNA，反应缓冲液和其他诸如浓度和pH值等条件的反应混合物。
常见的ITS引物包括ITS1和ITS4，是从内转录间隔区序列中选择的特定引物。
PCR反应分为三步，即变性、回退和延伸。
引物与DNA模板杂交，引物延伸成DNA链，扩增目标DNA序列，不断重复该过程可得到数百万个复制的DNA片段。
ITS引物PCR技术可以在短时间内快速确定真菌的系统分类位置和物种鉴定。
它简单易行，并可用于复杂菌群的鉴定。
因此，在微生物学、生态学、农业、食品科学等领域中得到了广泛的应用。
rDNA-ITS序列分析对临床少见丝状真菌鉴定作用的评估
关键词 ： 内转 录间隔区 ； 因测序 ； 基 丝状真菌 ； 形态学鉴定
Ｅｖ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ＤＮＡ－ｎ ｅ ｎ ｌ ｔａ ｓ ｒｂ ｄ ｓ ａ ｅ ｅ ｉ ｎ ｓ ｔ ｒ ｅｓ ｆ ｒ ｍｏ ｅ ｕ ａ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｏ ｌ ｉａ ａ ｕ ｔｏ ｎ ｒ ｉ ｔ ｒ ａ ｒ ｎ ｃ ｉ ｅ ｐ ｃ ｒ ｒ ｇ ｏ ｓ ａ ａ ｇ ｔ ｏ ｌ ｃ ｌ ｒ ｉ ｅ ｔ ａ ｉ ｆ ｃ ｉ ｃ ｌ ｉ ｆ ｏ ｎ
Ｔ ｅｆ ｎ ｔ ｎ ｏ Ｌ Ｔ ｉ ｅ Ｂａ ｋ ａ ｔ — ｅ ｅ ａｉ ｇｓ ｓ ｍ ｒｐ ｙｏ ｅ ｅ ｉ ｔｅ ｎ ｏ ａ ａｉ ｅｉ ｄ ｃ ｔ ｒ ｗ ｓｈ ｌ ｆ ｌ ｏ ｈ ｃ ｉ ｆ ＡＳ Ｇ ｎ ｎ ｕ ｏ ｇ ｎ ｒｔ ｙ ｔ ｆ ｈ ｌｇ ｎ ｔ ｒ ｅａ ｄ ｃ ｍｐ ｒ ｔ ｉ ａｏ ｓ ａ ｅ ｐ ｕ ｕ ｏ Ｂ ｎ ｎ ｅ ｏ ｃ ｖ ｎ ｔ ｄ ｔ ｒ ｎ ｈ ｉｈ ｈ ｍｏ ｏ ｏ ｓｓ ｑ ｅ ｃ ｓ Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｕ ｄ ｂ ｏ ａ ｅ ｉ ｈ ｒ ｈ ｌ ｇｃ ｌｉｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ａ ｄ ｔｅ ｅ ｅｍｉ ｅ ｔ ｅ ｈｇ ｏ ｌｇ ｕ ｅ ｕ ｎ ｅ ． ｈ ｅ ｕｔ ｓ ｏ ｌ ｅ ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗ ｔ ｔｅ ｍｏｐ ｏ ｏ ｉａ ｄ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｈ ｓ ｈ ｉ ｆ ｏ
ｃ ａ ａｔ ｎ Ｐ Ｒ）ａ ｐｉｃｔ ｎ ｎ ｈ Ｃ ｒｄｃｓｗ ｒ ｓｑｅ ｃｄ ａｄｃｍ ａｅ ｉ ｈ ａａｉ ｅＢ ｎ ． ｈ ｉ ｒ ｃｉ （ Ｃ ｎｅ ｏ ｍ ｌ ａ ｏ ，ａｄｔｅＰ Ｒ ｐｏｕｔ ｅｅ ｅｕｎ ｅ ｎ ｏ ｐｒｄｗｔ ｔ ｄｔ ｎＧ ｎ ａ ｋ ｉ ｆ ｉ ｈ ｅ
摘要 ： 目的 评价 内转 录间隔区（Ｔ ） ＩＳ 的多态性序列分 析（Ｄ Ａ ＩＳ序列分析 ） 临床少 见丝状真 菌的鉴定 ｒＮ — Ｔ 对 作用 ， 以形态学 鉴定方 法加 以补充验证 。方法 将 ３株待检 真菌通过 聚合 酶链 反应 （ Ｃ 扩 增和基 因测 序方法 Ｐ Ｒ）
兔皮肤病原真菌的分离及其ITS序列的分析鉴定
Is ola tion of R abbit Derma tophyte s a nd Ana lys is a nd Ide ntifica tion of The irITS Se quence sLI Ming-yong ，M U Te ，LIU Ma n ，WANG Zha o-Pe ng（Qingdao Kangda Foo d Co mp a ny L imited ，Qingda o 266400）Abstr act:[Objectiv e]Rabbit Dermatophytes were isolated and their ITS sequences were analy zed and identified.[M ethod]T he co llected scurf and scab were cultured ，and then identified by morpho log ical traits;the fung al ITS region-specific primers were used to perform amplification and sequencing of the ITS.Thro ug h the blast analysis betw een ITS sequences and GenBank nucleic acid database ，the bio logical classificatio ns were identified and finally their relationships w ere analyzed acco rding to the phylo genetic tree.[Result]T he isolated rabbit Dermato phy tes were preliminary identified as M icrosporum by morpho log ical characteristics;the results of sequence analysis and phylogenetic tree show ed that the isolated fungi and M icro spo rum gypseum strain WCH-M G001（Accession Number:GU348990.1）belo nged to one g roup w ith 99%ho molo gy ，indicating that the isolated f ungi w ere M icrosporum g ypseum.Key words:Rabbit;Dermato phyte;M icrosporum gy pseum;ITSsequence 兔皮肤病原真菌的分离及其ITS 序列的分析鉴定李明勇，牟特，刘曼，王召朋（青岛康大食品有限公司，青岛266400）摘要:【目的】分离发病兔场皮肤真菌病的病原，并对其ITS 序列进行分析鉴定。
真菌分子生物学鉴定方法
真菌分子生物学鉴定方法
真菌的分子生物学鉴定方法通常包括以下步骤：
DNA 提取：首先需要从真菌样本中提取DNA。
这可以通过商业DNA 提取试剂盒或自制的DNA 提取方法来实现。
PCR 反应：利用聚合酶链反应（PCR）扩增特定的真菌基因片段。
常用的标记基因包括核糖体RNA基因（rRNA）和线粒体DNA等。
对于真菌，常用的靶标基因包括18S rRNA、ITS（内转录间隔区）和28S rRNA等。
测序：对扩增得到的DNA片段进行测序，可以使用Sanger测序或者更先进的下一代测序技术。
序列分析：将测序得到的DNA序列与数据库中的真菌序列进行比对，以确定真菌的物种。
常用的数据库包括GenBank、UNITE等。
构建系统发育树：利用比对后的序列数据构建系统发育树，以了解真菌的亲缘关系和分类位置。
基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品
基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品张嘉丽;黄宇航;宋明;任阳阳;张梦婷;刘霞;孙伟;陈士林【摘要】目的:运用ITS序列鉴别真菌类药材马勃Lasiosphaera calvatia及其混伪品.方法:收集来自重庆、北京等9个地方的21份脱皮马勃、大马勃、紫色马勃样品,提取基因组DNA,经PCR扩增后双向测序.同时从GenBank上下载常见马勃药材混伪品的序列.将所有序列进行剪切校准拼接后分析,基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算马勃及其混伪品的种内和种间遗传距离,并构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树.结果:大马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0;脱皮马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0.003;紫色马勃的ITS序列种内最大遗传距离为0.003.大马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.019,脱皮马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.031,紫色马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.634.大马勃、脱皮马勃、紫色马勃的种内最大遗传距离均小于它们与混伪品的种间最小遗传距离.NJ树结果显示大马勃、紫色马勃、脱皮马勃各自聚为一支,表现出良好的单系性,能够与混伪品明显的区别开来.结论:基于ITS序列的条形码技术可以将马勃药材及其混伪品有效进行鉴别.【期刊名称】《世界中医药》【年(卷),期】2016(011)005【总页数】5页(P777-780,785)【关键词】马勃;混伪品;ITS;条形码【作者】张嘉丽;黄宇航;宋明;任阳阳;张梦婷;刘霞;孙伟;陈士林【作者单位】武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;安利(中国)植物研发中心,无锡,214145;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700【正文语种】中文【中图分类】R282马勃Lasiosphaera calvatia为灰包科真菌脱皮马勃Lasiosphaera fenzlii Reich.、大马勃Calvatia gigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd、紫色马勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的干燥子实体，能够清肺利咽、止血，用于治疗风热郁肺咽痛，音哑，咳嗽；外治鼻衄，创伤出血[1]。
rDNA_ITS序列分析在真菌鉴定中的应用_燕勇
[基金项目] 浙江省档案局科研项目(2007-9)[作者简介] 燕勇(1974-),男,学士,主管技师,主要从事微生物检验工作。
=论著>r DNA -I TS 序列分析在真菌鉴定中的应用燕勇,李卫平,高雯洁,沈志英,王恒辉,陈黎霞(浙江省嘉兴市疾病预防控制中心,浙江嘉兴 314050)[摘要] 目的:通过对3株真菌的rDNA -I T S 序列进行分析,以探讨、说明基于核糖体RNA 基因(即rDNA )内转录间隔区(In ternal T ranscribed Spacer ,I T S)的多态性的序列分析(rDNA -I T S 序列分析)在真菌鉴定中的应用。
方法:通过PCR扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的rDNA -ITS 序列,从GENBANK 获取相似序列,使用BLA S T 和DNAMAN 工具对r DNA -I TS 序列进行比对分析。
结果:1号真菌菌株与X y l a riales sp 1LM 40(属炭角菌目)同源性高,但尚不能鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株可鉴定到种,为草酸青霉Penic illi u m oxa li cu m;3号真菌菌株可鉴定到种内组水平,为近平滑假丝酵母III 组(最新命名为Candida m etaps il o si s)。
结论:相对于传统的真菌形态学鉴定方法,rDNA -ITS 序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但目前也存在一定的应用限制(受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种ITS 区的可变程度等影响)并不能鉴定出所有真菌,宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定。
[关键词] r DNA;内转录间隔区(ITS);PCR;测序;真菌;鉴定[中图分类号] R 44615 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2008)10-1958-04Application of r DNA I TS sequence analysis in fungus identificationYan Yong,L iW ei -p ing ,Gao W ei -jie ,Shen Zhi -y in g,W ang H eng-hui ,Chen L i -x iao (Jiax ing Cente r for D i sease Contro l and P reventi on ,Ji ax i ng 314050,Chi na)[Abstract] O bjective :T o introduce and illu m i nate t he applicati on o f r DNA I T S sequence ana l ysis i n f ungus i dentifica ti on on basis o f sequence and l eng t h poly m orph i s m s o f i nterna l transcr i bed spacer(I TS)i n ri bosoma l RNA gene(rDNA )1M ethods :T he three pend i ng fungus stra i ns c rDNA I T S sequences tested by PCR a m plifi cati on and sequenc i ng m e t hods were analyzed and co m-pared w ith si m ilar sequences fro m G E N BANK by N CB I BLAST on li ne too l and DNAMAN so ft w are 1Resu lts :N o 11f ungus stra i n had a h i gh hom ology w it h X y l a riales sp 1L M 40,bu t w as no t yet i den tifiab le on genus or spec ies l eve l o f taxonom ic c l assifi ca -ti on 1N o 12strai n w as i den tified as P en icilliu m oxalicu m,a genus l eve l 1N o 13strai n w as i dentified as Cand i da m etapsil os i s ,ne w desi gnati on of Candida parapsilosis group III ,a g roup l eve l i n spec ies re l a ti ve l y 1Conc l u si on :Compared w ith the traditiona lm or -pho l og ical i den tificati on m ethods ,the r DNA ITS sequence ana lysis i s m ore ob j ective ,ti m e-sav ing ,convenient ,and fast for fun -gus identificati on ,butw it h so m e appli ed li m its currently 1D epended on the perfecti on deg ree o f gene database ,the nu m ber o f h i gh-deg ree homo l ogy sequence ,t he var i ability ex tent of ITS reg i on of biolog ical i nd i v i duals and so on it can be app lied 1T hen ,it does not identif y all f ung ,i and shoul d be co m bi ned w ith the trad iti ona lm orpho l og i ca l identificati on m et hods for f ungus identificati on 1[K ey words] r DNA;Inte rnal transcr i bed spacer(ITS);PCR;Sequenc i ng ;F ungus ;Identifi cation 真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S r DNA 、5S r DNA 、18S rDNA 和518S r DNA 4种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。
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北 方 民 族 大 学 实 验 论 文
题 目： 利用ITS序列鉴定真菌 学 院： 生物科学与工程学院 专 业： 生物技术 班 级： 082 姓 名： 李晓飞 李 妍 吾木尔古丽 张瑞莉 陈 波 艾克拜尔 指导老师： 刘建利
完成日期：2011年5月18日——2011年6月5日 分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌
第1页 共7页 利用ITS序列鉴定真菌 李晓飞 李 妍 吾木尔古丽 张瑞莉 艾克拜尔 陈 波 （北方民族大学 生物科学与工程学院 银川 750021） 摘要：采用实验室提供的两株酵母菌，活化培养后，经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，所测序列经Genbank比对后，两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株(Sporobolomyces sp)和假丝酵母ST-50菌株（Candida sp）。 关键词：ITS序列 酵母菌 PCR 菌种鉴定 1 材料与方法 1.1试验材料与试剂 实验室提供的红色掷孢酵母菌[1]和白色产香酵母菌。 YEPD液体培养基[2]配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，配成1L溶液，分装100/250ml，121℃灭菌15min。 裂解液[3]：1L裂解液中需加Tris1.2114g，EDTA8.767g，SDS5g，用1M的NaOH调至8.0，121℃灭菌30min备用。 醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。 氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。 70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。 10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。 1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。 1.2主要仪器与设备 表一 实验中使用的主要仪器 仪器名称 型号 产地 立式自控高压蒸汽灭菌器 LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂 数显恒温水浴锅 HH-4 国华电器有限公司 电泳仪 DYY-12 北京市六一仪器厂 制冰机 AF200PSC50R ΜSA 生物安全柜 HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司 电冰箱 BCD-219D 青岛海尔股份有限公司 Sigma高速离心机 3K30 Germany 电子精密天平 HR-200 上海精科天平 酸度计 DELTA302 上海 电子可调电炉 101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司 双层恒温振荡器 THZ-9511K 太仓市实验设备厂 紫外分析仪 WD-9403C 北京市六一仪器厂 台式常温高速离心机 Centrifuge 5415D Germany 微量移液器 多型号 Germany 生化培养箱 LRH-250 上海一恒科技有限公司 基因扩增仪 Palm-Cyeler Aμstralia 电泳槽 DYCZ-24A 北京六一仪器厂 分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌 第2页 共7页 1.3实验方法 1.3.1酵母菌的活化及培养 采用本实验楼4楼保藏的红色掷孢酵母菌和白色产香酵母菌[4]，先将菌株接于斜面中，25℃培养24h，再转接入三角瓶中100ml/250ml，25℃培养24h，保存于4℃冰箱备用[5]。 1.3.2酵母菌基因组DNA的提取 DNA的提取按照Makimura等[6]（1994）的方法进行。 ⑴ 用移液器吸取1ml菌液，置于已灭菌的1.5ml的离心管内，常温下12000rpm离心1min，弃上清； ⑵加入250μl裂解液； ⑶100℃水浴15min； ⑷加入250μl 2.5M的醋酸钾后，置于冰上30min至1h； ⑸在4℃下13000rpm离心5min，上清夜移至一新1.5ml离心管内； ⑹加入500μl的氯仿-异戊醇（24：1），剧烈振荡，13000rpm，离心15min，移取上清夜至另一灭菌的1.5ml的离心管内； ⑺重复上一步，直到两相之间没有沉淀，将上清液移至另一灭菌的1.5ml的离心管内； ⑻加入500μl的冷的异丙醇，放置在-20℃静置15min； ⑼13000rpm离心15min； ⑽用1ml70%的乙醇洗涤沉淀； ⑾用1ml70%的乙醇再次洗涤沉淀； ⑿将沉淀置于室温下干燥； ⒀加入50μl已灭菌的ddH2O，在室温下溶解2h； ⒁放于-20℃冷藏备用； 1.3.3酵母菌基因组DNA的检测[7] ⑴制备琼脂糖凝胶：将10×TAE贮存液用蒸馏水稀释成1×TAE电泳缓冲液,待用，按1％称取适量琼脂糖,置于250ml锥形瓶中，加入对应量1×TAE稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水份蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复3次，至琼脂糖全部熔化，放置，待其稍冷却。 ⑵胶板的制备：将制胶槽置于水平支持物上,选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后，小心拨出梳子，将胶块取出，置于已加入足量1×TAE电泳缓冲液得电泳槽内。 ⑶加样：取20μlDNA样品与2μl6×加样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5μl的100bpDNA ladder。 ⑷电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以5V/cm（约100V）电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 ⑸成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的长波长紫外灯下观察胶块，DNA存在处显示分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌 第3页 共7页 出肉眼可辨的桔红色荧光条带，用凝胶成像系统照相(本实验中仪器损坏，直接用相机拍照)。 1.3.4 ITS片段的PCR扩增及扩增产物的检测 1.3.4.1 PCR反应体系见下表，于冰浴下进行[8]。 表二 核糖体基因反应体系的组成（25µl体系） 试剂 浓 度 体积(µl) PCR缓冲液(包含TaqDNA 聚合酶、Mg2+和dNTP) 2.5× 10
正向引物 10 µM 0.2 反向引物 10 µM 0.2 模板DNA 10 ng/µl -1 µg/µl 1.0 ddH2O 13.6
1.3.4.2 根据下表的引物和PCR反应条件对目的序列进行扩[9]。 表三 核糖体基因PCR反应所用引物和反应条件 扩增片段 引物(5’-3’) PCR扩增反应条件
ITS1区 ITS1:GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC 95℃5min；(94℃45s，52℃1min，72℃30s)×30；72℃8min。
1.3.4.3 PCR扩增产物的检测，采用琼脂糖凝胶电泳系统检测同1.3.3。 1.3.5 ITS片段的测序 将PCR扩增产物邮寄至测序公司，由测序公司完成测序。 1.3.6 BLAST比对、鉴定属、种 登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST-点击Format-得到result of BLAST。 2 结果与分析 2.1基因组DNA电泳图 图一 酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
如上图所示，标号“1”为红色掷孢酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为白色产香酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；C为对照组，无任何条带；标号“M”为Mark，共有15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp等8类DNA片段，根据原图对
1 1 2 2 C C C C M 分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌 第4页 共7页 比，本次实验只可以检测到15000、10000、7500、5000、3000、1500bp等6类DNA片段。酵母菌的基因组DNA破损片段较小，从图中可以看到，红色掷孢酵母DNA片段小于5000bp，集中于3000bp以下；而白色产香酵母的DNA片段有大于15000bp的，集中区段为5000到1500bp。ITS1片段大小为500bp左右，故这样大小的DNA片段可以满足PCR要求。 2.2PCR产物电泳图 图二 酵母菌ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
如上图所示，标号“1”为白色产香酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；“C”为对照组，物任何条带；标号“M”为Mark，共有1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp等11类DNA片段，根据原图对比，本次实验只可以检测到1500、1000、900、800、700、600、500、400bp等8类DNA片段。从图中可以看到，白色产香酵母菌和红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR产物大小均位于500-600bp之间，与预测结果相符，目的条带前端存在干扰小条带，可能为引物二聚体所致。 2.3菌株序列与鉴定结果 2.3.1红色酵母菌鉴定结果 ⑴红色酵母菌ITS1序列：共594bp。 1 tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tagtgaatct aggacgttca atttaacttg aagtccgaac 71 tctcactttc taaccctgtg catttgtttt ggttagtagg attcgtctga acacctcttc atttacaaac 141 acaaagtcta tgaatgtata aagtttataa caaaacaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca 211 tcgatgaaga acgcagcgaa atgtgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg 281 aacgcatctt gcactccttg gtattccgag gagtatgtct gtttgagtgt catgaattct tcaaccctct 351 cttttcttag tgattggagc ggagtttgga ttctgagtgt tgctcctaac ccgagctcat tcgtaatgta 421 ttagcatcca tatttgagtt tcggattgac ttggcgtaat aagactattc gctgaggaat ctaacttcgg 491 ttagaagccg tgtttgaact aggaagctac taatctagct taagtctact tttagattag acctcaaatc 561 agataggatt acccgctgaa cttaaagcat atca