分子生物学方法鉴定微生物

3. 蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应 等
4. 基因或DNA水平：核酸分子杂交、（G+C）mol%、转 化和转导、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA 核苷酸序列分析等
类别
随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的 表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平
DNA碱基比例的测定
。
G+C
▪ (G+C)mol%= A+T+G+C
X100%
通过核酸分析鉴定微生物遗传型
生物GC比的特点
• ①亲缘关系相近的种，其GC比也相近；反之，GC比相近的
两个种，它们的亲缘关系则不一定都很接近。
• ②GC比差距很大的两个种，其亲缘关系必然较远。 • ③GC比是建立新分类单元时的可靠指标
▪ GC比相差<2%时，没有分类学上的意义； ▪ GC比相差在2.5%～4.0%时，为同一种的不同菌株； ▪ GC比相差>5%时，为不同种；
分稳定的 ； 5. rRNA某些核苷酸序列非常保守，历经进化仍能保持原初 6. 相对分子量适中 原核生物rRNA：23S（2900）、16S（1540）和5S（120） 真核生物rRNA：28S（4000）、18S（2300）和5.8S（160）
核糖体构造和组分模式图
原核生物
小亚基 (30S)
大亚基 (50S)
PCR扩增步骤如下：（1）双链DNA（模板）加热变性为单链； （2）引物与模板DNA单链结合； ( 3) 引物延伸（扩增）。
通过 16S rRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定
▪ 16S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下4种： ▪ 一是将 PCR扩增后微生物16SrDNA序列，提交到GeneBank采用BLAST
▪ 使用核酸探针来鉴定或检测微生物的方法，是将探针与所检测的 细菌进行杂交。在细菌鉴定或检测临床标本中的细菌时，常用菌 落原位杂交法，大致步骤是：将细菌点种于硝酸纤维素膜上进行 培养；加溶菌剂使细胞释放出DNA分子；加变性剂使DNA离解 成单链并固定于膜上；加入带标记的核酸探针进行杂交；洗膜后 进行显色或显影鉴定。
▪ ② DNA-rRNA杂交
▪ rRNA是DNA转录的产物，在生物进化过程中，其碱基 序列的变化比基因组要慢得多，保守得多，它甚至保留 了古老祖先的一些碱基序列。因此，当两个菌株的 DNA-DNA杂交率很低或不能杂交时，用DNA-rRNA杂 交仍可能出现较高的杂交率，因而可以用来进一步比较 关系更远的菌株之间的关系，进行属和属以上等级分类 单元的分类。
▪ DNA-DNA杂交和DNA-rRNA杂交的原理和方法基本相 同，只是在技术细节上有些差异，如DNA-rRNA杂交中， 用同位素标记的是rRNA而不是DNA等等。
▪ ③ 核酸探针
▪ 广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生 物检测以及分子生物学许多领域。
▪ 所谓核酸探针(probe)是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的 一段单链DNA或RNA分子。因此，一种核苷酸片断能否作为探 针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检 测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。
利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家
Carl Woese
三、rRNA寡核苷酸编目分析
一种通过分析原核或真核细胞中最稳 定的rRNA寡核苷酸序列同源性程度，以 确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的 方法。是“三域学说”提出的科学根据。
选用rRNA做生物进化和系统分类的原因
1. rRNA普遍存在,易于提取; 2. rRNA重要恒定的生理功能; 3. 在细胞中含量高，易于提取； 4. 编码rRNA的基因在细胞中不像质粒DNA那样会转移，而是十
程序与已知序列进行相似性分析。GenBank将按照与测得序列的相似性 高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类。 与16S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置 ▪ 二是通过16S rRNA种属特异性的探针与 PCR产物杂交以获得微生物组 成信息。此外,探针也可以直接与样品进行原位杂交检测，通过原位杂交 不仅可以测定微生物的形态特征和丰度，而且能够分析它们的空间分布。 ▪ 三是对 PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(PCR－RFLP)，通过 观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖 体库中的数据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系， 用以揭示微生物RFLP的多样性。 ▪ 四是对PCR扩增产物进行梯度凝胶电泳分析，直接观察其多样性
▪ 根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的 探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至 更大类群范围的微生物的检测或鉴定。
例如，从一株淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)隐蔽性质 粒制备的DNA探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这 种引起人类性行为传播疾病的细菌。
▪ 用核酸探针来鉴定或检测微生物，具有准确、快速等优点，特别 是当用常规方法难于鉴定和检测时，往往更显示其优越性。
三、rRNA寡核苷酸编目分析
60年代末Woese 开始采用寡 核苷酸编目法对生物进行分 类，他通过比较各类生物细 胞的核糖体RNA(rRNA)特征 序列，认为16SrRNA及其类 似的rRNA基因序列作为生物 系统发育指标最为合适。
16S rDNA微生物鉴定流程
培养微生物
提取基因组DNA
PCR扩增16S rDNA片 段
rDNA序列测 定
分析比较
微生物之间的系统发育关系
从样品中分离提取总微生物DNA
▪ 从样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA，这是进行PCR 扩增16S rRNA的前提。
▪ 一种方法是直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培 养富集后再进行提取，另一种选择是提取微生物细胞中的 rRNA。RNA的提取技术相对于 DNA的提取较为复杂，一般 多采用提取细胞总 DNA，但也可根据情况选择提取 rRNA。
若两种或两株微生物的亲缘关系越近，则其产 生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然。
rRNA寡核苷酸编目分析
• 实验过程：
▪ 将事先用32P标记的被测菌株rRNA提纯，用可专一水解G上3’端 磷酸酯键的T1RNA酶进行水解，于是产生一系列以G为末端的长 度不一的寡核苷酸片段，接着把它们进行双向电泳分离，再用 放射自显影技术获得rRNA寡核苷酸群的指纹图谱，然后将图谱 中链长在6个核苷酸以上的寡核苷酸作序列分析，把获得的结果 按不同长度进行编目、列表。通过比较计算和分析，就可定量 地知道各被测菌株间的亲缘关系。
▪ 具体测定方法很多，按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂 交两大类。在这些方法中，有的需要用同位素标记DNA，有的 则用非同位素标记，而"复性速率法"则是通过测定单链DNA分子 复性结合的速率来计算DNA的同源性而不需要对DNA分子进行 标记。
细菌常用固相杂交法：
▪ （参照菌株）A菌
B菌（待测）
上式中，NAB是A、B两被测菌株所共同具有的“单词”的“字 母”数，而NA和NB则是两株菌分别具有的“单词”的“字母” 数。根据SAB值进行数值分析，就可推知它们之间的亲缘关系。 它的作用很大，至今Woese及其同事已对400多株细菌和放线
菌进行过分析，并从其中发现了生命的第三种形式——古细菌， 提出了生物界级分类中的“三域学说”
DNA-DNA 杂交法 DNA-rRNA 杂交法 rRNA-rRNA 杂交法
杂交同源性: >60%, 同种 >70%, 同一亚种 20%-60%, 同一属
核酸的分子杂交
▪ ① DNA-DNA杂交
▪ 基本原理：双链DNA分子加热可变性，冷却处理时，又可复性。 不仅同一菌株的DNA单链可以复性结合成双链，来自不同菌株 的DNA单链，只要二者具有同源互补的碱基序列，它们也会在 同源序列之间互补结合形成双链，这就称之为DNA-DNA分子杂 交。不同微生物之间，DNA同源程度越高，其杂交率就越高， 若两个菌株DNA分子序列完全相同，则应100%地杂交结合。
16S rRNA
21种核糖体蛋白 23S rRNA
5S rRNA 34种核糖体蛋白
真核生物
小亚基 (40S)
大亚基 (60S)
18S rRNA
33种核糖体蛋白 28S rRNA 5.8S rRNA 51种核糖体蛋白
rRNA寡核苷酸编目分析
原理：
用一种RNA水解酶水解rRNA后，产生一系列长 短不一的寡核苷酸片段，电泳分离，放射自显影技 术获得指纹图谱，确定不同长度寡核苷酸斑点在电 泳谱上的位置，找出图谱中链长在6个核苷酸以上 的寡核苷酸片段作序列分析，获得的结果进行按不 同长度进行编目、列表。通过比较、分析、计算， 就可知道各菌株间的亲缘关系大小。
通过T1RNA酶的水解，一般可使rRNA形成含有1～20个核苷 酸单位的寡核苷酸片段。如果形象地把只含一个核苷酸的片段称 为“字母”的话，则含两个以上核苷酸的片段就成了“单词”。 将含有6个“字母”以上的所有“单词”一一测定其核苷酸序列， 最后可把它们编成一部“词典”。于是，两个茵株rRNA的相似 性就可通过查阅“词典”来作比较。比较的具体方法是计算它们 间的缔合系数（associatedcoefficient）或相关系数SAB值：
三域学说及其发展 1980（Woese）
分子生物学 菌种鉴定
核酸分子杂交 16S rDNA序列分析法
全基因组序列的测定
▪ 一、DNA的碱基组成(G+C)mol%
▪ 1)DNA碱基比例的测定
AT间仅形成2个氢键， GC间可形成3个氢键。 GC值根据样品的Tm值计算。
▪ 是指（G + C）mol%值，简称“GC比”，表示
DNA分子中鸟嘌呤和胞嘧啶所占的摩尔百分比值
PCR扩增16S rRNA基因片段