微生物分类鉴定方法
微生物的鉴定(精)
引言概述：微生物的鉴定是微生物学中的一个重要课题，它涉及到鉴定和分类微生物的种类、特性和功能等方面。
微生物的鉴定对于环境保护、农业生产、医学诊断等领域起着重要的作用。
本文将从微生物的分离培养、形态学特征、生理生化特性、分子生物学鉴定和抗生素敏感性等五个大点进行详细阐述微生物的鉴定方法和技术。
正文：一、微生物的分离培养1. 选择培养基：根据待鉴定微生物的特性，选择合适的培养基，如富含营养物质的寒天培养基、蔗糖琼脂培养基等。
2. 分离培养：采用传统的分离培养方法，如涂布法、稀释法等，将微生物分离为单个菌落。
3. 纯化培养：通过多次传代培养，并观察菌落形态和特性，将单菌落转移到新的培养基上，获得纯种微生物。
二、微生物的形态学特征1. 形态学观察：利用显微镜观察微生物的形态特征，如形状、大小、颜色、胞壁结构等。
2. 细胞结构分析：通过染色方法，观察微生物的细胞结构，如细胞壁、细胞膜、核质、细胞器等。
3. 胞内含物分析：利用染色剂或特定试剂，观察微生物胞内含物，如颗粒、颜色、气泡等。
三、微生物的生理生化特性1. 新陈代谢特性：通过培养微生物在不同营养条件下的生长情况观察其代谢特性，如需氧性、产酸性、产气性等。
2. 饮食特性：测定微生物对不同营养物质的利用情况，如碳源、氮源、矿物质等。
3. 酶活性分析：应用酶学方法检测微生物体内的酶活性，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
四、微生物的分子生物学鉴定1. 16S rRNA基因测序：提取微生物的基因组DNA，并进行PCR 扩增和测序分析，根据16S rRNA基因序列比对和构建系统发育树，进行物种鉴定。
2. 基因组学方法：通过全基因组测序和比较基因组学分析，探索微生物的基因组特征，如基因组大小、基因编码等。
3. 荧光原位杂交技术：利用具有特异性的探针标记微生物的特定序列，通过荧光显微镜观察微生物的存在和分布情况。
五、微生物的抗生素敏感性1. 抗生素敏感试验：采用纸片扩散法或高通量平板法，将不同浓度的抗生素施加在微生物生长培养板上，观察不同抗生素对微生物生长的影响。
微生物分类鉴定方法
微生物分类鉴定方法
微生物分类鉴定方法是指利用生物学和化学原理,对微生物进行分类和鉴定的方法。
随着微生物学的不断发展,微生物分类鉴定方法也在不断更新和完善。
下面将介绍几种常见的微生物分类鉴定方法。
1. 双盲分离法
双盲分离法是指将待分类的微生物样本随机分成两组,一组用于实验,一组用于对照。
实验组和对照组分别使用不同的培养基进行培养,然后通过分离技术将两种培养基中的微生物进行分离。
通过双盲分离法可以消除实验者的主观因素,提高分类的准确性。
2. 形态学鉴定法
形态学鉴定法是指通过观察微生物的形态结构,对其分类进行鉴定的方法。
常见的形态学鉴定方法包括细胞壁结构、细胞骨架、鞭毛、伪足等特征。
通过比较不同微生物的形态结构,可以初步确定其分类方向。
3. 基因组学鉴定法
基因组学鉴定法是指通过分析微生物的基因组序列,对其分类进行鉴定的方法。
基因组学鉴定法可以通过比对微生物基因组序列,确定其属于同一类微生物的不同亚种。
该方法对于复杂微生物的鉴定和分析非常有用。
4. 代谢谱鉴定法
代谢谱鉴定法是指通过分析微生物代谢物的结构、组成和功能,对其分类进行鉴定的方法。
代谢谱鉴定法可以确定微生物的代谢途径和代谢物,从而确定其分类方向。
除了上述方法外,还有其他许多微生物分类鉴定方法,如免疫学鉴定法、荧光
法、PCR法等。
不同的分类方法有不同的优缺点,选择合适的分类方法,可以有效提高微生物分类鉴定的精度和效率。
微生物分类鉴定
第三节微生物的分类鉴定方法一、微生物鉴定的依据获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物,这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定.然后，如是原核微生物，便可根据表14—3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许,可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。
多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。
表14—3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据二、微生物鉴定的技术与方法根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平,②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平；在微生物分类学发展的早期,主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。
其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。
（一）、经典分类鉴定法经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法.其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类,并在分类中将表型特征分为主、次。
一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。
最后,采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14—4 ）。
A。
能在60 o C 以上生长B。
细胞大，宽度1.3～1.8mm ……………………………………… 1。
热微菌属（Thermomicrobium )BB。
细胞小，宽度0。
4～0。
8mmC. 能以葡萄糖为碳源生长D。
能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属（Acidothermus )DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3。
栖热菌属（Thermus ）CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属（栖热嗜狮菌属Thermoleophilum )AA。
数值分类法微生物分类鉴定的方法菌种鉴定工作的步骤
（二）细胞化学成分的鉴定
1.细胞壁的化学成分：主要是肽聚糖的基本结构
2.全细胞水解液的糖型
Байду номын сангаас
3.磷酸类脂成分的分析
4.枝菌酸的分析 5.醌类的分析 6.气相色谱技术的应用
三、数值分类法
• 数值分类法：依据数值分析的原理，借助现代电子计算机技术对拟分
类的微生物对象按大量表型性状的相似程度进行统计、归类的方法。
• 步骤： ①确定分类单元和选择分类特征； ②进行特征测定或从文献中收集有关OUT（操作分类单位）的各项特 征资料； ③根据所编制的计算机程序要求，将特征资料进行编码、标准化并输 入计算机； ④由计算机计算各OUT之间的相似性，并根据相似性的数值进行聚类 分析、分群归类； ⑤输出分类结果、常用树状谱图法表示。
4.在液体培养基中观察生长特征，液体是否混浊及混浊的程度
；液面有无菌膜；管底有无沉淀以及沉淀的形状；管中有无气泡； 培养液中有无颜色变化等。
(二) 生理生化特性
1.营养要求：可根据微生物对营养的不同利用能力来区别微生物。
试验多种营养能否被微生物作为碳源和能源利用，以及微生物对一定有 机化合物或CO2的利用能力。对于氮源来讲，看其是取自蛋白质、蛋白
数值分类法是根据生物表型特征总的相似性分类， 其分类结构的表示是一种表型关系，并不直接表示生物 的系统发育。其分类结果可作为建立或修改传统分类单 元的依据。该分类方法使生物分类从传统分类的定性描 述发展到了进行定量分析的水平，其主要目的是建立一 种客观的分类方法，并实现分类过程的自动化。
胨、氨基酸或铵盐、硝酸盐，还是大气中的游离氮。
2.代谢产物：不同的微生物，因生理特性的不同而产生不同的代谢 产物。因此，检查微生物的代谢产物，可以用来鉴别不同的微生物。在
微生物分类鉴定方法知识讲解
rRNA寡核苷酸数目
定义
一种通过分析原核或真核细胞种最稳定的rRNA寡 核苷酸序列同源性程度，以确定不同生物之间的 亲缘关系和进化谱系的方法。
rRNA寡核苷酸数目
优势
它们普遍存在于一切细胞内，不论是原核生物 和真核生物，因此可比较他们在进化中的相互 关系
他们的生理功能既重要又恒定 在细胞中的含量较高 轻易提取 编码rRNA的基因十分稳定 rRNA的某些核苷酸序列非常保守 相对分子质量适中
rRNA寡核苷酸数目
细菌
rRNA寡核苷酸数目
16S rRNA基因约含有1540个核苷酸，分可变区和 保守区，不同微生物可变区核苷酸序列不同，从 而可以利用这些特异性序列进行微生物的鉴定；
rRNA寡核苷酸数目
测定方法：
采用RNase T1酶可以将16S rRNA酶解 在G位点上切割，得到6～20个碱基大小的序列 对这些6～20碱基片段进行分离、测序 比较不同微生物之间SAB（Dice型相关系数）的相 似性。
微生物分类鉴定中的现代方法
DNA碱基比例测定 核酸分子杂交法 rRNA寡聚核苷酸编目
DNA碱基比例
DNA碱基比例是指（G+C）mol%值，简称“GC比”，它表示DNA分子中 鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的摩尔百分比值，即
（G + C）������������������% = ������+���T���++G������+������×100% 这是目前发表任何微生物新种时必须具有的重要指标。
rRNA寡核苷酸数目
测定方法：
SAB =2×NAB /（NA +NB ） NAB代表两菌所含相同寡核苷酸的碱基总数，NA 和NB分别代表两菌寡核苷酸所含碱基总数 SAB等于1，说明所比较的两菌株rRNA序列相同， 是同一进化时间的微生物，若SAB值小于 0.1， 两菌亲缘关系很远
微生物鉴别方法
微生物鉴别方法一、微生物鉴别方法——传统方法在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。
在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。
1、形态学特征（1）细胞形态在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
（2）群体形态群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。
如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。
2、生理生化反应特征（1）利用物质的能力包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。
（2）代谢产物的特殊性这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。
（3）与温度和氧气的关系测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。
对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。
3、生态学特征生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。
在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。
微生物分类鉴定方法
微生物分类鉴定方法微生物分类鉴定是微生物学领域的重要研究内容之一，它涉及到对微生物的形态、生理生化特性、遗传特征等方面进行综合鉴定和分类。
准确地鉴定和分类微生物对于了解其生态学、分子进化等方面的特征以及应用于医学、农业等领域具有重要意义。
本文将介绍几种常用的微生物分类鉴定方法。
1.形态学鉴定法：形态学鉴定法是最传统和常用的微生物分类鉴定方法。
通过观察微生物在显微镜下的形态特征，如细胞形态、细胞大小、结构特征、胞壁形态等来对微生物进行鉴定和分类。
例如，革兰氏染色可以用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；芽孢形态特征可以用于区分芽孢杆菌属和其他杆菌属等。
2.生理生化鉴定法：生理生化鉴定法是通过微生物对不同生理生化试验的反应特征来鉴定和分类微生物。
常用的试验包括碳源利用试验、氧需求性试验、双氧水试验、酸碱度试验等。
例如，氧需求性试验可以区分厌氧菌和好氧菌；双氧水试验可以区分产气乳杆菌和其他乳杆菌属。
3.免疫学鉴定法：免疫学鉴定法是通过检测微生物产生的抗原或对抗原的反应来对微生物进行鉴定和分类。
包括血清学鉴定、补体结合试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫电泳等。
例如，通过检测微生物产生的特定抗原来诊断细菌感染。
4.分子生物学鉴定法：分子生物学鉴定法是近年来发展迅速的微生物分类鉴定方法。
通过检测微生物的核酸序列来鉴定和分类微生物。
常用的方法包括PCR、序列分析、比较基因组学等。
例如，16SrRNA基因序列分析可以用于鉴定和分类细菌。
此外，还有一些综合鉴定方法，如荧光原位杂交（FISH）、质谱分析、流式细胞术等。
这些方法在微生物分类鉴定中各具特色，能够提供更准确和细致的分类信息。
总之，微生物分类鉴定方法多种多样，各种方法常常结合使用，以提高鉴定的准确性。
随着基因测序技术的发展，分子生物学鉴定方法在微生物分类鉴定中的地位越来越重要并逐渐取代了传统的鉴定方法。
对未知微生物分类鉴定的一般方法和步骤
对未知微生物分类鉴定的一般方法和步骤
x
一、动物系统分类法
1.鉴定未知微生物的分类类别：在进行分类鉴定时，首先要根据宏观形态和生理特性判断未知微生物的分类类别，一般形态特征和生理特征包括形态（大小、色泽）、营养和繁殖方式、体腔结构、细菌孢子形态等。
2.确定动物分类纲：根据未知微生物的分类类别，确定其分类系统纲名，包括属到了什么种，这个种归属于什么属，以及属属于什么科，然后可以将未知微生物很好的放到动物系统分类纲系统中。
3.准确鉴定未知物种：最后，根据未知微生物的形态特征、生理特性以及分类系统纲等信息，准确地鉴定未知物种，这也是实际的分类鉴定的最后过程。
二、分子生物学法
1.收集样本：首先，收集未知微生物样本，将其进行必要的实验检验。
2.提取DNA：通过基因工程技术，从未知微生物样本中提取出DNA 片段，以便进行分子鉴定。
3.PCR扩增：使用引物对DNA片段进行PCR扩增，以得到足够的片段区域。
4.测序：使用合成荧光标记技术，对PCR扩增出来的目的片段进行测序。
5.核酸分析：对测序出来的序列进行分析，以便判断未知微生物的种系归属。
6.结果确认：根据核酸分析结果，将得到的种系归属结果，结合实验室分析，以及实际应用环境等，最终确认鉴定结果。
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rRNA寡核苷酸数目
定义
一种通过分析原核或真核细胞种最稳定的rRNA寡 核苷酸序列同源性程度，以确定不同生物之间的 亲缘关系和进化谱系的方法。
rRNA寡核苷酸数目
优势
它们普遍存在于一切细胞内，不论是原核生物
和真核生物，因此可比较他们在进化中的相互 关系 他们的生理功能既重要又恒定 在细胞中的含量较高 轻易提取 编码rRNA的基因十分稳定 rRNA的某些核苷酸序列非常保守 相对分子质量适中
核酸分子杂交
定义
按碱基互补配对的原理，用人工方法对两条不同来源 的单链核酸进行复性，以构建新的杂合双链核酸的技 术，成为核酸杂交。包括DNA-RNA、DNA-rRNA、 rRNA-rRNA分子间的杂交。
核酸分子杂交
根据双链DNA（dsDNA）分子解链的可逆性和碱基配 对的转移性，将不同来源的待测DNA在体外分别加热 使其解链成单链DNA（ssDNA）,然后在合适条件下再 混合，使其复性并形成杂合的dsDNA，最后再测定其 间的杂交B =2×NAB /（NA +NB ） NAB代表两菌所含相同寡核苷酸的碱基总数，NA 和NB分别代表两菌寡核苷酸所含碱基总数 SAB等于1，说明所比较的两菌株rRNA序列相同， 是同一进化时间的微生物，若SAB值小于 0.1， 两菌亲缘关系很远
rRNA寡核苷酸数目
细菌
rRNA寡核苷酸数目
16S rRNA基因约含有1540个核苷酸，分可变区和 保守区，不同微生物可变区核苷酸序列不同，从 而可以利用这些特异性序列进行微生物的鉴定；
rRNA寡核苷酸数目
测定方法： 采用RNase T1酶可以将16S rRNA酶解 在G位点上切割，得到6～20个碱基大小的序列 对这些6～20碱基片段进行分离、测序 比较不同微生物之间SAB（Dice型相关系数）的相 似性。
细菌：伯杰氏鉴定细菌学手册（第八版 1974、第九版1994）、伯杰氏系统细菌 学手册（第一版）1984~1989，2000年 分五卷出版。
放线菌：中国科学院微生物研究所编著的放 线菌目分科、分属检索表
真菌：Smith、 Alexopoulos (阿历克索鲍罗 斯 ） 、 Ainsworth（安斯沃思）的分类系统
细菌自动鉴定系统
API细菌数值鉴定系统 “Enterotube”系统 “Biolog”全自动和手动 细菌鉴定系统
API细菌数值鉴定系统流程
微生物分类鉴定中的现代方法
核酸分析鉴定微生物的遗传型 细胞化学成分用作鉴定指标 （略） 数值分类法（略）
核酸分析鉴定微生物的遗传型
DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。每一种微 生物均有其自己特有的、稳定的DNA即基因组的成分和结构，不同种 微生物间基因组序列的差异程度代表着它们之间亲缘关系的远近、疏密。 因此可以用基因组的一些指标作为鉴定微生物类别的依据。
微生物分类鉴定方法
微生物分类鉴定方法
从不同层次（细胞的、分子的），用不同学科（化学、物理学、遗传学、 免疫学、分子生物等）的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细 胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资料。
在微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有分类 学意义，都可以作为分类鉴定的依据。
微生物分类鉴定中的现代方法
DNA碱基比例测定
核酸分子杂交法
rRNA寡聚核苷酸编目
DNA碱基比例
DNA碱基比例
每个生物种都有特定的 GC%范围，因此 可以作为 分类鉴定的指标。细菌的 GC%范围为25--75%，变化 范围最大，因此更适合于 细菌的分类鉴定。
DNA碱基比例
GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作 出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子 水平上判断物种的亲缘关系。 但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它 们之间具有近的亲缘关系。
微生物分类鉴定方法
流程
微生物的纯化
鉴定指标的测取
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经典分类鉴定法
现代分类鉴定法
经典微生物鉴定方法
定义 微生物分类学发展早期，主要的分类、鉴定指 标尚局限于利用常规方法鉴定微生物的形态、 构造和习性等表型特征水平上，即经典分类鉴 定方法。
经典微生物鉴定方法
鉴定指标
权威菌种鉴定手册
核酸分子杂交
rRNA寡核苷酸数目
20世纪70年代末由于美国伊利诺斯大学的C.R.Woese 等人对大量微生物和其他生物进行16s和18srRNA的寡 核苷酸测序，并比较其同源性水平后，提出了一个与 以往各种界级分类不同的新系统，称为三域学说， "域"是一个比界更高的界级分类单元，过去曾称原界。 三个域指的是细菌域(以前称"真细菌域")、古生菌域 (以前称古细菌域)和真核生物域。