菌种鉴定
菌种鉴定
细菌基因组的提取：1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。
B.加入400ul裂解液（40mM Tris-醋酸，20mM醋酸钠,1mM EDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37℃水浴1hr。
C.然后加入200ul 5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。
D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ul TE溶液中，置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep 管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
3(1) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。
(2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。
(3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。
菌种鉴定方法及手段真菌细菌检测
菌种鉴定⽅法及⼿段真菌细菌检测菌种鉴定⽅法及⼿段真菌检测/细菌检测菌种鉴定⼀般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA⽚段，上GeneBank 或者Eztaxon对⽐即可。
⼀般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌。
常规鉴定常规鉴定内容有形态特征和理化特性。
形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利⽤能⼒、各种代谢反应、酶反应和⾎清学反应等。
⾃动鉴定BIOLOG鉴定系统以微⽣物对不同碳源的利⽤情况为基础，检测微⽣物的特征指纹图谱，建⽴与微⽣物种类相对应的数据库。
通过软件将待测微⽣物与数据库参⽐，得出鉴定结果。
该系统已获美国FDA认可，已逐步应⽤于⾷品和饮品企业、环保、海洋⽣物/⽔产品、制药、农业微⽣物、⽣物治理、化妆品、临床等领域的微⽣物鉴定试验中。
拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及⾰兰⽒阴性菌、⾰兰⽒阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微⽣物。
分⼦⽣物学鉴定应⽤分⼦⽣物学⽅法从遗传进化⾓度阐明微⽣物种群之间的分类学关系，是微⽣物分类学研究普遍采⽤的鉴定⽅法。
科标⽣物检测中⼼拥有微⽣物菌种分类鉴定的分⼦⽣物学实验室，配有PCR仪、⾼速冷冻离⼼机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。
可采⽤核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。
API细菌鉴定API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种⽣化反应，已可鉴定超过600种的细菌。
鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的⽣理⽣化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参⽐，得出鉴定结果。
可应⽤API50CH系列、API20E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进⾏鉴定。
菌种鉴定
1.菌落来源：菌落来自2013年8月6号气雾剂二车间水点206
2.菌落形态描述：菌落呈金黄色，圆形凸起，边缘整齐有光泽，菌落直径约3毫米
3.革兰染色、镜检描述：菌落染成红色即革兰氏阴性菌，短杆状
4.氧化酶实验：呈红色（阳性）则为假单胞菌；无色则为肠杆菌
5.API试剂盒的选择：假单胞菌选择API 20NE;肠杆菌选择API 20E
1.菌落来源：菌落来自2013年8月6号气雾剂二车间水点206
2.菌落形态描述：菌落呈橙红色，圆形凸起，边缘整齐有光泽，菌落直径约1毫米
（注：圈住的金黄色菌落是为了对比直径）
3.革兰染色、镜检描述：菌落染成红色即革兰氏阴性菌，长杆状
4.氧化酶实验：呈红色则为假单胞菌；无色则为肠杆菌
5.API试剂盒的选择：假单胞菌选择API 20NE;肠杆菌选择API 20E
若镜检为紫色，球形，则做触媒实验，触媒实验为阴性(不产生气泡)，API试剂盒选用API Staph；触媒实验为阴性则判断非葡萄球菌。
若镜检为紫色，芽孢状
，API 试剂盒则选用API CHB/E
若镜检为较大形态的球状
，API 试剂盒则选择API C AUX。
菌种鉴定的依据
菌种鉴定的依据
菌种鉴定是微生物学研究中不可或缺的工作之一，其依据主要包括形态学特征、生理生化特性、分子生物学特征和生态学特征等。
首先，菌种鉴定的形态学特征是指菌落形态、颜色、大小、形状等在不同培养基上的特征，以及细胞形态、大小、结构和染色性质等。
其次，生理生化特性是指菌株在不同培养条件下的生长特点、代谢产物、耐受性、产酶特性等。
第三，分子生物学特征是指菌株的基因组、16S rRNA序列、DNA指纹图谱等分子水平上的特征。
最后，生态学特征是指菌株在自然环境中的分布、生态角色等特征。
这些特征都是菌种鉴定的重要依据，综合分析各种特征可以确定菌株的分类和鉴定。
- 1 -。
菌种鉴定流程课件
菌种鉴定是微生物学研究的重要基础工作 ，对于揭示微生物的生态和进化关系、探 索生命科学的基本问题具有重要意义。
02
菌种采集
采集方法
01
02
03
采集方式
根据菌种类型和特性，选 择合适的采集方式，如表 面涂抹、深层挖掘等。
采集工具
根据采集需求，准备适当 的采集工具，如铲子、刀 具、试管等。
采集环境
选择适当的采集环境，如 土壤、水源、动物粪便等 ，并确保环境无污染。
ABCD
稀释分离法
将菌液进行稀释，然后涂布在培养基上，使菌落 分散生长，达到分离纯化的目的。
温度、pH等物理因素分离法
通过调节培养温度、培养基pH等物理因素，使 特定微生物生长繁殖，达到分离纯化的目的。
分离纯化的步骤
采集样品
选择适当的样品，并确保样品无 菌操作。
选择培养基
根据分离的微生物种类选择适宜 的培养基。
采集注意事项
采集安全
在采集过程中，注意个人 安全和卫生，避免交叉感 染。
采集代表性
确保采集的菌种具有代表 性，能够反映该地区的菌 种分布和特点。
采集量控制
根据需求适量采集，避免 过度采集和破坏生态环境 。
采集后的保存
保存容器
选择适当的保存容器，如密封袋 、试管等，并确保容器无菌。
保存环境
选择适当的保存环境，如干燥、阴 凉、避光等，以保持菌种的活性。
和鉴别。
结果分析的注意事项
1 2
准确性
确保鉴定结果的准确性，避免误差和偏差。
完整性
确保鉴定结果的完整性，涵盖菌种的所有相关信 息。
3
可重复性
确保鉴定结果的可重复性，以便于验证和复现。
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是指通过对菌株样本进行系统学、形态学、生理学和生化学等各方面的观察与检测，以确定其属、种分类地位的过程。
菌种鉴定方法及步骤如下：2.制备纯培养物：分离并得到纯培养菌株，避免混杂的现象。
3.形态学观察：观察菌株的形态特征，包括菌落形态、菌落颜色、菌丝生长特征等。
4.微观形态学观察：观察菌株的细胞形态、孢子形态、菌丝形态等。
5.分类地位确定：通过对菌株的形态特征进行比对和研究，确定其属、种分类的地位。
1.生长条件观察：观察菌株在不同的生理因素（如温度、pH值、氧气含量等）下的生长情况。
2.营养需求观察：观察菌株在不同营养物质（如碳源、氮源等）的利用情况，以及对不同抗生素和化学物质的敏感性。
3.生化特征检测：进行生化试验，如氧化酶试验、氧化发酵试验、内酯酶试验等，以检测菌株的生化特征。
4.产物检测：检测菌株的代谢产物，如抗生素、酶等，以判断其代谢途径和功能。
1.提取菌株基因组DNA：通过细菌培养物提取菌株的基因组DNA。
2.PCR扩增：使用特异性引物进行PCR扩增，选择适当的靶基因进行扩增。
3.DNA测序及分析：对扩增的DNA产物进行测序，利用生物信息学方法对测序结果进行分析和比对。
4.基因序列比对：将测序结果与数据库中已知菌种的基因序列进行比对，以确定菌株的分类地位。
四、传统鉴定方法的优缺点1.优点：传统鉴定方法操作简单，成本低廉；不需要复杂设备，适用于一般实验室进行菌株鉴定。
2.缺点：传统鉴定方法对菌株鉴定仅限于形态学、生理学和生化学等方面的观察，鉴定结果存在一定的主观性和局限性；需要较长的时间才能得到鉴定结果。
五、分子生物学鉴定方法的优势1.高精确性：分子生物学鉴定方法通过对菌株的基因序列进行比对，可得到较高的精确性，减少了主观性和局限性。
2.快速性：分子生物学鉴定方法在提取DNA和PCR扩增等步骤后，可以迅速得到鉴定结果，节省了时间。
3.可靠性：分子生物学鉴定方法的结果具有较高的可靠性，有助于解决传统鉴定方法在分类地位判断方面的困难。
菌种鉴定常见问题解答
菌种鉴定常见问题解答1.菌种鉴定的方法和步骤是什么？菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon对比即可。
一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。
-----消息来源：百度问答.2. 微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗？如果你的菌株是自然界中分离得到，就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便你做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。
除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。
-----消息来源：百度问答3．为什么鉴定出来的菌种跟我想象的相差太大？答：我们菌种鉴定使用PCR直接扩增的方法，即以客户提供的菌株为模版直接进行PCR扩增，中间不经过传代培养，因此不会引入新的污染，如果出现结果不一致的情况，一般有以下原因导致：1、您提供的样品未经过三次分离纯化，含有其他杂菌；2、您提供样品的真实情况确认如此。
建议您提供三次纯化的菌株重新进行鉴定。
4．为什么有时会出现PCR扩增不出的现象；答：扩增不出的原因主要有以下几种：1、您提供的菌种从严格意义上讲不是细菌或者真菌，或者是信息有误；2、您提供的菌种为革兰氏阳性菌，由于细胞壁较厚，采用常规方法不能有效地破壁；3、培养基或菌体中表达产物含有抑制PCR产物的组份。
对于第二种或第三种情况需要提供基因组DNA。
5．PCR扩增直接测序为什么会出现套峰的现象；答：1、测序结果个别碱基出现N，是由细菌rDNA多态性造成，对菌种鉴定没有无影响；2、所有测序反应均出现大面积套峰，是由于您提供的样品模版不纯造成的。
环境微生物菌种鉴定
环境微生物菌种鉴定微生物是地球上数量最多的生物，它们在我们的生活和环境中无处不在。
为了更好地利用和保护这些微生物资源，我们需要对它们进行鉴定和分类。
本文将介绍环境微生物菌种鉴定的基本方法和应用领域。
一、微生物菌种鉴定的基本方法1、形态学鉴定形态学鉴定是根据微生物的形态、大小、颜色、生长速度等特征对其进行分类和鉴定的一种方法。
通过观察菌落的形状、大小、质地、颜色、边缘特征等，可以初步判断微生物的种类。
2、生理生化鉴定生理生化鉴定是通过测试微生物对各种底物的发酵反应和代谢产物的性质，判断其生理生化特性，从而对其进行分类和鉴定的一种方法。
常见的生理生化试验包括糖发酵试验、柠檬酸盐试验、吲哚试验等。
3、分子生物学鉴定分子生物学鉴定是基于微生物基因组序列差异对其进行分类和鉴定的方法。
该方法通过提取微生物基因组DNA，进行PCR扩增，然后进行序列比对，判断微生物的种类和亲缘关系。
二、环境微生物菌种鉴定的应用领域1、环境保护环境微生物菌种鉴定在环境保护方面具有广泛的应用。
例如，在污水处理中，通过鉴定微生物的种类和数量，可以优化污水处理工艺，提高处理效率。
在土壤污染治理中，通过鉴定能够降解特定污染物的微生物种类，可以针对性地设计生物治理方案。
2、生物多样性研究环境微生物菌种鉴定在生物多样性研究中具有重要意义。
通过对不同生态环境中的微生物进行鉴定，可以揭示不同地区和不同气候条件下的生物多样性特征，为保护生物多样性和生态平衡提供科学依据。
3、生物技术应用环境微生物菌种鉴定在生物技术领域具有广泛的应用。
例如，在生物制药中，通过鉴定微生物的种类和代谢产物，可以发现新的药物资源和开发新的药物。
在农业微生物肥料开发中，通过鉴定微生物的种类和生理生化特性，可以研制出具有特定功能的微生物肥料。
三、总结环境微生物菌种鉴定是微生物资源保护和利用的重要手段。
通过形态学、生理生化和分子生物学等方法对微生物进行分类和鉴定，可以更好地了解和利用这些资源。
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∙（1）常规鉴定
常规鉴定内容有形态特征和理化特性。
形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。
∙（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定
BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。
通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。
该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。
CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。
∙（3）分子生物学鉴定
应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。
CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、
BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。
目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S
rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。
∙（4）API细菌数值鉴定系统
API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。
鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。
CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。
∙（5）功能性分析及功能基因
CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。
应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。
∙（6）RAPD、SSCP技术
随着微生物菌种应用的进一步发展，在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加，微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。
CICC采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation
Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。
如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技术进行工业酒精酵母菌株的鉴别，此技术结合菌株发酵特性，在酒类生产的质量控制方面起到积极作用。
∙（7）TLC薄层层析
CICC将TLC薄层层析技术应用于微生物菌种鉴定，进行细菌、放线菌细胞壁化学组分分析（氨基酸、糖），作为划分属特征的重要鉴定技术手段，起到了良好的辅助作用。
∙（8）全细胞脂肪酸分析鉴定系统
采用Sherlock全自动细菌鉴定系统，通过对不同菌株的脂肪酸图谱进行分析，并与标准数据库进行比对，来鉴定细菌及酵母。
该技术是细菌或酵母种水平鉴定的有效手段之一。
∙（9）（G＋C）mol％及DNA/DNA杂交
CICC通过采用DU800核酸蛋白分析仪测定Tm值，从而得到微生物菌株的（G＋C）mol％，并与模式菌株进行DNA/DNA同源性分析，该鉴定技术手段是多相鉴定的重要组成部分。