真菌学实验指导
细菌和真菌_教案
细菌和真菌_教案教案名称：探索细菌和真菌教学目标：1.了解细菌和真菌的基本概念和特点；2.掌握不同细菌和真菌的分类；3.能够描述细菌和真菌的生长环境及其对人类的影响；4.培养学生的科学思维和实验操作能力。
教学重点：1.细菌和真菌的分类及特点；2.细菌和真菌的生长环境及其对人类的影响。
教学难点：1.如何进行实验观察和记录；2.如何通过实验验证细菌和真菌的特点。
教学准备：1.实验材料：细菌培养皿、琼脂培养基、棉签、石膏板、可见光灯、显微镜等；2.PPT课件；3.实验操作指导手册。
教学过程：Ⅰ.导入（10分钟）1.利用PPT课件引导学生回顾前一个单元所学的生物基础知识，如细胞的基本结构和功能等。
2.出示一张细菌的图片，请学生简要描述细菌的特点。
Ⅱ.细菌（30分钟）1.首先，讲解细菌的基本概念和特点。
-细菌是一类微小的单细胞生物，形态简单，体积小。
-细菌不同于真菌及其他复杂的生物，没有真核细胞结构，没有细胞核。
-细菌可以根据其形态特点进行分类，如球菌、杆菌、弧菌等。
2.接下来，进行细菌的实验观察。
-学生分组完成实验。
每组取一只细菌培养皿，插入湿润的棉签，用棉签在特定环境采集微生物样本，再将棉签划过琼脂培养基上。
-将培养皿封闭、颠倒放置，放在适宜的温度下培养24小时。
-次日，学生用显微镜观察培养皿中的细菌形态以及细菌的生长情况。
-学生记录观察结果并进行简单分析。
Ⅲ.真菌（30分钟）1.首先，讲解真菌的基本概念和特点。
-真菌是一类多细胞生物，多数为多细胞菌丝体，有些真菌是单细胞的。
-真菌通常根据其菌丝和孢子形态特点进行分类，如担子菌、子囊菌等。
2.进行真菌的实验观察。
-学生分组完成实验。
每组取一块石膏板，将其浸泡在温水中，待其湿润后，放置在暗处。
-每天观察石膏板上是否出现真菌的菌丝。
观察时间为一周。
3.结合实验结果，讨论真菌的生长环境及其对人类的影响。
-指导学生分析实验观察结果，讨论真菌的生长条件和喜好环境。
真菌观察实验报告
真菌观察实验报告真菌观察实验报告引言：真菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，它们在生态系统中扮演着重要的角色。
为了更深入地了解真菌的生态特征和生活习性，我们进行了一项真菌观察实验。
通过观察不同环境条件下真菌的生长情况和形态特征，我们希望能够对真菌的生态适应性和多样性有更全面的认识。
实验目的：1. 观察不同环境条件下真菌的生长情况；2. 分析真菌在不同环境条件下的形态特征；3. 探讨真菌的生态适应性和多样性。
实验材料：1. 真菌培养基：富含营养物质的琼脂培养基；2. 不同环境条件下的培养皿：包括高温、低温、湿润和干燥等条件；3. 放大镜和显微镜等观察工具。
实验步骤：1. 准备不同环境条件下的培养皿，分别标注好；2. 在每个培养皿中加入适量的真菌培养基；3. 从自然环境中采集真菌样本，分别放置在不同环境条件的培养皿中；4. 将培养皿放置在恒温箱或适当的环境中，保持适宜的温度和湿度；5. 每天观察并记录真菌的生长情况和形态特征；6. 持续观察一周后，结束实验并进行数据分析。
实验结果：通过观察和记录，我们得到了以下实验结果：1. 高温条件下的真菌生长情况：在高温环境下，真菌的生长速度较快，但菌丝的形态较短小，颜色较浅。
这可能是由于高温环境下真菌代谢活动加快，但也会对其生长产生一定程度的抑制作用。
2. 低温条件下的真菌生长情况：在低温环境下，真菌的生长速度较慢，菌丝的形态较长，颜色较深。
这可能是由于低温环境下真菌代谢活动减缓，导致生长速度变慢，但也能够适应寒冷环境的生存。
3. 湿润条件下的真菌生长情况：在湿润环境下，真菌的生长速度较快，菌丝的形态较丰富，颜色较鲜艳。
这可能是由于湿润环境提供了充足的水分和营养物质，有利于真菌的生长和繁殖。
4. 干燥条件下的真菌生长情况：在干燥环境下，真菌的生长速度较慢，菌丝的形态较短小，颜色较浅。
这可能是由于干燥环境缺乏水分和营养物质，对真菌的生长产生一定的限制。
实验讨论：通过这次实验，我们发现真菌对不同环境条件的适应性较强，能够在各种环境下生存和繁殖。
植物病理学高级实验技术指导
管平躺，30℃ 60rpm 2-3h。 酶解过程中应吸取菌液镜检，检查原生质体是否释放；酶液需现配现用，PH 值很
关键，需用低浓度（0.1M）的 NaOH 调 PH 至 5.8。 * 以下步骤于 4℃下完成，0.7M NaCl 溶液,1ⅹSTC 先放于 4℃预冷。 6、取出酶解液，加少许 0.7M NaCl 溶液，轻轻摇晃，倒于三层擦镜纸过滤，用 0.7M
CaCl2
4、TB3
Autoclave
3g
Yeast Extract
3g
Casamina Acids
20%
Sucrose
Add ddH2O to 1L for solid media add agar to 0.65-0.75% Autoclave 5、PTC
60% （w/v）
PEG4000 in 1ⅹSTC
第一部分 真菌学实验技术
实验一 稻瘟病菌转化（Transformation of Magnaporthe grisea）
一．原生质体的制备（Protoplasting） 1、活化菌株，接种菌丝块(2mm×2mm)于 CM 平板上生长 6d 左右，菌落直径约 3cm，
菌株不宜太老，最好不要超过 12 d。 2、切取直径约 3cm 的菌落，尽量切碎，置于约 100ml CM/5ⅹYEG 的液体培养基
Add ddH2O to 100ml Store in a dark glass bottle at 4℃
2、5ⅹ YEG
5g
Yeast Extract
10g
D-Glucose
3、1ⅹ STC
八年级生物上册《真菌》教案
八年级生物上册《真菌》教案一、教学目标1.理解真菌的基本特征、分类和生活方式。
2.掌握真菌在生态系统中的重要作用。
3.培养学生的观察能力和实验操作能力。
二、教学准备1.教材：八年级生物上册。
2.教辅资料：真菌图片、幻灯片、实验材料等。
3.实验器材：显微镜、玻璃片、培养皿等。
三、教学过程第一课时：真菌的基本特征和分类1.导入：引起学生对真菌的兴趣，如播放真菌的图片或视频。
2.讲解：介绍真菌的基本特征和分类，包括无叶绿素、多细胞、菌丝体等。
3.概念讲解：解释真菌的分类包括子囊菌、担子菌、子实菌等。
4.案例分析：给学生展示不同类型的真菌，让他们分辨其分类。
5.总结：归纳真菌的基本特征和分类。
第二课时：真菌的生活方式1.导入：复习上节课的内容，提出问题，如真菌以什么为食物？2.小组讨论：学生分成小组，讨论真菌的生活方式，并呈现给全班。
3.总结：总结不同生活方式的真菌，包括腐生真菌、植物寄生真菌等。
4.实验设计：引导学生设计观察真菌根的实验。
5.实验操作：学生根据设计的实验步骤，观察真菌根的特征。
6.实验总结：学生总结实验结果，讨论真菌根的作用和生活方式。
第三课时：真菌在生态系统中的作用1.导入：提问真菌在生态系统中的作用是什么？2.探索：学生分成小组，查找真菌在生态系统中的具体作用。
3.报告展示：每个小组呈现报告，介绍真菌在分解有机物、帮助植物吸收养分等方面的作用。
4.案例分析：给学生提供案例，让他们分析真菌对生态系统的影响。
5.总结：总结真菌在生态系统中的重要作用。
第四课时：真菌的应用和保护1.导入：提问真菌的哪些应用对人类生活有帮助？2.讲解：讲解真菌在食品制作、药物研发、环境净化等方面的应用。
3.观察实验：学生观察并描述真菌的应用范围，如在腐烂水果上的真菌。
4.讨论：学生讨论如何保护真菌资源。
5.总结：总结真菌的应用和保护措施。
四、教学评价学生自评请学生根据教学内容和实验经验，填写学生自评表，以评价课程对他们的帮助与收获。
真菌教学设计方案
一、教学目标1. 知识目标：- 了解真菌的基本结构、生命周期和分类。
- 理解真菌在自然界中的作用以及与人类生活的关系。
- 掌握真菌的鉴定方法和实验操作技能。
2. 能力目标：- 培养学生观察、比较、分析和综合的能力。
- 提高学生的实验操作技能和实验报告撰写能力。
- 培养学生的科学探究精神和团队合作意识。
3. 情感目标：- 培养学生对生物学学科的兴趣和热爱。
- 增强学生的环保意识和生态保护观念。
- 培养学生的社会责任感和使命感。
二、教学内容1. 真菌的基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核。
2. 真菌的生命周期：无性生殖、有性生殖。
3. 真菌的分类：酵母菌、霉菌、大型真菌。
4. 真菌在自然界中的作用：分解者、生产者、消费者。
5. 真菌与人类生活的关系：食品、药品、工业应用等。
6. 真菌的鉴定方法：形态学鉴定、分子生物学鉴定。
7. 真菌的实验操作：样品采集、样品处理、显微镜观察。
三、教学过程第一阶段：导入新课- 利用多媒体展示真菌的图片和视频，激发学生的学习兴趣。
- 提出问题：什么是真菌？真菌有什么特点？真菌在自然界中有什么作用？第二阶段：讲授新课1. 讲解真菌的基本结构，通过模型或实物展示，让学生直观了解。
2. 介绍真菌的生命周期，通过图示和动画，让学生理解无性生殖和有性生殖的过程。
3. 讲解真菌的分类，通过实例讲解，让学生掌握不同类别真菌的特点。
4. 分析真菌在自然界中的作用，结合实际案例，让学生认识到真菌的重要性。
5. 介绍真菌与人类生活的关系，让学生了解真菌在食品、药品、工业等领域的应用。
第三阶段：实验操作1. 样品采集：组织学生到户外采集真菌样本。
2. 样品处理：指导学生进行样本的清洗、固定和切片。
3. 显微镜观察：指导学生使用显微镜观察真菌的微观结构。
4. 实验报告撰写：要求学生根据实验结果撰写实验报告。
第四阶段：总结与反思- 组织学生进行课堂讨论，分享实验心得和发现。
- 总结本节课的学习内容，强调真菌的重要性和保护意识。
培养真菌生物实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解真菌的基本生物学特性。
2. 掌握真菌的培养方法。
3. 学习显微镜观察真菌的方法。
二、实验原理真菌是一类真核生物，具有细胞壁、细胞核、细胞质、线粒体等结构。
真菌的生物量巨大，在自然界中分布广泛，与人类生活密切相关。
真菌的培养是研究真菌生物学特性的基础，本实验旨在通过培养真菌，观察其生长状况，学习显微镜观察真菌的方法。
三、实验材料1. 真菌菌种：香菇、木耳、金针菇等。
2. 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。
3. 实验器具：无菌培养皿、无菌镊子、无菌移液器、酒精灯、显微镜、载玻片、盖玻片等。
四、实验方法1. 真菌菌种的活化（1）将菌种接种于PDA培养基上，放入恒温培养箱中培养，温度控制在25-28℃。
（2）待菌落生长到一定大小后，取出培养基，用无菌镊子将菌落挑取至新的PDA培养基上，重复操作2-3次，使菌种活化。
2. 真菌培养（1）将活化后的菌种接种于PDA培养基上，放入恒温培养箱中培养。
（2）观察菌落生长情况，记录生长时间、生长速度等数据。
3. 显微镜观察（1）将生长良好的菌落挑取至载玻片上，用盖玻片封口。
（2）将载玻片放入显微镜中，调整焦距，观察真菌的菌丝、子实体等结构。
五、实验结果与分析1. 真菌菌落的生长情况在实验过程中，不同真菌菌种在PDA培养基上的生长情况如下：（1）香菇：菌落生长迅速，菌丝白色，呈放射状分布，菌落边缘整齐。
（2）木耳：菌落生长较快，菌丝白色，呈网状分布，菌落边缘较不规则。
（3）金针菇：菌落生长较快，菌丝白色，呈束状分布，菌落边缘整齐。
2. 显微镜观察结果在显微镜下，观察到以下真菌结构：（1）香菇：菌丝细长，无色，有横隔，呈链状排列；子实体呈伞状，菌柄短，菌盖宽，表面光滑。
（2）木耳：菌丝细长，无色，有横隔，呈网状排列；子实体呈耳状，菌柄短，菌盖宽，表面不平。
（3）金针菇：菌丝细长，无色，有横隔，呈束状排列；子实体呈针状，菌柄长，菌盖小，表面光滑。
霉菌观察实验指导书
霉菌细胞的观察一、实验目的1. 观察霉菌菌丝细胞的显色结构；2. 观察霉菌细胞壁及质壁分离现象；3. 观察菌丝不同部位霉菌细胞形态；4.观察霉菌细胞核形态数目及其分布特征。
二、实验材料：1.试剂：菌丝，高浓度KCl溶液，固定液（冰乙酸，甲醇），Giema染液（Giemsa粉末，甘油，甲醇, ，PBS（磷酸二氢钾，氢氧化钠，蒸馏水，PH调至7.2），蒸馏水, 50%乙醇)）2.器材：载玻片，盖玻片，镊子，解剖针，培养皿(8)，吸水纸，吸管，染缸(8)，光学显微镜三、原理：霉菌是形成分枝菌丝的真菌的统称，不是分类学的名词，在分类上属于真菌门的各个亚门。
霉菌细胞具1至多个细胞核。
细胞壁分为三层：外层无定形的β葡聚糖（87nm)；中层是糖蛋白，蛋白质网中间填充葡聚糖（49nm)；内层是几丁质微纤维，夹杂无定形蛋白质（20nm)。
构成霉菌体的基本单位称为菌丝，呈长管状，宽度2～10微米，可不断自前端生长并分枝。
在固体基质上生长时，部分菌丝深入基质吸收养料，称为基质菌丝或营养菌丝；向空中伸展的称气生菌丝，可进一步发育为繁殖菌丝，产生孢子。
大量菌丝交织成绒毛状、絮状或网状等，称为菌丝体。
菌丝体常呈白色、褐色、灰色，或呈鲜艳的颜色（菌落为白色毛状的是毛霉，绿色的为青霉,黄色的为黄曲霉），有的可产生色素使基质着色。
霉菌繁殖迅速，常造成食品、用具大量霉腐变质，但许多有益种类已被广泛应用，是人类实践活动中最早利用和认识的一类微生物。
霉菌菌丝一般为颜色鲜艳，且菌丝为单层细胞，故可直接用于观察其显色结构、细胞壁，染色后可观察其细胞器。
四、操作步骤：1. 制片：在载玻片上加一滴蒸馏水，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的液滴中，用解剖针小心地将菌丝分散开。
（注意：挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。
）在低倍镜下找到霉菌细胞，移到视野中央，切换至高倍镜观察。
真菌学实验指导
真菌学实验指导本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。
介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。
本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。
所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。
基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。
本指导书适用于生物技术和生物科学专业。
1、实验：内生真菌的分离及鉴定···························································································3 2、实验报告基本内容要求···························································································7 3、实验报告格式································································8实验内生真菌的分离及鉴定实验学时：18实验类型：综合实验要求：选修一、实验目的1.了解真菌形态的基本特征。
2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。
二、实验内容采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。
三、实验原理、方法和手段（一）实验原理根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。
（二）实验手段和方法1、内生真菌分离纯化方法1.1样品的表面消毒及预处理分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。
老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。
对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。
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本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。
介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。
本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。
所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。
基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。
本指导书适用于生物技术和生物科学专业。
1、实验：内生真菌的分离及鉴定···························································································3 2、实验报告基本内容要求···························································································7 3、实验报告格式································································8实验内生真菌的分离及鉴定实验学时：18实验类型：综合实验要求：选修一、实验目的1.了解真菌形态的基本特征。
2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。
二、实验内容采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。
三、实验原理、方法和手段（一）实验原理根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。
（二）实验手段和方法1、内生真菌分离纯化方法1.1样品的表面消毒及预处理分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。
老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。
对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。
将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。
灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。
在快到时间之前1-2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。
灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。
灭菌液要充分浸没材料。
宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
1.2内生真菌的分离与纯化将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养5块组织块）于27℃恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。
观察菌丝生长情况及污染情况。
培养3-4天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上。
纯化3-4次以保证所得菌落为纯培养。
2、真菌的形态学鉴定方法对分离到的内生真菌的分类鉴定主要根据宏观的培养性状（菌落形态），微观的个体形态特征及一些生物学特性进行经典分类研究。
2.1 培养性状（菌落形态）培养基：查氏培养基（Czapek agar）、沙氏培养基和PDA培养基。
方法：将固体培养基制成平板，以点植法接钟，即用接种针尖沾取少量孢子点植在平板的中心位置，然后于25-28℃培养一定时间（通常为7天或14天）进行观察，观察时可用肉眼或借助放大镜等。
观察的要点：大小：以菌落的直径（mm）表示。
颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。
菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。
菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。
菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。
菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。
渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。
2.2个体形态菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑），宽度等分生孢子梗：分支情况--简单或复杂，轮生或单生等；长短；基部粗糙或光滑等。
产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互生或成轮生体）分生孢子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜链或聚集成头）2.3真菌制片方法——粘片法胶带粘贴法：选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的胶带。
取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75%乙醇固定，乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产孢结构等特征。
2.4显微摄影照片在Motic数码显微镜下，观察并选取具典型性状特征的视野拍照、直接测量相关数据和进行描述记载。
2.5菌种的鉴定根据描述的菌种的特征，索引分析相关文献，综合分析对比相关特征的异同，最后确定待定菌株的分类地位。
3、真菌的分子生物学鉴定方法3.1真菌菌丝的获得（1）固体培养基培养菌丝体对于气生菌丝较多的真菌可以选择PDA固体培养基在培养皿上培养，在固体培养基平板上铺一层玻璃纸，27℃培养5-7天。
将3-4个用培养皿平行培养的新鲜菌丝小心地刮下，收集在一起，以备进行DNA提取。
在刮取菌丝体时，要注意的是不要把培养基一起刮下来，以免对提取DNA造成影响。
（2）液体培养基培养菌丝体培养基成分与不加琼脂的PDA固体培养基成分相同。
将液体培养基以100mL每瓶分装至250mL三角瓶中，用8层纱布封口。
121℃，蒸汽灭菌20min。
将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中27℃、120rpm 培养5-7天。
用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸馏水冲洗菌丝球5次，避免培养基中的糖类和蛋白对DNA提取的影响。
40℃下烘干菌丝，但是不要过于干燥，然后进行DNA的提取。
3.2基因组DNA的提取DNA提取采用CTAB法。
CTAB（cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
CTAB 法的好处是能很好地去掉糖类杂质，提取前期可得到高含量的DNA。
用CTAB法提取材料DNA的具体步骤如下：(1) 将CTAB buffer在65℃水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；(2) 取0.1g左右菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入5mL预热的提取液及10μLβ-巯基乙醇，混合均匀后把混合液转入1.5mL离心管中700μL/管；(3) 于65℃水浴保温0.5-1h，时间不能超过1.5h。
保温期间要轻轻振摇几次；(4) 冷却至室温后，加入等体积(700μL)的饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混匀后静置10min。
(5) 离心(12000rpm，10min，室温)，去沉淀，将上清液转入干净离心管中。
(6) 根据杂质的去除情况重复步骤4、5数次，直至无杂质；(7) 加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次以去除饱和酚，离心(12000rpm，10min，室温)；(8) 将上清液逐滴加入两倍体积的-20℃预冷无水乙醇，以沉淀出DNA。
室温放置10-20min，可以过夜；(9) 挑取或离心去上清液(10000 rpm，5min)的方法取出DNA；用75%乙醇洗涤两次；(10) 37℃保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中4℃备用。
3.3多聚酶链式反应(PCR扩增)3.3.1引物ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC3.3.2扩增条件扩增体系PCR反应体系为50μL体系，包括：10×PCR buffer：1/10MgCl2 ： 1.5mM，dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）：各200μM，Primer1 0.2μM，Primer2 0.2μM，Taq酶：1~2.5U，DNA模板：约100ng。
扩增条件预变性95℃5min变性95℃1min复性51℃1min 30~35个循环延伸72℃1min延伸补齐72℃10min3.3.3扩增产物的纯化及序列的测定送测序公司。
4、保存方法将所分离的所有纯化菌株采用两种方法保存。
①斜面低温保藏法：将菌株接种至PDA固体斜面培养基上于27℃下培养，待菌落长满斜面，观察没有污染后，放于4℃的冰箱中保存。
这种保藏方法适合本实验条件下各菌种的保藏，保藏时间为三个月到六个月，传代次数过多时容易导致菌种变异退化。
②无菌水保存法：在柱形Eppendorf离心管中加入2/3体积的蒸馏水，蒸汽灭菌，将带有菌丝的琼脂小块放入无菌水中，4℃的冰箱中保存。
此法保存菌株的时间要长于斜面保存。
用这种保藏方法可以保藏1-2年。
比较而言这种方法是较好的菌种保藏方法。
四、实验组织运行要求采用“集中授课，学生自主训练为主的开放模式组织教学。
”五、实验条件仪器设备：高压蒸汽灭菌锅，培养箱，调温电炉、摇床、磁力搅拌器、15W紫外灯、超净工作台、离心机等。
1.5mL eppendorf 离心管，研钵，解剖刀，镊子，纱布，滤纸，三角瓶等；胶带，剪刀，镊子，解剖刀，纱布，滤纸，脱脂棉，三角瓶，9或10cm培养皿，玻璃棒，接种钩，接种环药品和试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。
孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。
消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。
双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇(β- Mercaptoethanol)，石英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。
六、实验步骤（一）培养基配置1、马铃薯、葡萄糖琼脂培养基马铃薯汁 1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g（注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。
）2、察氏琼脂培养基蔗糖30g，NaNO33g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，K2HPO41g，琼脂13g，蒸馏水1000ml，自然pH3、沙氏培养基蛋白胨 1g，葡萄糖或麦芽糖 4 g，琼脂 1.5克，水 100 ml。