真菌的常规检验法
一般生菌数检验方法
一般生菌数检验方法
一般生菌数检验方法如下：
1.制备10倍品匀液。
按上一步操作程序，每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
2.取样并制备平板。
同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内空白对照。
及时将15mL-20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃士1℃恒温水浴锅中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
3.待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃士1℃培养48h+2h。
如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按2.1条件进行培养。
4.平板上菌落计数可使用自动化菌落计数仪，也可用肉眼观察（必要时可用放大镜观察）记录培养基上菌落数量和相应的稀释倍数。
选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
以上就是一般生菌数检验方法，希望对解决您的问题有所帮助。
检验科真菌检验流程PIM
深部感染分布于自然界，如土壤、腐败有机物、粮食和饲料等，有时也存在 于正常人体的皮肤和粘膜表面。
（一）分类和命名
其中大多数曲霉只发现了无性阶段，它们归属于半知菌亚门、丝孢菌纲、 丝孢菌目、丛梗孢科，少数种具有性阶段归入子囊菌亚门、不整子囊菌 纲、散囊菌目、散囊菌科。其中对人致病的曲霉主要有烟曲霉
全国临床检验操作规程
真菌病原学检验程序
临床标本
直接检查
分子生物学检测 直接镜检
经固定标本染色 墨汁法 法：亚甲蓝染色 染色法 法、革兰染色法、 P法A。S、荧光染色脑 痰 脓
脊 液汁 液
动
分离培养
物
实
沙氏培养基 验
KOH法
25°C 37°C
毛发 指甲 皮屑 脓汁 痰液
观察菌落 菌丝型 酵母型
镜 小生 检 培化
曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统，引起肺曲霉病。曲霉可局限在肺内感 染也可播散到其他器官，甚至引起全身性感染。曲霉还可诱发超敏反应引起过敏性 支气管肺曲霉病。
有些曲霉可产生毒素引起食物中毒，有的毒素如黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作 用，特别是黄曲霉毒素与人类原发性肝癌的发生密切有关。
深部感染真菌检验
养反 应
病
检
检
理
测
测
组
抗
抗
织
原
体
标
本
葡聚糖
PAS
HE 甘露聚糖
全国临床检验操作规程（第四版） 783页图4-6-1
2015年3月第一版
真菌鉴定程序
标本的采集、运送和保存
检验真菌的方法
检验真菌的方法
1. 直接镜检法：将短柄棉签蘸取患部分泌物、皮屑、毛发等样本，涂于玻璃片上，用40倍至100倍的显微镜下观察，检测真菌的形态和数量。
2. 细胞学检查法：可采用细胞学方法检查骨髓、淋巴结等组织样本中是否存在真菌，包括涂片法、细胞学初筛法、细胞学制片法等。
3. 培养法：将样本接种于含有丰富营养成分的培养基上，利用真菌的生长特点判定是否存在真菌的培养。
4. 核酸检测法：查找真菌的DNA或RNA序列，并使用PCR 技术的手段拓展浓度，最后用电泳技术侦察出真菌的情况。
5. 基于免疫学的检测：包括诸如ELISA和荧光法等方法，主要检测真菌产生的免疫球蛋白或抗原，以用于检测真菌是否存在。
真菌的鉴定范文
真菌是一种广泛存在于自然界中的生物，也是一类常见的病原体。
在研究真菌时，鉴定其特征和分类是非常重要的步骤。
对真菌的鉴定需要注意其不同的形态、生长环境和遗传特征等多方面的因素，因此准确地识别真菌是一个相对困难的任务。
本文将讨论目前常用的真菌鉴定方法，包括形态学鉴定、遗传学鉴定和分子生物学技术。
1.形态学鉴定在真菌初步分类时，形态学鉴定是基本的方法。
这一方法通常会涉及到真菌菌丝体和子实体的形态特征。
菌丝体通常呈细丝状或短棒状，并且有时会形成分支或团块。
对于子实体，其外观（包括色彩、形状、质地和大小）以及内部的菌柄、孢子和异型等部分的特征都是鉴定的关键要素。
除了以上主要的形态学鉴定方法之外，还可以通过对真菌产生的代谢产物进行鉴定。
有些真菌会产生一些特殊的化合物，如次生代谢物等，这些代谢产物对真菌鉴定也有一定的帮助。
例如，人们可以通过对真菌产生的次生代谢物进行分析来判断其属于哪一品种或属。
2.遗传学鉴定随着技术的进步，越来越多的人选择了通过遗传学鉴定真菌。
这一方法建立在基因序列比对的基础上，主要利用真菌DNA序列的不同构成来对其进行分类。
在这一技术中，人们可以对真菌线粒体DNA序列、大肠杆菌RNA多序列比较和嵌合子单链多态性等进行分析。
遗传鉴定提供了一种非常准确的真菌鉴定方法，由于其几乎可以排除因为环境影响而导致的误判。
3.分子生物学技术在分子生物学技术中，PCR（聚合酶链式反应）和DNA杂交技术是最广泛应用的技术之一。
通过PCR技术，可以从真菌样品中扩增出自RNA的DNA片段（例如其特征序列），以此来进行鉴定。
DNA杂交技术则是基于双链碱基对形成的互补性，将RNA或DNA探针与指定标记DNA 杂交，从而实现对真菌物种的准确识别。
这些技术未来将会得到更广泛的应用和发展。
真菌的鉴定是一个相对复杂的过程，需要经验丰富、技术优秀的人员协助完成，同时多种技术的结合也是一个比较可行的解决方案。
随着科学技术的进步，我们可以更加准确地对真菌进行鉴定，从而更好地了解和利用这些生物的各个方面。
检测土壤真菌数量操作规程
检测土壤真菌数量操作规程1. 引言土壤真菌数量的检测对于农业生产和环境保护具有重要意义。
本文档旨在提供一份操作规程，以帮助研究人员或实验室技术人员准确地检测土壤中的真菌数量。
2. 实验仪器和试剂准备2.1 实验仪器： - 显微镜 - 离心机 - 反应管或离心管 - 称量器 - 镊子或医用手套（用于样品处理）2.2 试剂： - 高温灭菌的蒸馏水 - 无菌培养基 - 过滤膜3. 样品采集3.1 样品选择： - 选择代表性的土壤样品，可以根据研究目的或采样位置进行选择。
- 避免采集过于湿润或干燥的土壤样品。
3.2 采样工具： - 使用无菌手套、镊子或其他无菌工具进行样品采集，避免外源性污染。
3.3 采样方法： - 在采样点附近挖取一块土壤，深度为10-20厘米。
- 将采样的土壤置于干燥的容器中，并尽快送入实验室进行处理。
4. 样品处理和离心4.1 样品干燥： - 将采集的土壤样品均匀分布在干燥的容器内，放置在通风处晾干。
- 避免土壤样品与其他异物接触，以防止污染。
4.2 样品研磨： - 将干燥的土壤样品研磨成粉末状，并过筛以去除较大的颗粒。
4.3 样品称量： - 取一定量的土壤样品，称量精确记录，并记录样品的湿重。
4.4 样品提取： - 使用高温灭菌的蒸馏水对称量好的土壤样品进行浸泡提取，保持一定时间（例如12小时）。
4.5 离心： - 将提取的土壤悬浊液进行离心，以分离土壤颗粒和真菌孢子。
5. 真菌数量检测5.1 过滤悬浊液： - 将悬浊液通过无菌的过滤膜过滤，以去除土壤颗粒。
5.2 培养基制备： - 准备无菌培养基，并按照制备说明进行培养基的配制。
5.3 填充培养基： - 将过滤后的悬浊液均匀地倒入培养基平板中。
5.4 培养： - 将培养基平板放入恒温培养箱中，在适当的温度下孵育一段时间（例如48小时至72小时）。
5.5 统计计数： - 借助显微镜观察并统计培养基平板上的真菌数量。
- 在视野内随机选择若干个区域，计数并记录每个区域中的真菌数量。
真菌感染的常规检验方法
真菌感染的常规检验方法真菌的临床实验室检查一般包括标本采集、直接镜检、染色镜检、分离培养、生化反应及免疫学试验等。
以直接镜检和分离培养最重要。
1标本采集不同真菌感染应采用不同的临床标本。
浅部真菌感染可以采集毛发、皮屑、指(趾)甲、痂等，标本在分离前常先用75％的乙醇消毒。
深部真菌感染的检查可取痰、尿液、口腔或阴道分泌物、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。
采集标本时应注意无菌操作。
采集标本后应及时转运至实验室进行检查，一般不超过1～2h，以免标本变质污染。
标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。
2检查方法2.1 直接检查法直接镜检是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。
其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。
但是，除了少数真菌外，多数不能确定其种类。
由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断，有时需反复检查或做其他方法检查以进一步确定。
直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。
2.1.1 不染色标本检查取皮屑、毛发、指(趾)甲屑等标本置于载玻片中央，滴加100～200g／L KOH溶液1～2滴，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加热，使组织或角质溶解、透明后，先于低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查其特征，可初步诊断真菌感染。
2.1.2 染色标本检查有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地观察，常用的染色方法如下。
(1)革兰染色法：多用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌等。
所有真菌均为革兰阳性。
(2)乳酸酚棉蓝染色法：取标本于载玻片上，滴加染液，加上盖玻片后于镜下观察，真菌被染成蓝色。
该法适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。
(3)荧光染色法：用0.1％吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌为红黄色，曲霉菌为绿色。
2.2 分离培养法真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。
真菌检验【送检】SOP
尿液标本采集、处理
• 采集早晨第一次清洁尿液、
耻骨上联合穿刺尿液或导管 尿液 10-50ml， 不要采用 24h 尿液。
• 2h 内常温送检；若不能及时送检， 则 4°C 保存。
• 尿液接种前需要 2000g 离心 10 分钟，取沉 渣进行镜检和接种。
• 尿液真菌培养不推荐定量检测。
判定不合格标本
a) 标本标识与申请单不符，标识错误或没有标 识； b) 未采用无菌容器或容器选择不恰当； c) 标本采集未按规定消毒或清洁创口； d) 标本采集量过少； e) 标本保存方式不恰当或保存时间超过规定； f) 血培养瓶中有凝块； g) 血培养瓶破碎、渗漏或过有效期；
参 考 文 献： [1] 秦启贤主编：临床真菌学. 复旦大学出版社， 2001. [2] 王端礼主编：医学真菌学－实验室检验规范. 人民卫生出版社， 2005. [3] 吴绍熙主编：现代医学真菌检验手册（第二版） . 中国协和医科大学出版社， 2005. [4] 周庭银，倪语星。临床微生物检验标准化操作. 上海科学技术出版社， 2009. [5] 周庭银. 临床微生物学诊断与图解（第三版） . 上海科学技术出版社， 2012. [6] James V. Manual of Clinical Microbiology [M], 10th ed. Washington, DC: ASM Press, 2011. [7] Sybren de Hoog, Guarro J, Gene J, et al. Atlas of clinical fungi [M]. CBS,Electronic Version 3.1, 2011. [8] CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, 2009, M27-A3, vol.28, No14. [9] CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, 2012, M27-S4, vol.28, No15. [10] CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi, 2009, M38-A2, vol.28, No16. [11] CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, principles and procedures for blood cultures; approved guideline, 2009, M47-A2, vol.28, No16. [12] EUCAST.The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing.Breakpoint tables for interpretation of MICs. Version 6.1,2013. [13] 抗酵样真菌药物敏感性试验肉汤稀释法，中华人民共和国行业标准， WS/T,421 -2013,2013-07-16 发布， 1-14 [14] 抗丝状真菌药物敏感性试验肉汤稀释法，中华人民共和国行业标准， WS/T,411-2013,2013-06-03 发布， 1-14
临床检验主管技师 微生物检验 第二十八章 真菌检验
第二十八章真菌检验本章内容真菌的基本特性真菌的基本微生物检验方法病原性真菌一、真菌的基本特性真菌是真核细胞型微生物，属于真菌界。
具有典型细胞核，有完整细胞器，不含叶绿素；寄生或腐生方式生存，由单细胞或多细胞组成；细胞壁含几丁质和（或）纤维素；能进行有性生殖和（或）无性生殖。
分类绝大多数对人类有益，如食用真菌及能产生抗生素的真菌等。
能引起人类和动物疾病的真菌仅150余种。
分为黏菌、真菌两个门。
其中与医学有关的真菌主要属于接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门，鞭毛菌门中仅腐霉属在医学上有重要性。
绝大部分致病性真菌属于半知菌亚门。
结构基本结构为菌丝和孢子。
菌丝：真菌在适宜环境中，由孢子生出芽管逐渐延长或呈丝状，称为菌丝。
菌丝继续生长并向两侧分支，交织成团，称为丝状体。
营养菌丝：伸入到培养基内的菌丝。
气中菌丝：露出培养基表面的（部分气中菌丝可产生有性或无性孢子的称为生殖菌丝）。
孢子有性孢子：同一个菌体或不同菌体上的两个细胞融合形成。
无性孢子：菌丝直接生成，并不发生细胞融合。
致病性真菌多为无性孢子。
真菌孢子与细菌芽孢区别区别要点真菌孢子细菌芽孢形态大小大小产生数目一条菌丝可产生多个一个细菌只形成一个形成部位细胞内、外均可形成只在细胞内形成热耐受性不强，60～70℃短时死亡强，煮沸短时间内不会死亡生物功能重要的繁殖方式非繁殖方式真菌与细菌区别特征真菌细菌结构核真核细胞（有核仁和核膜）原核细胞（无核仁和核膜）细胞浆有线粒体和内质网无线粒体和内质网,有中介体细胞膜含固醇缺少固醇（除支原体）细胞壁几丁质或葡聚糖为主肽聚糖为主孢子或芽孢有性和无性孢子，是繁殖方式芽孢，是一种生存方式双相性有（某些真菌）无代谢需碳有机物；无专性厌氧菌某些不需要碳有机物；某些为专性厌氧培养与繁殖气体环境：需要较高的湿度和氧气。
温度酸碱：22～28℃，某些深部病原性真菌在37℃生长良好，pH 5.0～6.0。
培养特点：最常用沙保弱培养基，生长缓慢。
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真菌的常规检验法
实验室检查：
♦标本采集分离培养
♦直接镜检生化反应
♦染色镜检免疫学试验
一、临床标本的采集
♦1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。
2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。
♦3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。
4．脓汁及渗出物。
二、检验方法
（一）标本直接检查法
不染色标本检查
染色标本检查
（二）培养检查
（三）鉴定
①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。
②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）
③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。
④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。
微生物学检查步骤：
取患部标本
（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化
→镜检（观察菌丝和孢子）
直接镜检的意义
①有诊断意义，如浅部真菌病等；
②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等；
③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。
直接镜检的局限性：
①阴性结果不能排除真菌感染；
②有假阳性结果。
因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。
2. 染色标本检查
♦（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。
♦（2）乳酸酚棉蓝染色
♦（3）糖原染色：
♦又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。
真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。
过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。
为真菌染色最常用的方法之一。
♦（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色
♦（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。
隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。
♦（6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。
（二）培养检查法
♦本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。
①菌落性质：酵母菌还是霉菌；
②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；
③菌落颜色：病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；
④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉，很少引起开裂。
标本培养观察
标本→沙保培养基→观察菌落形态、假菌丝
标本→玉米粉琼脂培养基→观察厚垣孢子
2、培养方法
♦接种工具为接种针、接种钩、接种环、接种铲（刀）♦（1）试管培养：多用于菌种传代接种与保存。
♦（2）大培养：用平皿或培养瓶培养。
♦（3）小培养可观察结构特征及发育的全过程。
♦ 1）玻片小培养法
♦ 2）郭可大钢圈小培养法：
♦材料：培养基、钢环（用铁环或废电线的铝丝制成）、载玻片、盖玻片、毛细管、石蜡等。
钢圈小培养法
先将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖玻片之间，钢环开口处深入底部加入培养基。
加够半环即可凝固。
用接种针取少量材料，接种在培养基表面。
将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿纱布以防干燥。
逐日镜检，一般约7ｄ即可长好。
根据菌丝和孢子的结构特点进行真菌类别的鉴定。
真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。
培养真菌的温度为28℃，但深部真菌为37℃。
菌落形态是鉴别真菌的判断依据。
动物实验
目的是分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药物对真菌的作用等。
如假丝酵母菌接种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀，肾皮质部位有白色脓疡。
（三）真菌的鉴定
1.真菌的生化反应
用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。
1）糖(醇)类发酵试验 37℃，观察糖发酵情况。
2）同化碳源试验含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45℃)混合，然后在培养基上分别加糖，置25℃孵育观察结果。
若24h后无变化可重复加糖。
如能同化则在糖周围有生长圈，否则无生长圈。
一般对双糖发酵的真菌能同化或利用糖类或碳源。
主要用于酵母菌的鉴定。
3）同化氮源试验同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。
用于观察酵母菌对硝酸钾的利用情况。
4）明胶液化试验：某些真菌可液化明胶。
5）尿素分解试验石膏样癣菌、新生隐球菌等可分解尿素。
6）测定淀粉样化合物：某些真菌可产生淀粉样化合物，遇碘后变成兰色
7）牛乳分解试验；真菌可使牛乳酸化、凝固、胨化、碱化等
2、芽管试验。