饮用水大肠菌群检验纸片(五管法)
饮用水大肠菌群检测方法
饮用水大肠菌群检测方法大肠菌群是指在37℃培养24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革蓝氏阴性无芽孢杆菌的总称。
主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100 mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌。
这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检测方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可适用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要的时间较长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于堵塞滤孔的水样。
(一)水样的采集供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。
水样从采集到检验不应超过4h，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。
1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min，再用无菌容器接取水样，待分析。
如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。
2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。
采样后，瓶内应留有空隙。
如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。
(二)初发酵试验1.水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。
以此类推，稀释到所需倍数。
2.接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL，小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。
多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群
多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群李恒，等多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群Determination of Total Coliform Group and Fecal Coliform Group in Water by Multi-tube Fermentation and Paper Disk Method李恒张志君王光惠陈泓+（湖南省衡阳生态环境监测中心，湖南衡阳421000）［摘要］通过多管发酵法和纸片快速法对实际水样的总大肠菌群和粪大肠菌群进行实验比对，结果表明，两种方法的结果相差不大，但纸片快速法比多管发酵法操作简便、检测时间短，更适用于环境监测日常分析％［关键词］多管发酵法；纸片快速法；总大肠菌群;粪大肠菌群［中图分类号］X833［文献标识码］%引言粪大肠菌群是能在44.5!温度下生长并发酵乳糖产酸产气的耐热的大肠菌群，属于总大肠菌群的一部分，主要来自粪便。
水中粪大肠菌群和总大肠菌群的检验是研究水体污染和环境卫生的重要指标，具有广泛的卫生学意义。
目前，国内已颁布的标准主要是多管发酵法和纸片快速法［1+4］。
多管发酵法操作繁琐且时间过长（48~72h$,难以满足当前环境监测工作的需求［5］%纸片快速法不仅培养时间短（18~ 24h）,且无需提前准备培养基，可以避免培养基杂菌入侵和时间过长等不足。
为更精确、快速、可靠地进行监测，本文用多管发酵法和纸片快速法同步进行对比实验，并对两种分析方法的实验结果进行了比较分析。
1材料与仪器1.1材料水质粪大肠菌群、总大肠菌群快速检验纸片（广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司）；粪大肠菌群、总大肠菌群、培养基、革兰氏染色液％1.2试剂EC培养基：胰豚20g,乳糖5g,胆盐三号1.5g，磷酸氢二钾4g,磷酸二氢钾1.5g,氯化钠5g%将上述成分加热溶于1000ml水中，灭菌后的pH应在6.9左右。
该培养基在低温无菌条件下可以保存一个月％无菌水：将纯水在115!高压蒸汽灭菌20min,备用。
水质总大肠菌群和粪大肠菌群(纸片快速法)检测方法确认表
水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 （纸片快速法）
申请人
项目负责人员
制定原因
验证检测方法符合实验 室要求、确保数据准确性 与有效性
方法适用范围
适用于地表水、地下水及废水中的总大肠困群和粪大肠困群的快速测定。
方法来源
HJ 755-2015《水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》
仪器、试剂和环 境的要求
（5）纸片无变化，为阴性。
2.结果计算：
根据不同接种量的阳性纸片数量，查MP表得到MP值，按公式换算并报告1L水样中总大肠菌群或粪大肠菌群数：
C=100*M/Q
式中：
C-水样总大肠菌群或粪大肠菌群浓度（MPN/L
M-查MP表得到的MP值（MPN/100ml）
Q—头际水样取大接种量（ml）
100—为10*10ml，其中，10将MP值的单位MPN/100m转换为MPN/L 10ml为MP表中最大接种量。
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大肠菌群测试片检测操作流程
大肠菌群测试片操作流程1.样品的前处理(建议使用蔬菜瓜果、河水及大肠菌群标准菌作为样品)（1）蔬菜瓜果：称取25g样品切成1cm左右的碎片，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min制成1:10的样品匀液。
（2）河水：以无菌吸管吸取25mL河水置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
（3）大肠菌群标准菌：挑取平板上大肠菌群标准菌的单菌落，于盛有5mL LB 液体培养基的试管中，37℃培养过夜，以此作为菌原液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸1mL菌原液于盛有9mL的稀释液的无菌试管中，制成1:10的样品匀液。
2.样本稀释倍数用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL的稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振荡试管或换用一只无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释液必要时用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节pH至7.0~7.2。
（1）蔬菜样品的稀释倍数：取100、10-1两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（2）河水样品的稀释倍数：取10-1、10-2两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（3）大肠菌群标准菌原液的稀释倍数：取10-7、10-8两个进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（4）自来水的稀释倍数：直接取自来水接种进行验证。
3.接种一般食品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。
将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液垂直加入到测试片中央，用手轻轻将上层盖下，使检测样品液覆盖整个检测圈（应尽量避免产生气泡），静置1min使培养基凝固，最后用手轻轻将上层盖下。
2023版细菌总数大肠菌群国纸片法
2023版细菌总数大肠菌群国纸片法2023版细菌总数大肠菌群国纸片法细菌总数大肠菌群国际标准方法（也称为国际纸片法）是一种用于测定食品和饮用水中大肠菌群数量的常用方法。
该方法于2023年进行了更新和改进，以提高准确性和可靠性。
首先，为了进行测试，我们需要准备一些必要的材料。
这些材料包括培养基、平板计数器、无菌纸片、无菌培养皿和试管。
接下来，我们需要收集样品。
样品可以是食品或饮用水。
确保样品收集过程中的卫生条件，并尽量避免外界污染。
然后，将样品转移到试管中，并进行适当的稀释。
这是为了确保在培养过程中细菌数量适中，以便于计数。
接下来，将稀释后的样品倒入无菌培养皿中，并将无菌纸片放置在培养皿表面。
确保纸片完全接触到培养基上。
然后，将培养皿放入恒温箱中，在适当的温度下孵育一段时间。
这个时间通常为24小时，但也可以根据需要进行调整。
在孵育结束后，取出培养皿，并使用平板计数器进行计数。
计数时，只计算纸片上的大肠菌群数量。
大肠菌群通常呈现为红色或粉红色的菌落。
最后，根据计数结果，可以得出样品中大肠菌群的数量。
这个数量可以用来评估样品的卫生状况，并判断是否符合卫生标准。
需要注意的是，这个方法只能测定大肠菌群的总数，并不能区分不同种类的细菌。
如果需要进一步了解细菌种类和数量的信息，可以使用其他更为复杂和精确的方法。
细菌总数大肠菌群国际标准方法是一种简单而有效的方法，用于评估食品和饮用水中大肠菌群数量。
通过遵循正确的操作步骤和使用适当的设备，我们可以获得准确可靠的结果，并确保食品和饮用水的安全性。
生活饮用水总大肠菌群(多管发酵法-5管法)检测原始记录
乳糖发酵试验（日时至日时）分离培养（日时至日来自）证实试验（日时至日时）
备注：
2、分离培养：将产酸产气的发酵算分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃±1℃培养箱内培养18h~24h，观察菌落形态，挑取特征菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验；
3、证实试验：经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃±1℃培养箱内培养24h±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在；
4、结果报告：如所有乳糖发酵管均阴性时，报告总大肠菌群未检出；若证实为阳性，根据总大肠菌群阳性的管数，查MPN（最可能数）检索表，报告MPN值。
样品编号
5个10mL管中总大肠菌群阳性管数
检测结果（MPN值）
乳糖发酵试验（日时至日时）
分离培养（日时至日时）
证实试验（日时至日时）
备注：
样品编号
5个10mL管中总大肠菌群阳性管数
项目编号
样品名称
生活饮用水
检测项目
总大肠菌群
样品性质
收样时间
检测时间
环境条件
温度： ℃ 湿度： %
检测依据及方法
《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》GB/T 5750.12-2023 多管发酵法-5管法
仪器设备及编号
电热恒温培养箱DHP-9082B（KLM-YQSB-006）、生物安全柜BHC-1300ⅡA2（KLM-YQSB-002）、立式蒸汽灭菌器LDZM-60KCS-Ⅱ（KLM-YQSB-022）、电子天平JY2002（KLM-YQSB-012）
培养基及试剂
乳糖蛋白胨培养基、伊红美蓝琼脂、革兰氏染液
样品前处理
直接无菌操作取样。
实验步骤
1、乳糖发酵试验：取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，接种5管。将接种管置36℃±1℃培养箱内培养24h±2h。如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，直接报告总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，将产酸产气的发酵管进行分离培养；
纸片法快速检测生活饮用水总大肠菌群的探讨
方 法
关 键 词 ： 大 肠 茵 群 检 测 ； 片 法 ； 管发 酵 法 ； 定 纸 多 判
铁 劳 安 卫 与 保 ２０ 第３卷４ 道动全生环 ０年 ７ 期 １
验材 料 比较便 宜 ， 检测 和 监督 同时 进行 ， 使现 场 检 测具 有很 大 的优 势 ， 因此 现 场 检 测 在 突发 卫 生 事 件处 理及 日常 的监 督 中发挥 着极 其 重 要 的作 用 。
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纸 片 法 快 速 检 测 生 活 饮 用 水 总 大 肠 茵 群 的 探 讨
魏 海 明 ， 中 伟 张 （ 安 铁路 疾病 预 防控制 所 ， 西 西安 西 陕
摘 要 ： 目的 探 讨 纸 片 法 对 于 生 活 饮 用 水 快 速 检 测 大 肠 菌 群 的有 效 性 。方 法 对 １ ６份 水 样 分 别 用 纸 片 ８
［２］ 管 若 青 ， 玉 萍 ， 彤 ， ． 国 各 级 卫 生 监 督 机 构 现 场 快 贾 张 等 全 速检测装备配备情 况调查 报告 ［］ 中国卫 生监督 杂志 ， Ｊ． Байду номын сангаас
２ ０ ， １ ５ ２ ３ ０ ４ １ （ ）：６ ．
［３］ 王 晶 ， 林 ， 晓 蓉 ． 品 安 全 快 速 检 测 技 术 ［ ． 京 ： 王 黄 食 Ｍ］ 北 化
检测 生 活饮用 水 中总 大肠 菌群 的有 效性 。
１ 材 料 与 方 法
１１ 材料 ．
大肠 菌 群 快 速 检 测 纸 片 （ 京 三 爱 宝 业 生 南
大肠菌检验方法（快速纸片法）验证方案
大肠菌检验方法（快速纸片法）验证方案食（饮）具大肠菌群检验方法—纸片法验证方案1．验证目的和原理1.1 验证目的为确认本实验室所采用的方法适合于食（饮）具大肠菌群检验，特制定本方案验证GB 14934-94食（饮）具消毒卫生标准食（饮）具大肠菌群检验方法，纸片法能否准确检验出食（饮）具中的大肠菌群。
1.2 原理：通过试验来评价验证整个检验方法的准确性、有效性。
2．验证方法步骤2.1验证前的准备：进行食具大肠菌群发酵法检验验证前，所有的仪器和试剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
2.2验证试验的操作计划：做空白对照，以及阳性对照。
3．试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，冰箱：2 ℃～5 ℃，天平：感量 0.1 g，无菌吸管：1 mL，无菌塑料袋。
3.1.2操作环境：环境洁净度不应低于10000级无菌室。
3.1.3试验样品：两套经消毒灭菌后的餐具，包含碗，盘，口杯，匙，筷子。
3.1.4试剂： 0.9%无菌生理盐水3.1.5验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：中国工业微生物菌种保藏管理中心3.1.7培养基3.2验证试验操作3.2.1样品制备将大肠埃希菌菌苔用9mL生理盐水稀释至10-3，用无菌棉签蘸取稀释后的菌液，涂抹在1套灭菌后的餐具表面待用。
3.2.2验证方法按照编制的作业指导书进行采样，检验，同时做空白对照。
3.3试验结果测试人：复核人：测试日期：复核日期：4．验证结果评价分析（1）验证试验是否有遗漏？（2）验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？（3）验证记录是否完整？（4）验证试验结果是否符合标准要求？起草人：起草日期：年月日验证实施日期：年月日测试人：复核人：测试日复核日期：。
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饮用水大肠菌群检验纸片(五管法)
产品编号： BD114
产品规格： 1份/包
产品用途：饮用水中总大肠菌群的快速检验
产品说明
1、适用范围
本产品适用于出厂成品水或直接饮用的矿泉水和纯净水中总大肠菌群的快速检验。
2、方法原理
将乳糖、显色剂和选择性培养基加载在纸片上，经培养后能够在纸片上生长并发酵乳糖产酸的即为大肠菌群阳性，记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数，根据大肠菌群MPN表查出相应的大肠菌群数。
执行标准：生活饮用水卫生标准（GB 5749—2006）。
3、操作方法
3.1、用灭菌吸管吸取10mL水样加入装有大纸片的塑料薄膜袋中，均匀涂布，共做5个重复；
3.2、将接种好的纸片放于培养箱中，培养温度为36℃±1℃，培养15～24h 观察结果。
4、结果判读
4.1、若纸片变黄或在黄色背景上呈现红色斑点为大肠菌群阳性，纸片保持紫蓝色不变或在紫蓝色背景上呈现红色斑点但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。
4.2、根据每个稀释度的阳性反应纸片数，查MPN表可得出水样中总大肠菌群的MPN值（见表1）。
如所有纸片均为阴性时，可报告总大肠菌群未检出。
4.3、对于阳性纸片，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。
用接种环在阳性菌斑处沾取少许带菌滤纸，用3mL灭菌生理盐水混匀，接种到大肠埃希氏菌耐热大肠菌群测试片上，进行培养和检验。
表1 用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果
组合时的最可能数（MPN）及95%可信限。