大肠菌群测定方法
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品）药品：1、平板计数琼脂2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）4、氯化钠设备材料：烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。
一、准备工作（指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加）1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定（a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。
（b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。
（c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。
4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。
5、准备8个培养皿，用布包扎好。
6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。
7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。
二、使用灭菌锅灭菌1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。
2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。
3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。
4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数、大肠菌群测定方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1菌落总数和大肠菌群测定（固体样品）药品：1、平板计数琼脂2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）4、氯化钠设备材料：烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。
一、准备工作（指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加）1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤----用于大肠菌群测定（a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。
（b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支(18*180规格)试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST（合计90毫升）。
（c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、%的生理盐水----用于样品稀释将广口瓶去皮，称取氯化钠加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。
4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。
5、准备8个培养皿，用布包扎好。
6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。
7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。
二、使用灭菌锅灭菌1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。
2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。
3、盖上灭菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。
地下水总大肠菌群的测定方法
地下水总大肠菌群的测定方法
地下水中总大肠菌群的测定是非常重要的，因为它可以反映出
水质的卫生状况。
以下是一些常用的测定方法：
1. 膜过滤法，这是一种常用的测定方法，通过将地下水样品通
过0.45微米的膜过滤器，然后将膜放置在含有大肠菌群特异培养基
的琼脂平板上进行培养。
培养后，通过计数形成的菌落来确定水样
中大肠菌群的数量。
2. 荧光素基因定量PCR法，这是一种分子生物学方法，通过提
取地下水中的DNA，使用荧光素基因特异引物进行PCR扩增，然后
使用荧光素探针进行定量检测。
这种方法可以快速准确地测定大肠
菌群的数量。
3. 色素培养基法，使用含有某种特定底物的琼脂平板进行培养，通过大肠菌群对底物的特异反应产生的颜色变化来测定其数量。
4. 流式细胞术，这是一种高通量的测定方法，通过将水样中的
微生物染色标记，然后通过流式细胞仪进行快速准确地测定大肠菌
群的数量。
总的来说，测定地下水中总大肠菌群的方法有多种，可以从不同的角度对水质进行评估。
在实际应用中，可以根据实际情况选择合适的方法进行测定。
食品中大肠菌群的检测及分离纯化
实验8: 食品（饮用水）中大肠菌群的检测（滤膜法）及分离纯化（6学时）一、目的要求1.利用滤膜法测定食品中大肠菌群。
2.掌握分离微生物的基本操作。
二、基本原理1.滤膜法是采用过滤器过滤水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，大肠菌群可直接在膜上生长，从而可直接计数。
所用滤膜是一种多孔硝化纤维膜或乙酸纤维膜，用水系过滤膜即可，其孔径约0.45μm。
2.在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。
得到纯培养的过程称为分离纯化。
三、试验原料及器材实验原料：伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板，乳糖蛋，蛋白胨，灭菌水，饮用水等；器材：镊子；夹钳；烧杯；真空泵；滤膜；过滤器等。
四、操作步骤1.大肠菌群的检测（1）滤膜灭菌将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤2—3次再煮，以洗去滤膜上残留的溶剂。
（2）过滤器装置用无菌手续将已灭菌的过滤器基座、滤膜、漏斗和抽滤瓶安装好，其中滤膜用灭菌镊子(浸在95%酒精内，用时通过火焰灭菌)移至过滤器的基座上。
其他可直接用手或夹钳操作，但不要碰到伸入抽滤瓶的橡皮塞部分，以免染菌。
（3）将抽滤瓶接上真空泵。
（4）加水样过滤直径50mm的滤膜，所过滤的水量以培养后长出的菌落数一般需要较多过滤器装置，多于50个为适宜，所以采用多联过滤器最好，可以减少误差。
一般清洁的深井水或经处理过的河水与湖水等可取样 300—500 ml；对比较清洁的河水或湖水，可取样1-100ml；严重污染的水样可先进行稀释；未知的水样可做三个稀释度，选择菌落数合适的稀释度进行计算。
本次实验于过滤器漏斗内加入比较河水或湖水100ml，加盖。
（5）开动真空泵进行油滤。
（6）抽完后，加入等量的灭菌水继续抽滤，目的是冲洗漏斗壁。
（7）滤毕，关上真空泵，用灭菌镊子取滤膜边缘，将没有细菌的一面紧贴在伊红美蓝琼脂平板上。
滤膜与培养基之间不得有气泡。
大肠菌群测定检验标准
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值（见表一）。
XXXXXXX有限公司
文件编号
3-QC-TS-006
制定单位
质检部
页 码
4/7
文件名称
大肠菌群测定方法及标准
版 本
大肠菌群最可能数(MPN)检索表（表一）
阳性管数
MPN
100mL(g)
95﹪可信限
制定单位
质检部
页 码
2/7
文件名称
大肠菌群测定方法及标准
版 本
5.5 0.85%灭菌生理盐水。
6.检验程序
大肠菌群检验程序如下：
检样
稀释
乳糖胆盐发酵管
36±1℃，24±2h
不产气 产气
伊红美蓝琼脂平板
大肠菌群阴性 36±1℃，24±2h
报告 革兰氏染色 乳糖发酵管
36±1℃，24±2h
革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽胞杆菌
1mL(g)×3
0.1mL(g)×3
0.01mL(g)×3
下限
上限
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
＜30
30
60
90
＜5
90
0
0
0
0
1
1
1
1
0
1
2
3
30
60
90
120
＜5
130
0
0
0
0
2
2
2
2
0
1
2
3
60
90
120
大肠菌群测定—食品中大肠菌群的测定方法
培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄 糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃， 在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。
➢ 在普通营养琼脂上有3中菌落形 态：
➢ 1）光滑型：菌落边缘整齐， 表面有光泽、湿润、
➢ 光滑、呈灰色，在生理盐水 中易分散；
计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳 糖胆盐发酵管。
•
接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml
以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠
杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。
• 置36±1℃温箱培养24±2小时，如所有发酵管 都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产 气者，则与对照的混合菌种一起按下列程序进 行。
4、 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告
➢ 根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录
B ) ，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的 MPN 值。 ✓注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，
表内的数也应相应减少或增加。
大肠杆菌 0157显色 培养基上 的菌落
在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上
大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征
设备和材料
食品中大肠菌群测定
参考 GB4789．3-2010
➢主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌 属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属 的Ⅲ亚属细菌组成。
3、大肠杆菌的生物学特性
基本形态
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.50.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但 不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛， 但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体 动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微 荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良 好，革兰氏染色阴性。
餐饮具大肠菌群测定
餐饮具大肠菌群测定（纸片法）
1、采样方法
随机抽取消毒后准备使用的各类食具(碗、盘、杯等)，取样量可根据大、中、小不同饮食行业每次采样6～10件，每件贴纸片两张，每张纸片面积25cm2(5cm╳5cm)用无菌生理盐水湿润大肠菌群检测用纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于无菌塑料袋内。
筷子以5只为一件样品，用毛细吸管吸取无菌生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端约5cm)抹试纸片，每件样品抹拭两张，放入无菌塑料袋内。
2、检验方法
将已采样的纸片置37℃培养16～18h，若纸片保持紫蓝色不变或有红色斑点但斑点周围无黄晕为大肠菌群阴性，在红色斑点周围有黄晕或纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。
大肠菌群测定方法
大肠菌群测定方法大肠菌群是人体内肠道中的一类细菌群，对人体具有重要的生理功能。
测定大肠菌群的方法有很多种，包括传统的培养法、分子生物学方法以及肠道菌群DNA测序等。
传统的培养法是测定大肠菌群的一种常用方法。
这种方法主要是将肠道样本采集后，通过在培养基上培养细菌来测定大肠菌群的分布情况。
首先，将采集到的样本放入富营养培养基中培养，然后通过对细菌在培养基上的生长情况以及染色特性进行观察和鉴别。
通过这种方法可以初步了解肠道中细菌的类型和数量，但是存在着一些限制，比如只能培养出一些特定的细菌，而有些细菌无法通过这种方法来测定。
分子生物学方法是一种较新的测定大肠菌群的方法。
这种方法主要是通过分析肠道样本中的细菌DNA来测定大肠菌群的类型和数量。
首先，将肠道样本中的细菌进行裂解，提取其中的DNA。
然后利用特定的引物对DNA进行扩增，最后通过凝胶电泳等方法分析扩增产物的大小和数量来判断肠道中细菌的组成。
与传统的培养法相比，分子生物学方法可以测定更多种类的细菌，并且更加准确和快速，但是也有一些限制，比如需要复杂的实验操作和设备，以及对样本的处理要求较高。
肠道菌群DNA测序是一种较新的测定大肠菌群的方法。
这种方法是在分子生物学方法的基础上发展而来的，主要是利用高通量测序技术对肠道样本中的细菌DNA进行全面的测序分析。
首先，将肠道样本中的细菌DNA进行提取和净化，然后对DNA进行测序，得到大量的序列数据。
最后通过对序列数据进行比对和分析，可以得到肠道中细菌的种类和数量，进一步了解整体的菌群结构和功能。
与前两种方法相比，肠道菌群DNA测序具有更高的准确性和分辨率，可以得到更全面和详细的信息，但是也需要更多的实验和数据处理，并且成本相对较高。
总的来说，大肠菌群测定方法包括传统的培养法、分子生物学方法和肠道菌群DNA测序等。
每种方法都有其优缺点，选择合适的方法需要根据具体的研究目的和经济条件来决定。
而随着科学技术的不断进步，相信未来还会有更多更先进的方法出现来帮助我们更好地测定大肠菌群。
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大肠菌群及检验
一、大肠菌群介绍
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。
调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。
粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。
二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。
目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。
两个标准方法在检测程序上略有不同。
（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。
乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。
36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。
证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。
同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。
报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查M P N表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》
（二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。
本方法采用两步
法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。
36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
以BGLB产气为阳性。
查MPN 表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的M P N值。
具体操作参见SN0169-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》三、说明：
1．MPN检索表：MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。
这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
M PN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也
不相同。
2．初发酵和证实试验：无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。
有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。
因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
3．产气量与倒管：在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。
实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。
如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
4．挑选菌落：国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。
由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。
国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。
另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。
所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。
5．抑菌剂：大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。
抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。
国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利
用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。
抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。
有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。