菌落总数与大肠菌群数测定

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菌落总数测定
注意事项：
1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识
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大肠菌群数测定
实验目的 实验原理
36 ℃，48h，产气（小倒管） 三步法：初发酵、复发酵 器材与试剂 样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤 1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管
1ml吸管，培养皿
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菌落总数测定
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倾注培养
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培养结果
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菌落总数测定
实验步骤 5.菌落计数： 肉眼观察，可用放大镜，可标记 必要时分区计数，菌落成片者作废
计算方法 某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值 选择菌落数在30-300之间的稀释度 （1）仅有一个稀释度在此范围： 菌落数×稀释倍数
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大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养：
（5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深
（6）革兰染色、镜检：选特征菌落
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革兰染色法
器材与试剂
结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理
盐水、酒精灯、载玻片、滤纸
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革兰染色法
涂片：接种环，挑取菌落， 生理盐水一滴，涂匀
别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值
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MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method）
1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=e-x ×xk/k!
x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数
2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为 Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为：
气体产生
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大肠菌群数测定
注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
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MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method） 目的：对某种细菌进行选择性计数 核心思想：泊松分布 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分
培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、
复发酵管
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大肠菌群数测定
实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落 1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37℃，24h （4）观察指标：产酸，产气
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液体接种
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复发酵
复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有
实验步骤 3.复发酵 （1）选取产气试管 （2）接种至10mlBGLB肉汤中 （3）培养：36℃，48h （4）观察指标：若产气则报告大肠菌 群阳性。
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大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 36℃，48h
菌落总数与大肠菌群数测定
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主要内容
菌落总数测定 大肠菌群测定 MPN法原理（拓展内容）
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菌落总数测定
掌握菌落总数测定方法 实验原理
不同稀释度的样品，营养琼脂培养基， 36 ℃，48h（水产品30 ℃，72h ），菌 落数
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菌落总数测定
器材与试剂：
样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，
n
y ( x ) C [(1 e Vi x /V ) Pi (e Vi x /V )Qi ] i 1
其中C为常系数 n
C (Pi Qi)!/(Pi!Qi!) i1
V为总水样量，x为细菌个数
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MPN法原理
3.当y(x)max，XMPN
4.由于y(x)为单极值函数，令dy/dx=0,即
n Vi(
热固定：通过火焰若干次 初染：结晶紫一滴，1min，水洗 媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗 脱色：95%乙醇，30s或至无色为止 复染：复红一滴，30s
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涂片
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热固定
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初染
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媒染
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脱色
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复染
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革兰染色法
革兰氏染色阴性
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革兰氏染色阳性
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复发酵
器材与试剂
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初发酵
器材与试剂
样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST 肉汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球
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大肠菌群数测定
实验步骤： 1.初发酵
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吸取样品方法
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加注样品
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初发酵结果
右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。
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Pi
Qi) 0
i1 eVix/V 1
5.解此方程，得x=MPN
6.该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解
7.日常实验时采用查表法推算MPN值。
8.表格在教材第260-261页。
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分离培养
器材与试剂
初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰
平板培养基
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分区划线法
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第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
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分区划线法
操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上 滑动
.源自文库
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菌落总数测定
计算方法： （2）有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比>2，选较小值 菌落数之比<2，取平均值 （3）所有稀释度均>300 取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均<30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者
结果单位：CFU/ml（g）
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