菌落总数与大肠菌群数测定
菌落总数及大肠菌群
菌落总数及大肠菌群的测定一、菌落总数的测定1.准备工作：1.1先将所有仪器用报纸包好，所需药品配置好，放入121℃灭菌锅灭菌15min分钟1.1微检室提前开好紫外线灯杀菌30分钟以上。
1.2把灭好菌的培养基加热溶解，放置50℃的水浴锅恒温备用2.样品处理：先用酒精对产品外袋消毒，然后打开放入放入研钵中压碎或用剪刀剪碎（注：手部接触的部分要丢弃）3.称取25ɡ样品于225ml生理盐水中，摇匀生理盐水中，摇匀。
各吸1ml至两个培养皿中，倒入培养琼脂，转动平板混匀。
4.待琼脂凝固后放翻转平皿，放入36±1℃无菌培养箱培养48小时。
二、大肠菌群的测定：1.称取25ɡ处理好的样品于225ml生理盐水中，摇匀。
各吸取10ml至3根月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤双料管中，再各吸取1ml至3根月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤单料管和9ml生理盐水中，把试管中样液和生理盐水摇匀，用另一支移液管分别吸取1ml至另外3根单料管中。
2.把试管塞好放入36±1℃无菌培养箱培养24小时，观察导管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48小时，不产气者为阴性，产气者进行复发酵实验。
3.复发酵实验：用接种环从所有48小时内发酵产气的LST肉汤管中分别取1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48小时，观察是否产气，产气者为大肠菌群阳性。
4.大肠菌群最可能（MPN）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌的MPN 值。
（1）营养琼脂的配置：称取23.5g于1L蒸馏水中，加热沸腾至完全溶解，分装于500ml锥形瓶中，1瓶大约装350ml，121℃高压灭菌15分钟。
（2）月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤双料管配置：称取17.8g于300ml蒸馏水中，加热沸腾至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15分钟。
（注：单料其他成分不变，水分加倍）（3）煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤配置：称取40g于1L蒸馏水中，热沸腾至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15分钟。
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品）药品：1、平板计数琼脂2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）4、氯化钠设备材料：烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。
一、准备工作（指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加）1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定（a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。
（b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。
（c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。
4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。
5、准备8个培养皿，用布包扎好。
6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。
7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。
二、使用灭菌锅灭菌1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。
2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。
3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。
4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。
中国药典中对微生物的测定
中国药典中对微生物的测定
中国药典对微生物的测定包括以下方面：
1. 菌落总数测定：该方法用于测定制剂和原料药中的菌落总数。
通过将样品接种在特定的培养基上，培养一定时间后，进行菌落计数，计算出单位重量或单位体积中的菌落总数。
2. 大肠菌群测定：该方法用于测定制剂和原料药中的大肠菌群的数量。
通过将样品接种在含有特定抑制剂的培养基上，培养一定时间后，进行菌落计数，计算出单位重量或单位体积中的大肠菌群数量。
3. 霉菌测定：该方法用于测定制剂和原料药中的霉菌的数量。
通过将样品接种在含有特定抑制剂的培养基上，培养一定时间后，进行菌落计数，计算出单位重量或单位体积中的霉菌数量。
4. 周赤霉糖的测定：该方法用于测定制剂和原料药中的周赤霉糖的含量。
通过将样品提取，使用特定试剂反应后，测定反应产物的吸光度，通过比对标准曲线计算出样品中的周赤霉糖含量。
5. 大肠杆菌测定：该方法用于测定制剂和原料药中的大肠杆菌的数量。
通过将样品的提取液接种在含有特定抑制剂的培养基上，培养一定时间后，进行菌落计数，计算出单位重量或单位体积中的大肠杆菌数量。
以上是中国药典对微生物测定的一些常见方法，用于评估药品和药物原料的微生物质量。
菌落总数和大肠菌群的区别
关键词：菌落总数；大肠菌群；食品我国的国家标准绝大多数食品都制订了菌落总数和大肠菌群的指标，并对其数量做了详细的规定，菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，是影响产品质量问题的常见指标，常常受到生产企业和消费者的高度父注，菌落总数的报告单位是cfu／g (ml )，大肠菌群的报告位是mpn／100g ( ml)，那么cfu，mpn是什么含义呢，有的食品微生物检测中菌落总数结果很高但大肠菌群很低，有关企业对此不太理解，现在将做一下解释说明。
L菌落总数(cfu)菌落总数是用来判定食品在被加工过程中被污染的程度及卫生质量的重要指标，食品的生产加工过程叶中，卫生质量的高低首先决定食品原料的来源．原料的卫生与否，是否被污染过，这是根本原因，其次是环境卫生水平的高低，再次就是加工人员和加工工具的卫生状况，要保证食品卫生安全就必须保证所加工的原料来源，环境，加工工具和人员符合卫生标准，但是如何判定食品生产加工过程中是否符合卫生要求，以便对被检产品做出一个科学的评价，菌落总数的多少在一定程度上反映出卫生质量的优劣，也可以用这一方法观察出食品中细菌的繁殖动态，以便于对被捡样品进行卫生评价时提供科学依据。
菌落总数中的菌落英文意思是(colony)，定义为细菌和其他几种做微生物在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。
各种细菌的菌落各自具有一定的特征，按其特征的不同可以在某种程度上鉴别某种细菌，为卫生检验提供依据，菌落总数是指在被检样品的单位重量( g )．体积(m1) 或表面积(clni) 内所含能于某种固体培养基上在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。
其培养的原理是以检样在被稀释到一定体积后，吸取一定量的检样，检样中的细菌细胞和培养基混合后，每个细菌细胞部形成一个肉眼可见的菌落的假设为基础的．由于检验中采用的是37℃有氧条件下培养。
因而并不能测出每克或每毫升样品内的实际活菌数，其中的微嗜氧菌，厌氧菌，冷营养菌在此条件下都不能生长，有特殊营养要求的一些细菌的生长也受到了限制，因此培养的只是一群能在普通营养琼脂中发育中发育的嗜中温的需氧兼性厌氧的细菌总数，只有具备每种细菌生长要求的特定的环境条件，才能将所有细菌全部培养出来，因此要的到全部的茼落总数应将检样接种到不同的培养基上，但国家的食品卫生标准对食品中菌落总数的规定并不需要接种不同的非选择性培养基，原因就是标准所规定的数值全部是在37℃有氧条件下测定得出的。
菌落总数与大肠菌群数测定 PPT
大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 36℃，48h
分离培养
器材与试剂 初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰 平板培养基
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
涂片
热固定
初染
媒染
脱色
复染
革兰染色法
革兰氏染色阴性
革兰氏染色阳性
复发酵
器材与试剂 培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、 复发酵管
大肠菌群数测定
实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落 1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37℃，24h （4）观察指标：产酸，产气
别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值
MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method） 1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布:
P(x=k)=e-x ×xk/k! x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数 2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为 Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为：
计算方法： （2）有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比>2，选较小值 菌落数之比<2，取平均值 （3）所有稀释度均>300 取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均<30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者
结果单位：CFU/ml（g）
大家应该也有点累了，稍作休息
分区划线法
食品中细菌菌落总数和大肠菌群的检测
二0一三年一月
概念认识——菌落总数ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱerobic plate count
食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、 培养温度和培养时间等）培养后，所得每 g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
概念认识——大肠菌群coliforms
在一定培养条件下 能发酵乳糖、产酸 产气的需氧和兼性 厌氧革兰氏阴性 无芽孢杆菌
食品微生物学检验 菌落总数测定
解读标准——GB/T 4789.3-2003
食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
为规范食品中大肠菌群指标的检测工作，现公告如下： 现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“MPN/100克或 MPN/100毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大 肠菌群测定》（GB/T4789.3-2003）进行检测；以“MPN/克或 MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”为单位的，适用《食品 卫生微生物学检验大肠菌群计数》（GB/T4789.3-2008）进行 检测。 特此公告。
二○○九年十月二十六日
解读标准
GB 7099-2003 糕点、面包卫生标准
GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验 糖果、糕点、蜜饯检验 GB 4789.1-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则
GB 4789.2-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定
GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
解读标准——GB 7099-2003 糕点、面包卫生标准
解读标准——GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验
糖果、糕点、蜜饯检验
解读标准——GB 4789.1-2010 食品安全国家标准
细菌总数与大肠菌群数测定
3〕假设所有稀释度的平均菌落数均大于 300，那么应按稀释度最高的平均菌落数 乘以稀释倍数报告之。
4〕假设所有稀释度的平均菌落数均小于 30，那么应以按稀释度最低的平均菌落数 乘以稀释倍数报告之。
5〕假设所有稀释度的平均菌落数均不在 30~300之间，那么应以最接近30或300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
1〕首先选择平均菌落数在30~300之间 者进行计算，假设只有一个稀释度的平均 菌落数符合此范围时，那么将该菌落数乘 以稀释倍数报告之
2〕假设有两个稀释度，其生长的菌落数 均在30~300之间，那么视二者之比值来 决定，假设其比值小于2应报告两者的平 均数。
假设大于2那么报告其中稀释度较小的菌 落总数。
Pi
Qi) 0
i1 eVix/V 1
5.解此方程，得x=MPN
6.该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解
7.日常实验时采用查表法推算MPN值。
8.表格在教材第260-261页。
大肠菌群数测定
实验步骤
2.别离培养
〔1〕制备伊红美蓝平板：
45 ℃，无菌，倾注，15ml〔2〕选产酸产气的发酵管
〔3〕接种至伊红美蓝平板
分区划线法
〔4〕培养： 37℃，24h
别离培养
器材与试剂 初发酵结果、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
在求同稀释度的平均数时，假设其中一个 平皿有较大片状菌落生长时，那么不宜采 用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该 稀释度的平均菌落数。假设片状菌落不到 平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又 很均匀，那么可将此半皿计数后乘2以代 表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均 菌落数。
食品微生物学检验 大肠菌群计数和菌落总数的测定
食品微生物学检验大肠菌群计数和菌落总数的测定摘要：菌落总数和大肠菌群超标是食品产品卫生指标中常见的质量问题,我国的国家标准对绝大多数食品都制订了菌落总数和大肠菌群的指标，并对其数量做了详细的规定。
菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，是影响产品质量问题的常见指标，在对食品进行检测的时候菌落总数以及大肠菌群两项指标容易出现相应的检测问题[1]，为了熟悉和掌握大肠菌群计数和菌落总数测定的方法和技术，本次实验以未经清洗的生菜为实验对象，用MPN计数法对大肠菌群进行计数，用平板倾注的方法培养微生物后观察获得的单菌落来测定菌落总数。
关键词：生菜；大肠菌群 MPN计数法；菌落总数；平板倾注一、前言：食品中菌落总数是指食品样检经过处理，在一定条件下（如培养基成分、培养温度和时间、PH值、需氧性质等）培养后，所得1mL(或1g) 检样中形成菌落的总数。
菌落总数测定通常是用来判定食品被微生物污染的程度及卫生质量，测定结果反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
大肠菌群是一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌群主要来源于人、畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。
食品中大肠菌群数系以每1mL(g) 检样内大肠菌群最可能数（the most probable number,MPN）表示。
[2]二、实验材料与方法（一）实验材料1、实验器材高压灭菌锅恒温培养箱电子天平2、实验材料及试剂未经清洗的生菜无菌生理盐水3、菌落总数测定所用培养基及其配方平板计数琼脂（PCA）培养基胰蛋白胨5.0g 酵母浸膏2.5g 葡萄糖1.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000mL PH7.0±0.2 4、大肠菌群计数所用培养基及其配方4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤胰蛋白胨20.0g 氯化钠5.0g 乳糖5.0g 磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g 月桂基硫酸钠0.1g 蒸馏水1000mL PH6.8±0.24.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤蛋白胨10.0g 乳糖10.0g 牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL1％煌绿水溶液13.3mL 蒸馏水800mL PH7.2±0.1（二）实验方法（1）培养基、生理盐水的配制及灭菌1、生理盐水称取NaCl8g溶于1000mL蒸馏水中,配成0.8%的生理盐水，NaCl溶解完全后，取90ml 分装到250ml带玻璃珠的三角瓶中。
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MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method） 1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=e-x ×xk/k! x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数 2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为 Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为：
其中C为常系数
V为总水样量，x为细菌个数
MPN法原理
3.当y(x)max，XMPN 4.由于y(x)为单极值函数，令dy/dx=0,即
5.解此方程，得x=MPN 6.该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解 7.日常实验时采用查表法推算MPN值。 8.表格在教材第260-261页。
Vi( e
菌落总数与大肠菌群数测定
主要内容
菌落总数测定 大肠菌群测定 MPN法原理（拓展内容）
菌落总数测定
掌握菌落总数测定方法 实验原理 不同稀释度的样品，营养琼脂培养基， 36 ℃，48h（水产品30 ℃，72h ），菌 落数
菌落总数测定
器材与试剂： 样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基， 1ml吸管，培养皿
i 1
n
Pi 1
Vix / V
Qi) 0
液体接种
复发酵
复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有 气体产生
大肠菌群数测定
注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method） 目的：对某种细菌进行选择性计数 核心思想：泊松分布 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分 别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值
菌落总数测定
注意事项： 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识
大肠菌群数测定
实验目的 实验原理 36 ℃，48h，产气（小倒管） 三步法：初发酵、复发酵 器材与试剂 样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤 1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管
初发酵
器材与试剂 样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST 肉汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球
ห้องสมุดไป่ตู้
大肠菌群数测定
实验步骤： 1.初发酵
吸取样品方法
加注样品
初发酵结果
右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。
实验步骤 3.复发酵 （1）选取产气试管 （2）接种至10mlBGLB肉汤中 （3）培养：36℃，48h （4）观察指标：若产气则报告大肠菌 群阳性。
大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 36℃，48h
分离培养
器材与试剂 初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰 平板培养基
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线
菌落总数测定
倾注培养
培养结果
菌落总数测定
实验步骤 5.菌落计数： 肉眼观察，可用放大镜，可标记 必要时分区计数，菌落成片者作废 计算方法 某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值 选择菌落数在30-300之间的稀释度 （1）仅有一个稀释度在此范围： 菌落数×稀释倍数
菌落总数测定
计算方法： （2）有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比>2，选较小值 菌落数之比<2，取平均值 （3）所有稀释度均>300 取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均<30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者 结果单位：CFU/ml（g）
革兰染色法
器材与试剂 结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理 盐水、酒精灯、载玻片、滤纸
革兰染色法
涂片：接种环，挑取菌落， 生理盐水一滴，涂匀 热固定：通过火焰若干次 初染：结晶紫一滴，1min，水洗 媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗 脱色：95%乙醇，30s或至无色为止 复染：复红一滴，30s
灭菌接种环
分区划线法
操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上 滑动
大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养：
（5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深 （6）革兰染色、镜检：选特征菌落
涂片
热固定
初染
媒染
脱色
复染
革兰染色法
革兰氏染色阴性
革兰氏染色阳性
复发酵
器材与试剂 培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、 复发酵管
大肠菌群数测定
实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落 1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37℃，24h （4）观察指标：产酸，产气