水质总大肠菌群和粪大肠菌群(纸片快速法)检测方法确认表
水中粪大肠菌群测定方法-纸片快速法与多管发酵法的比较
水中粪大肠菌群测定方法-纸片快速法与多管发酵法的比较黄晓容【摘要】2015年10月国家环境保护部发布了行业标准《水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》（HJ755-2015）（以下简称纸片快速法）。
之前环境监测部门一直在使用国家环境保护部于2007年3月发布的行业标准《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）》（HJ/T347-2007）（以下简称多管发酵法）。
纸片快速法操作简单快速,在标准中对采样瓶的处理、样品的保存、水样的稀释接种等做出了详细的规定,而多管发酵法中没有相应规定。
本文对两个标准的异同点进行比较,提出了将这两种方法的优点应用于实际环境监测工作中。
【期刊名称】《生物技术世界》【年(卷),期】2016(000)004【总页数】2页(P33-33,35)【关键词】粪大肠菌群;多管发酵法;纸片快速法【作者】黄晓容【作者单位】重庆市黔江区环境监测中心站，重庆409000【正文语种】中文【中图分类】X8我国地表水体粪大肠菌群含量普遍较高，部分水域含量甚至超过Ⅴ类水质标准数万倍［2］。
我国粪便微生物指标的评价还处于起步阶段，水质评价多以常规理化指标为主，对微生物指标的评价有待进一步加强。
目前水中粪大肠杆菌群检测方法主要有传统的滤膜法及多管发酵法，并且已经列入环保行业标准方法（HJ/T347-2007），此两种传统方法被国内环境监测部门广泛采用，但上述方法操作时间需2-5天，步骤较为繁琐，需验证试验。
多管发酵法每100毫升水样中最低检出限为2个粪大肠菌群［1］。
冯青英等人对传统的多管发酵法进行了优化，将水样接种至乳糖蛋白胨培养液后，在44.5℃±0.5℃培养箱中培养24h后直接读取结果［3］。
多管发酵法不受浊度的影响，可以对浊度较大的污水水样进行监测。
纸片法培养时间对阳性管率有明显影响，适用于测定受粪便污染程度较轻的水体［4］。
多管发酵法和纸片快速法均为行业标准，对粪大肠菌群的检测做出了详细的规定，现就两个标准中的异同做以下探讨。
纸片快速法测定水中粪大肠菌群质量控制研究
纸片快速法测定水中粪大肠菌群质量控制研究杨虹;王志强【摘要】本文对纸片快速法测定粪大肠菌群的质量控制进行了研究.结果表明,样品间的准确度和精密度结果都在质控范围内.通过加强质量控制可使获得的数据更加具有代表性和准确性,能满足相关环境标准和环保工作的要求.【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2019(000)003【总页数】2页(P151-152)【关键词】纸片快速法;粪大肠菌群;测定;质量控制【作者】杨虹;王志强【作者单位】天津市生态环境监测中心,天津 300191;天津市生态环境监测中心,天津 300191【正文语种】中文【中图分类】X830.5粪大肠菌群是具有一些特性并与粪便污染相关的细菌，是需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
粪大肠菌群数量不仅代表粪便污染程度，而且关系人体健康。
它是引起呼吸道、泌尿道以及伤口等感染的源头，还会引起肠道感染、伤寒、腹泻等诸多病状。
在测定水样中的粪大肠菌群时，若要保证水质监测获得的数据具有可靠性和代表性，就必须采取科学有效的质量控制手段。
在环境监测过程中要针对不同环节的特点采用不同控制方法，以实现对监测过程全面的质量控制，既可提高检测效率，又能更好地适应环境监测的需要。
大肠菌群利用纸片上的营养迅速生长繁殖，进一步分解乳糖产生酸，酸又能使溴甲酚紫指示剂由天蓝色转变成黄色，在黄色区域生长的大肠菌群所产生的脱氢酶使纸片上的基质分解脱氢，脱下氢转给受体氯化三苯基四氯唑（TTC），此时TTC接受氢之后，由无色变成还原后不溶于水的红色物质，即三苯甲胺。
通过以上显示剂的颜色反应就能判断出产酸产气的情况，从而判断纸片上是否有大肠菌群的存在，然后通过查MPN表即可明确相应大肠菌群的浓度值[1]。
1 材料与方法1.1 主要仪器及试剂主要试剂有水质大肠菌群测试纸片、无菌水、硫代硫酸钠溶液、乙二胺四乙酸二钠溶液[1]。
主要仪器和设备有恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、试管、移液管、采样瓶。
多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群
多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群李恒，等多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群Determination of Total Coliform Group and Fecal Coliform Group in Water by Multi-tube Fermentation and Paper Disk Method李恒张志君王光惠陈泓+（湖南省衡阳生态环境监测中心，湖南衡阳421000）［摘要］通过多管发酵法和纸片快速法对实际水样的总大肠菌群和粪大肠菌群进行实验比对，结果表明，两种方法的结果相差不大，但纸片快速法比多管发酵法操作简便、检测时间短，更适用于环境监测日常分析％［关键词］多管发酵法；纸片快速法；总大肠菌群;粪大肠菌群［中图分类号］X833［文献标识码］%引言粪大肠菌群是能在44.5!温度下生长并发酵乳糖产酸产气的耐热的大肠菌群，属于总大肠菌群的一部分，主要来自粪便。
水中粪大肠菌群和总大肠菌群的检验是研究水体污染和环境卫生的重要指标，具有广泛的卫生学意义。
目前，国内已颁布的标准主要是多管发酵法和纸片快速法［1+4］。
多管发酵法操作繁琐且时间过长（48~72h$,难以满足当前环境监测工作的需求［5］%纸片快速法不仅培养时间短（18~ 24h）,且无需提前准备培养基，可以避免培养基杂菌入侵和时间过长等不足。
为更精确、快速、可靠地进行监测，本文用多管发酵法和纸片快速法同步进行对比实验，并对两种分析方法的实验结果进行了比较分析。
1材料与仪器1.1材料水质粪大肠菌群、总大肠菌群快速检验纸片（广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司）；粪大肠菌群、总大肠菌群、培养基、革兰氏染色液％1.2试剂EC培养基：胰豚20g,乳糖5g,胆盐三号1.5g，磷酸氢二钾4g,磷酸二氢钾1.5g,氯化钠5g%将上述成分加热溶于1000ml水中，灭菌后的pH应在6.9左右。
该培养基在低温无菌条件下可以保存一个月％无菌水：将纯水在115!高压蒸汽灭菌20min,备用。
粪大肠菌群测定的多管发酵法与纸片快速法比对分析
1引言
粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪 便，在44.5 °C温度下能生长并发酵乳糖产酸产气切。 六盘水生态环境监测中心一直采用多管发酵法进行水 质中粪大肠菌群的测定,此方法精度高 ，但操做时间长, 步骤较为繁琐，需验证实验⑷，如果发酵管中存在其他 种类的产气菌，会致使检测结果偏离⑷。本次实验是对 多管发酵法与纸片快速法进行实验比对,对相同的实验 样品分别用此两种方法进行检测和结果评价 ，比较两种 方法的有效性和可比性。
<20 3.3X102
<20 1. 1X102
40 2. 4X103
2.4X103 2. 4X103
1.4X103 2. 1X101 1.6X104 1.4X104
表2粪大肠菌群实验结果判定
多管发酵法
95%置信限值
下限
上限
浓度 /(MPN/L)
/ 1. 1X102
/ 9.3X102
<20 2. 3X102
表3 粪大肠菌群平行双样实验结果判定
多管发酵法
95%置信限值
下限
上限
浓度 /(MPN/L)
纸片快速法
95%置信限值
下限
上限
1. 1X102
9.3X102
2. 3X102
70
7. 0X102
70 3. 7X102
7.0X102 3.4X103
1. 3X102 7. 9X102
30 2.5X102
3. 1X102 1. 9X103
2实验概况
2.1材料与方法 多管发酵法:乳糖蛋白培养基、EC肉汤培养基。 纸片快速法:BD105 I水质(粪)大肠菌群快速检验
纸片、BD105 H水质(粪)大肠菌群快速检验纸片。 2.2仪器和设备
质量管理(现场监测)选择题
质量管理持证上岗试题 (现场监测)选择题：1.《环境监测质量管理技术导则》HJ 630-2011要求，样品采集应根据监测方案所确定的采样点位、污染物项目、频次、时间和方法进行采样。
必要时制订采样计划，内容包括： _________ 交通工具以及安全保障等。
( )A. 采样时间和路线B. 采样时间和路线C. 采样人员和分工D. 采样器材正确答案：A、B、C、D2.《地表水和污水监测技术规范》HJ/T 91-2002要求，对流域或水系要设立_______等断面。
( )A. 背景断面B. 控制断面C. 削减断面D. 入海口断面正确答案：A、B、D3.《地表水和污水监测技术规范》HJ/T 91-2002要求，根据水体功能区设置控制监测断面，同一水体功能区至少要设置__ 个监测断面。
( )A.1B.2C.3D.4正确答案：A4. 《地表水和污水监测技术规范》HJ/T 91-2002要求，采样时， ______、DO、BOD5、有机物、余氯等有特殊要求的项目，不能用采样水荡洗采样器与水样容器。
( )A.细菌总数B.大肠菌群C. 油类D.挥发酚正确答案：A、B、C5. 《地表水和污水监测技术规范》HJ/T 91-2002要求，采样时，除一些有特殊要求的项目外，要先用采样水荡洗采样器与水样容器_____次，然后再将水样采入容器中，并按要求立即加入相应的固定剂，贴好标签。
( )A. 1～2B. 2～3C.3～4D. 4～5正确答案：B6.《水污染物排放总量监测技术规范》HJ/T 92-2002要求，废水采样时需采集不少于_______的现场平行样。
( )A. 5％B.10％C. 15％D.20％正确答案：B7.《水污染物排放总量监测技术规范》HJ/T 92-2002要求，测流时段内测得流量应与水量衡算结果误差不得大于_____。
( )A. 10％B.20％C. 30％D. 40％正确答案：A8.《水污染物排放总量监测技术规范》HJ/T 92-2002要求，因工业废水成分复杂，其中的强酸或强碱性物质对流量计或堰板有一定腐蚀作用，______对流量测量也会产生影响，为此必须加强流量计量装置的维护和保养。
水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法 征求意见稿
水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法征求意见稿
为了保证水质安全，控制疫情传播，本文介绍一种快速测定水质中总大肠菌群和粪大肠菌群的纸片快速法。
一、原理
本方法采用四氯化钴染色，将水样中的大肠杆菌转化为深蓝色紫色的水溶液中的杆菌，然后用过滤纸吸取样品中大肠杆菌杆菌的胞外成分，与专门的涂层结合，形成深紫色的杆菌珠，并进行定量比色分析。
二、材料和方法
1. 带有蓝色涂层的滤纸一支
2. 四氯化钴溶液
3. 水样
方法：
1. 取一片纸片，将其放入含有四氯化钴溶液的水样中，搅拌均匀。
等待5分钟。
2. 用净水彻底清洗纸片，并在滤纸周围波动，使大肠菌群在水中更容易分散。
3. 在处理好的样品中取一滴，用滤纸吸取。
4. 将纸片放入合适的容器中(如管子或托盘)，等待5分钟，直到纸片上形成紫色的结晶。
5. 用比色板或显微镜进行分析测量。
三、结果
根据纸片上杆菌珠的形成特征，可以快速测定水样中的大肠杆菌群和粪大肠菌群含量。
四、注意事项
1. 纸片处理过程中要严格保持无菌，避免外源菌污染。
2. 样品选择要具有代表性，尽量选取水流清澈，色泽透明，入口甜润的水源，避免河流污染或废水回流。
3. 纸片使用后应当严格清洗，避免杆菌珠继续生长。
4. 此方法仅适用于快速初步筛查水质安全，不适用于作为严格的水质监测标准。
饮用水大肠菌群检验纸片(五管法)
饮用水大肠菌群检验纸片(五管法)
产品编号： BD114
产品规格： 1份/包
产品用途：饮用水中总大肠菌群的快速检验
产品说明
1、适用范围
本产品适用于出厂成品水或直接饮用的矿泉水和纯净水中总大肠菌群的快速检验。
2、方法原理
将乳糖、显色剂和选择性培养基加载在纸片上，经培养后能够在纸片上生长并发酵乳糖产酸的即为大肠菌群阳性，记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数，根据大肠菌群MPN表查出相应的大肠菌群数。
执行标准：生活饮用水卫生标准（GB 5749—2006）。
3、操作方法
3.1、用灭菌吸管吸取10mL水样加入装有大纸片的塑料薄膜袋中，均匀涂布，共做5个重复；
3.2、将接种好的纸片放于培养箱中，培养温度为36℃±1℃，培养15～24h 观察结果。
4、结果判读
4.1、若纸片变黄或在黄色背景上呈现红色斑点为大肠菌群阳性，纸片保持紫蓝色不变或在紫蓝色背景上呈现红色斑点但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。
4.2、根据每个稀释度的阳性反应纸片数，查MPN表可得出水样中总大肠菌群的MPN值（见表1）。
如所有纸片均为阴性时，可报告总大肠菌群未检出。
4.3、对于阳性纸片，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。
用接种环在阳性菌斑处沾取少许带菌滤纸，用3mL灭菌生理盐水混匀，接种到大肠埃希氏菌耐热大肠菌群测试片上，进行培养和检验。
表1 用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果
组合时的最可能数（MPN）及95%可信限。
方法验证水质的粪大肠菌群
方法验证报告测试方法：HJ 347.2-2018测试项目：水质粪大肠菌群编写：日期：审核：日期：批准：日期：水质粪大肠菌群的方法验证1.目的确认所采用的方法适合于在本实验室进行对水质的粪大肠菌群的测定，照此方法检测和检验条件进行水样的粪大肠菌群检测，能保证检验结果的准确、可靠。
2.原理和范围2.1原理将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。
44℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。
通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。
2.2范围本法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。
3.主要仪器3.1 净化工作台。
3.2 立式高压蒸汽灭菌器。
3.3恒温恒湿培养箱。
3.4电热恒温鼓风干燥箱。
3.5电子天平。
3.6酒精灯、试管架、试管（带塞子）、平皿、小倒管、三角烧瓶（带塞子）、刻度吸管、采样瓶、接种环。
4.主要试剂乳糖蛋白胨培养液、EC培养液。
5.检验步骤5.1样品稀释与接种5.1.1 15管法将样品充分混匀后，在5支装有已灭菌5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品10ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品1ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品0.1ml。
对于受到污染的样品，先将样品稀释后再按照上述操作接种，以生活污水为例，先将样品稀释104倍，然后按照上述操作步骤分别接种10ml 、1ml 、0.1ml 。
当样品接种量小于1ml 时，应将样品制成稀释样品后使用。
按无菌操作要求方式吸取10ml 充分混匀的样品，注入盛有90ml 无菌水的三角烧瓶中，混匀成1：10稀释样品。
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水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定
（纸片快速法）
申请人
项目负责人员
制定原因
验证测方法符合实验室要求、确保数据准确性与有效性
方法适用范围
适用于地表水、地下水及废水中的总大肠菌群和粪大肠菌群的快速测定。
方法来源
HJ 755-2015《水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》
仪器、试剂和环境的要求
检测结果的判断
1.结果判读：
（1）制片上出现红斑或红晕且周围变黄，为阳性。
（2）纸片全片变黄，无红斑或红晕，为阳性。
（3）纸片部分变黄，无红斑或红晕，为阴性。
（4）纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围不变黄，为阴性。
（5）纸片无变化，为阴性。
2.结果计算：
根据不同接种量的阳性纸片数量，查MPN表得到MPN值，按公式换算并报告1L水样中总大肠菌群或粪大肠菌群数：
附件说明
表1
运行说明
经验证该方法符合我实验室使用。
审批意见
技术经理：
日 期：
总经理：
日期：
表1
C=100*M/Q
式中：
C—水样总大肠菌群或粪大肠菌群浓度（MPN/L）
M—查MPN表得到的MPN值(MPN/100ml)
Q—实际水样最大接种量（ml）
100—为10*10ml，其中，10将MPN值的单位MPN/100ml转换为MPN/L，10ml为MPN表中最大接种量。
3.结果表示：
测定结果保留二位有效数字，大于等于100时以科学计数法表示，结果的单位为MPN/L。平均值以几何平均计算。
1.仪器和设备
1.1高压蒸汽灭菌器
1.2培养箱
1.3冰箱
1.4 采样瓶
1.5 试管
1.6 水质总大肠菌群和粪大肠菌群测试纸片
2.试剂：2.1硫代硫酸钠 2.2乙二胺四乙酸二钠
采样和测试过程中，所用到的玻璃器皿需灭菌后方可使用。
方法描述
按MPN法，将一定量的水样以无菌操作的方式接种到吸附有适量指示剂（溴甲酚紫和2,3,5-氯化三苯四氮唑即TTC）以及乳糖等营养成分的无菌滤纸上，在特定的温度（37℃或44.5℃）培养24h，当细菌生长繁殖时，产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色，同时，产气过程相当的脱氢酶在适宜的pH范围内，催化底物脱氢还原TTC形成红色的不溶性三苯甲（TTF）。即可在产酸后的黄色背景下显示出红色斑点（或红晕）。通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而确定是否有总大肠菌群或粪大肠菌群存在，再通过查MPN表就可得出相应总大肠菌群或粪大肠菌群的浓度值。