徐英春真菌实验室检查的临床意义资料
真菌诱发院内感染的检验诊断及其临床价值探讨
真菌诱发院内感染的检验诊断及其临床价值探讨摘要目的探讨真菌诱发医院感染的检验诊断结果以及进行检验的临床意义。
方法114例最终检验诊断确定為真菌诱发感染的患者，根据数字随机抽取模式分为实验组与对照组，每组57例。
对照组没有进行真菌检测，仅根据经验采用广谱抗生素进行治疗；实验组发现异常及时进行真菌检测，根据检出的不同菌种采用相应的抗生素治疗。
观察实验组真菌检出情况，并对比两组患者的临床治疗效果。
结果实验组患者共检出真菌菌株81株，其中白色假丝酵母菌53株（65.43%），近平滑假丝酵母菌12株（14.81%），光滑假丝酵母菌5株（6.17%），热带假丝酵母菌5株（6.17%），新型隐球酵母菌4株（4.94%），克柔假丝酵母菌2株（2.47%）。
实验组患者症状好转时间（3.53±1.14）d、真菌转阴时间（5.34±1.32）d，对照组患者症状好转时间（7.22±2.04）d、真菌转阴时间（10.88±2.12）d，实验组患者症状好转时间及真菌转阴时间均明显短于对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
结论一旦患者在住院过程当中发现异于原发性疾病的感染，及时取感染物进行真菌检测，同时采取相对应的抗生素进行治疗，可以有效促进患者康复。
关键词真菌；医院感染；检验诊断；临床意义患者在住院过程当中，由于院内菌群感染而引发感染，会对病情好转造成较大影响，严重的甚至导致患者死亡。
引发真菌感染的种类分很多种，虽然在住院期间采取广谱抗菌药物，可以对感染给予有效控制，然而无法彻底杀灭感染菌群，对患者机体带来较大影响，进而导致机体当中的菌群失调[1-5]。
为此本文进行相关研究，报告如下。
1 资料与方法1. 1 一般资料选取2015年1月～2017年2月本院收治的最终经检验诊断确定为真菌诱发感染的患者114例作为研究对象，采取数字随机抽取模式分为实验组与对照组，每组57例。
实验组男34例，女23例；年龄19～58岁，平均年龄（35.4±12.8）岁。
真菌检测的临床意义(呼吸科)
精品课件
一、侵袭性真菌感染特点及诊断现状 二、G试验的临床意义 三、相关指南
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一、侵袭性真菌感染特点及诊断现状
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侵袭性真菌病（IFD）
定义
指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌 感染性疾病，危害性较大。
主要致病性真菌
1.念珠菌属 2.曲霉菌属 3.隐球菌 4.其他
所有真菌感染病例均患有基础疾病,患肺部疾病的真菌感染率居首 (32.43%),肿瘤伴发的真菌感染死亡率最高(15.66%) 。
呼吸科为真菌感染的高发科室，以肺部感染居首。
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1.贺密会等.中国药物应用与监测. 2012;01:544-546
临床问题 —病死率高
mortality(%)
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2.Tortorano AM et al.
高蕾,周 新.(1,3)-β-D葡聚糖检测在侵袭性真菌感染中的诊断意义[J]. 中国感染与化疗杂志,2008,3 (2),123-125.
➢对于念珠菌血症, G试验检测是首选检查
J. Clin. Microbiol. 2008.46:1009–1013.
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❖早期诊断
深部真菌感染增多且复杂，早期症状无特异性，往往被 原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。因此对深
• 某些样本难以获得
有必要建立快速、敏感、特异的理想诊断方法
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G实验的优点
➢可检测多种致病真菌感染
念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，毛孢子菌等
不能检测：隐球菌和接合菌 ➢G试验检测一般先于临床症状平均四天
BG值升高平均早于发热5 d， 早于呼吸道症状平均10.7 d， 早于HRCT检查平均9.3 d。
真菌临床检验工作的重要性
真菌临床检验工作的重要性真菌是一种真核细胞型微生物，存在细胞核但是无叶绿素，吸取营养方式主要包括寄生和腐生。
真菌在大自然中分布十分广阔，已知的大概有20万种左右，大部分不会对身体造成损伤，但是少部分会对致使动物和人类发病。
其中致使人类患病的真菌大致有300种，根据对人体侵犯位置的差异性将致病菌分为两大部分，即深部真菌和浅部真菌，浅部真菌会对指甲、毛发、皮肤造成侵犯，深部真菌会对内脏、深部组织、黏膜造成侵犯，如果情况严重还会产生全身播散性感染。
近几年随着体内留置导管、免疫抑制剂、放化疗、广谱抗生素的使用，致使真菌感染占比明显上升且严重。
这就需要对真菌进行检验以明确类型，进而为疾病的治疗提供有效数据。
一、引发真菌感染疾病的因素艾滋病、放化疗、导插管、静脉营养、器官移植、大手术、外伤、慢性消耗性疾病、尿毒症、血液疾病，长时间使用免疫抑制、皮质激素以及光谱抗生素，这些均属于真菌感染疾病诱发原因。
二、为什么要进行真菌检验随着真菌感染菌种构成的变化、新的条件致病真菌不断增加、真菌感染率的提高，真菌耐药性逐渐增加，临床必需重视真菌的检验工作，明确真菌的种类和耐药性，为疾病治疗提供参考数据，有助于加速患者恢复。
三、真菌培养和真菌直接检查的意义1.真菌培养：将病原菌从采集的标本中取出，明确有无真菌感染，区分真菌种类，可弥补直接检查的缺陷，还可以通过显微镜观察真菌的结构、形态、特征等，有利于全方面了解真菌，并指导临床治疗，此外获得的菌种还能够进行其他研究。
2.真菌直接检查：检验结果呈现阳性，可确诊患者感染真菌，如果为阴性则不确定是否感染真菌；通过真菌镜可以明确部分病原菌菌种，比如花斑癣菌、新型隐球菌等，还能够明确菌属，比如念珠菌属等；可见真菌形态，提示此菌在组织中的形态，也就是组织象；能够显示真菌的活动性，比如念珠菌产生假菌丝和真菌丝，皮肤癣菌菌丝粗壮且分叉多。
四、真菌培养和真菌直接检查1.真菌直接检验方法：在玻璃载片上放置标本，滴入载液后覆盖玻片，等待片刻后在火焰上快速通过三次，不可持续加热，预防结晶。
真菌实验室检查及敏感试验的临床意义-徐英春
1-8 .03-2 1-64 0.03-1 16 0.5 0.5-128 0.125-2 0.125-64.03-8 32-128 0.25-4 >64 >8
S S S / I? S S S S
S=敏感 S-DD=剂量依赖敏感 I=中介 R=耐药 Pappas PG et al, Clin Infect Dis 2004;38:161-89; Bartizal K et al, Antimicrob Agents Chemother 1997;41:2326-32; Patterson TF. J Chemother 1999;11:504-12; Pfaller MA et al, Antimicrob Agents Chemother 2002;46:1723-7; Pfaller MA et al, J Clin Microbiol 2002;40:852-6
氟康唑
S S S S / S-DD S-DD / R R S
伊曲康唑 两性霉素
S S S S S-DD / R S-DD / R S S S S S/I S/I S S/R
伏立康唑
S S S S / S-DD S / S-DD S S
Posa
S S S S / S-DD S / S-DD S S
卡泊芬净
病例C
• • • • • • • • •
患者：F67，COPD，DM，肺感染，高血压 09-01:双肺散在的斑点影，左侧肋隔角变钝 09-06入院：上呼吸机，气管插管，中心静脉插管，舒普深，阿奇 09-07：痰：烟曲霉 09-09：痰：热带念珠菌（＋＋＋）， TB(-)。 血培养（－）X2 09-10：痰：烟曲霉（＋），热带（＋），泰能，万古，安浮特克 09-13：单用特治星 09-16：痰：烟曲霉X3，有隔菌丝＋孢子（＋），血培养（－）X2 换卡泊分净3d ，后换安浮特克 09-19：血清半乳甘露聚糖抗原I＝1.316（＋） 痰：烟曲霉（＋）X2。真菌孢子（＋）X2 09-20：血培养（－）X2 09-23：I=1.709（＋），死亡
耳念珠菌≠“超级真菌”,对其恐慌“大可不必”
家庭医药 2019.058热点关注分子诊断北京市重点实验室副主任刘伟说，要搞清楚“超级真菌”，首先要明确“菌种”和“菌株”的概念。
他比喻说，如果把耳念珠菌这个“菌种”比喻成人类，“菌株”就像你、我、他一样，是不同的个体，“体质”也不一样。
“就像你怕热、我怕冷一样，耳念珠菌不同的菌株对药物的敏感性也是不同的，有的对药物就很敏感，有的就体现出高耐药性。
”刘伟说，只有多重耐药的耳念珠菌才是“超级真菌”，所以不能一见到耳念珠菌就说它是“超级真菌”，这个概念在传播中极易混淆，造成公众误解。
我国检测出的耳念珠菌没有“暴发”“流行”北京协和医院检验科、侵袭性真菌病北京市重点实验室主任徐英春指出，“首先，此前媒体报道所述的18例感染病例中，检出的耳念珠菌菌株都比较敏感，通俗地说，现在绝大部分广谱的抗真菌药都可以治疗它。
”“其次，这些病例是在近年间从不同医疗机构陆续检验出来的，并不是某个时间段或几家医院集中出现的，是散发现象。
”徐英春强调，“同时，从由北京协和医院牵头的CHIF-NET全国监测数据看，大约2万例菌株中才有1例耳念珠菌，因此不存在‘超级真菌’在我国‘暴发’或‘流行’的说法。
”□ 本刊编辑部耳念珠菌≠“超级真菌”，对其恐慌“大可不必”日前，一则“超级真菌爆发”的消息在网络中广泛流传。
该消息称，“超级真菌”被美国列为紧急威胁，中国已有18例确认感染；而且，一旦感染这种真菌，致死率超过60%，近50%的感染者会在90天内死亡。
该消息迅速“刷屏”，引发公众恐慌，更有甚者将其称为“生化危机”。
所谓“超级真菌”，是一种名为耳念珠菌，可以在住院病例中引起严重感染的真菌。
据介绍，耳念珠菌既可以引起有症状性的感染，也可以在体内携带而无症状。
耳念珠菌感染的高风险人群为患有严重慢性基础病或使用免疫抑制的人，如糖尿病、慢性肾病、HIV感染、肿瘤患者等。
同时，新生儿、插管或留置导管的患者、手术患者，以及使用广谱抗生素或抗真菌药全身用药患者也可感染。
真菌检测的临床意义(呼吸科)
汇报人：XX
目录
CONTENTS
真菌感染症状：皮肤、指甲、呼吸道等部位可能出现症状
真菌检测方法：显微镜检查、培养法、分子生物学方法等
真菌检测意义：早期发现真菌感染，及时治疗，防止病情恶化 真菌检测在临床中的应用：诊断真菌感染，指导治疗，评估疗效， 预防复发
真菌检测可以帮助医生评估患者疾病的严重程度，以便制定合适的治疗方案。 真菌检测还可以帮助医生判断患者是否需要接受抗真菌治疗，以及治疗效果如何。 真菌检测还可以帮助医生判断患者是否患有其他疾病，如免疫系统疾病等。 真菌检测还可以帮助医生判断患者是否患有真菌感染，以便采取相应的预防措施。
研究新型检测方 法，提高检测灵 敏度和准确性
开发快速检术，提 高检测效率
研究无创检测方 法，减少患者痛 苦和感染风险
提高医生对真菌感染的认识，加强诊断能力 推广真菌检测技术在临床中的应用 加强医生对真菌感染治疗方案的了解和掌握 提高医生对真菌感染预防措施的认识和执行能力
原理：通过检测血清中的抗 体来诊断真菌感染
局限性：不能确定感染的时 间和地点，需要与其他检测
方法结合使用
应用：主要用于诊断隐球菌 病、曲霉病等真菌感染
真菌感染的症状和体征 真菌检测在呼吸科中的应用
真菌检测的方法和原理
真菌检测的结果解读和临床 意义
检测方法：痰液培养、血清学检测、分子生物学检测等 评估指标：真菌负荷、炎症反应、肺功能等 临床意义：早期发现、早期治疗，降低死亡率和并发症发生率 治疗方案：抗真菌药物、免疫调节剂、支持治疗等
缺点：耗时较 长，操作复杂， 对实验环境要
求较高
组织切片：取病 变组织进行切片， 观察其形态和结 构
染色：使用特殊 染色剂对组织切 片进行染色，以 便更清楚地观察 真菌形态
真菌检测的临床意义(呼吸科)
共识中声明，G试验(1，3-β-D葡聚糖)、GM试验阳性是肺部真菌病的临 床诊断中微生物学证据之一
G试验作为诊断标准已纳入肺部真菌感染患者诊断 标准与治疗原则中。
2012年卫生部对抗菌药物分级管理政策
药物分级： 1 非限制使用级如，青霉素，苯唑西林 2 限制使用级 3 特殊使用级 如，哌拉西林/他唑巴坦 如，亚胺培南 卡泊芬净 氟康唑 伏立康唑
传染 检测周期
血培养 定性 差 不可区分 3-5天
G试验 定量 较好 可以区分 1-2小时
有必要建立快速、敏感、特异的IFD诊断方法 有文献表明，血培养可检测接合菌和隐球菌，弥补G试验的不 足，但敏感性和特异性很低，二者联合检测可提高诊断的灵敏度， 特异度和阳性预测值
表6医疗相关和医院获得性肺炎及呼吸机相关性肺炎实验室诊断 Table 6 Laboratory diagnosis of healthcare -associated pneumonia, hospital-acquired pneumonia and ventilator-associated pneumonia 病原体 真菌 曲霉菌属 诊断过程 最佳标本选择 运输容器和最佳运输时间
呼吸科IFI发生特点：
1，我国肺部真菌感染的病原菌以白色念珠菌和曲霉菌最常见。
其次为新隐球菌、放线菌、奴卡菌、毛霉菌、青霉菌，而芽生菌、孢子丝菌及组
织胞浆菌偶见报，肺孢子菌肺炎常见于器官移植、恶性肿瘤及AIDS的患者，是免疫 功能低下患者最常见、最严重的机会感染性疾病。
2，呼吸科真菌感染患者基础疾病: 包含慢性阻塞性肺疾病（COPD）、 肺炎、肺癌、呼吸衰竭等，其中COPD和肺炎最常见。 感染部位:下呼吸道(79.1%)和上呼吸道(20.9%), 念珠菌（83%）、曲霉（16%）。
真菌体外敏感性及临床意义解读
Li zhang,He wang,yingchun Xu. PLOS ONE ,2014, 9(12),1-12
比较方法
• 采用酵母菌稀释法新折点进行分析 • Essential agreement（EA）：MIC值相差两个稀释度以内 • Categorical agreement（CA）：分类一致，如两个药敏结果均为S、SDD(I)或者 R
• 棘白菌素类：卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净
抗真菌药作用机制
细胞膜
• 多烯类：插入含麦角固醇的细胞膜，形 成通道，造成K+外排 • 唑类：阻断麦角固醇合成
DNA/RNA合成
• 5-氟胞嘧啶
细胞壁
• 棘白菌素类：阻断葡聚糖合成
PUMCH W.Yao
Atlas of fungal Infections, Richard Diamond Ed. 1999 Introduction to Medical Mycology. Merck and Co. 2001
接种量 孵育条件
1×103~3×103 CFU/ml 35℃ 培养至产孢良好
30
非皮肤丝状真菌孢子菌悬液的制备
• 接种物：分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.4×104~5×104 CFU/ml，重复性好
– 诱导产孢：大部分霉菌PDA 35±2⁰C 7d或至产孢良好，毛霉和曲 霉48h，镰刀菌35±2⁰C 48~72h然后28~30±2⁰C培养至第7天 – 1ml 0.85%盐水，可加入1滴或0.01ml吐温20，尽量去除菌丝片段 。 – 静置3~5min，取上清转移至无菌管，振荡15s（注意气溶胶） – 使用1cm比色杯，测定530nm光密度：
11
CLSI M27-A3酵母菌 微量肉汤稀释法判读时间和标准
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S / SDD SDD / R
S S-DD / R
S/I S/I
S / SDD S / S-DD
S / SDD S / S-DD
克柔念珠菌
R
S-DD / R
S
S
S
葡萄牙念珠菌
S
S
S/R
SI=中介 R=耐药 Pappas PG et al, Clin Infect Dis 2004;38:161-89; Bartizal K et al, Antimicrob Agents Chemother
真菌实验室检查的临床意义
北京协和医院检验科
徐英春 谢秀丽 王辉 陈民钧
念珠菌菌血症在ICU成为严重的问题：
1978：在院内菌血症第5位最常见的分离的菌株 Ann Intern Med, 89;91-106 1999：在院内菌血症第4位最常见的分离的菌株 CID , 29;239-244 2002：严重的真菌感染超过了其他细菌感染 Bioorg Med Chem，10；1153－1170
氟康唑的MIC折点与临床的关系
MIC（ug/ml)
S: 8
粘膜念珠菌 ％(n/N)
77 (533/692)
SDD:16-32 8 ( 58/692)
R: 64 15(101/692)
侵袭性念珠菌 ％(n/N)
76(460/603) 12(72/603)
12(71/603)
Pfaller M, Diekema D， Sheehan D. Clin Micro REV， In Press，2006
医学重要的酵母菌分类
Segal B, Bow EJ, Menichetti F: Infect Dis Clin N Am 2002;16:935-64
条件致病的酵母菌
念珠菌属
白念珠菌
非白念珠菌
热带念珠菌 近平滑念珠菌 光滑念珠菌 克柔念珠菌 季也蒙念珠菌 葡萄牙念珠菌
隐球菌属
•新型隐球菌
毛孢子菌属
年代
%
1999~2005年克柔念珠菌所占比例 5
4 3
2 1
0 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 年代
酵母菌的NCCLS M27-A 1997 抗真菌药物的判定折点
氟康唑 5-氟胞嘧啶 伊曲康唑 # 两性霉素B* 伏立康唑@
S 8
4
0.125 0.5
1
SDD 16-32
卡泊芬净
S S S/I S S S S
抗真菌药物体外敏感试验与临床治疗
• 以氟康唑为例：
MIC <4µg/ml 4-8µg/ml 8-16µg/ml 16-32µg/ml
剂量 100mg/d 200mg/d 400mg/d 800mg/d
Hopenthal et al, Diagn Microb Infect Dis, 2004, 48:153-160
-
0.25-0.5 -
2
I
-
8-16
-
-
R 64
32
1
1
4
#粘膜中酵母菌 ；*非 NCCLS标准; @ CLSI未公布对念珠菌的折点
纸片扩散法敏感试验的判定标准
S:敏感
氟康唑对酵母菌
NCCLS M44-P. 2003
mm
19
SDD:剂量依赖敏感 15-18
R:耐药
14
伏立康唑对念珠菌，CLSI未公 布
1997;41:2326-32; Patterson TF. J Chemother 1999;11:504-12; Pfaller MA et al, Antimicrob Agents Chemother 2002;46:1723-7; Pfaller MA et al, J Clin Microbiol 2002;40:852-6
年代
%
1999～2005年热带念珠菌所占比例 18 16 14 12 10
8 6 4 2 0
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
年代
%
1999～2005年光滑念珠菌所占比例
20 18 16 14 12 10
8 6 4 2 0
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
•白吉利毛孢子菌 •头状毛孢子菌
非念珠菌属
酵母属
• 酿酒酵母
红酵母属
曲霉的药敏感试验与临床疗效
• Aspergillus spp, from 29 patients with IA
氟康唑的敏感性与念珠菌感染治疗的临床有效率
感染类型 粘膜
侵袭性
例数
692
603
S
92％ (488/533)
77％
SDD
62％ (36/58)
71％
R
41％ (41/101)
44％
合计
(353/460) (51/72) (31/71)
1295
85％ 67％ 42％
(841/993) (87/130) (72/172)
PUMCH 4年的医院内血流感染的监测
菌血症粗死亡率（1990-2003）
44.1 45
40
35
30
25
20
15
10
7.6
5
0 59例念珠菌
104例细菌
赵心懋 徐英春 PUMCH Data 2005
%
1999～2005年白念珠菌所占比例
60 50 40 30 20 10
0 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Pfaller M, Diekema D， Sheehan D. Clin Micro REV， In Press，2006
氟康唑的敏感性与念珠菌感染治疗的临床疗效
• 折点适合粘膜感染、侵袭性念珠菌感染 • SDD采用高剂量，疗效接近S的菌株 • SDD的有效率高于R的菌株
体外抗真菌药敏试验与体内的临床疗效
• NCCLS M27-A
600多株念珠菌的MIC值：分离自150多例AIDS的 食管念珠菌病，一致性好；治疗失败者，MIC>64 µg/ml
• 90-60原则：MIC值与临床疗效
药敏试验敏感的菌株：90%对治疗有效 药敏试验耐药的菌株： 60%对治疗有效
Mahmoud A.G, JCM 1996, 34:489-495；Rex J,CID 2002, 35: 982-989
mm
17
14-16
13
S＝Susceptible SDD=Susceptible-Dose Dependent R=Resistant
常见的念珠菌体外敏感性评估
菌株
白念珠菌 热带念珠菌
氟康唑 伊曲康唑 两性霉素 伏立康唑
S
S
S
S
S
S
S
S
Posa
S S
近平滑念珠菌
S
S
S
S
S
都伯林念珠菌 光滑念珠菌