斑点杂交法检测
病毒感染实验诊断
病毒感染实验诊疗1.（ 1 ）一般原则是特异敏感、迅速和简易。
第一依据流行病学和临床特色，初步判断可能感染的病毒。
（2）而后依据可疑病毒的生物学特色、机体免疫应答和临床过程，以及病人目前所处的机遇，确立实验诊疗方法。
2.（1）对潜藏期短，发病时还没有抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。
（2）对潜藏期超出十天的感染，可检测特异性的 IgM 抗体来进行早期迅速诊疗，及差别首次和再次感染。
（3 ）对可在体内形成连续感染或潜藏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无 4 倍以上涨高，或直接检测病毒核酸。
（4）对原由不明或有新病毒感染时，应收集标本进行病毒分别，同时应采纳双份血清以确认分其余病毒为病原体。
（5）对同一症状可有多种病毒惹起的状况，应同时检测几种有关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。
（6）对由多个型别构成的病毒可测定它们的共同抗原。
第一节标本收集与运送一、标本的收集1.采样时间：尽可能在发病的早期，急性期或患者人院的当日进行。
2.标本种类的选择：依据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感得病毒种类，选择相应部位采纳标本。
常有分别病毒标本的选择：3．常有标本的收集方法(1) 血液：以无菌取抗凝血10ml 。
抗凝采纳100n ／ ml 肝素钠。
用于分别CMV 、HSV ，、黄病毒、 EBV、 HIV-1及重生儿肠道病毒。
(2) 脑脊液：以无菌取脑脊液 1 ～ 2ml ，冰浴立刻送检。
在 4 ℃可寄存72h 。
用于分别柯萨奇病毒、 ECHO 病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。
(3) 宫颈或阴道拭子：采纳病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm 逗留 5 秒拿出，冰浴立刻送检。
用于分别HSV 、 CMV 。
(4)粪便标本：取 2 ～4 ｇ粪便加 10ml 运送液立刻送检，用于分别腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。
(5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。
用于分别流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV 等。
HPV临床常用检测方法
由于HPV不能在体外细胞培养，故不能用简便的血清血检测进行HPV的诊断和分型.临床上用于检测HPV的方法包括细胞学方法、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR 等,其中以PCR方法的敏感性最高，是目前应用最多感染的HPV型别、含量、持续时间决定病变的发展与预后,是进行HPV检测的主要内容.目前主要是通过应用分子生物学方法进行HPV DNA的检测.1、现有的HPV实验室主要检测手段:①聚合酶链反应（PCR, Polymerase Chain Reaction):扩增位于两段已知序列之间的DNA片断的方法。
该法有较高的敏感度，可进行HPV分型,缺点是对实验室环境要求较高，容易发生样本间的交叉污染，从而导致假阳性率高。
②核酸杂交检测有较好的特异性和敏感度，还可以进行HPV DNA的分型，各种核酸杂交检测方法有一定的优缺点.A核酸印迹原位杂交适用于HPV分型和HPV DNA分子量鉴定，虽然灵敏度高,但因操作复杂，需要新鲜组织标本,不便在临床上大规模使用。
B斑点印迹其敏感度和特异性均低于核酸印迹原位杂交法,虽然经济实用，但实验过程存在有放射性污染，是环保所不能轻视的问题.C原位杂交（in situ hybridization,一种核酸杂交技术，可用来测定基因或特定核苷酸序列在核酸分子的所在部位，检测重组体DNA）通过非放射性探针对石蜡组织进行检测，能作定位检测，假阳性率低,但灵敏度不高,大大降低了临床使用价值。
D杂交捕获法(Hybrid Capture）杂交捕获试验是利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大.首先使DNA双链释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链，DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂合体,特异性抗体将RNA—DNA杂合体捕获，偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA—DNA杂合体结合,碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量,从而确定RNA—DNA杂合体的含量。
能检测13种高危型HPV,包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68.各种检测方法的比较各种检测方法的比较HPV基因分型检测试剂盒（PCR—反向点杂交法）【产品用途】对人乳头瘤病毒（HPV）的感染情况进行定性检测并加以分型,能够检测23种HPV基因型，直接提示感染HPV的基因型;包括18种高危和5种低危型,可用于临床HPV感染的辅助诊断。
HPV临床常用检测方法
由于HPV不能在体外细胞培养,故不能用简便的血清血检测进行HPV的诊断和分型。
临床上用于检测HPV的方法包括细胞学方法、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR 等，其中以PCR方法的敏感性最高，是目前应用最多感染的HPV型别、含量、持续时间决定病变的发展与预后，是进行HPV检测的主要内容。
目前主要是通过应用分子生物学方法进行HPV DNA的检测。
1、现有的HPV实验室主要检测手段:①聚合酶链反应（PCR, Polymerase Chain Reaction）:扩增位于两段已知序列之间的DNA片断的方法。
该法有较高的敏感度，可进行HPV分型,缺点是对实验室环境要求较高，容易发生样本间的交叉污染，从而导致假阳性率高。
②核酸杂交检测有较好的特异性和敏感度，还可以进行HPV DNA的分型，各种核酸杂交检测方法有一定的优缺点.A核酸印迹原位杂交适用于HPV分型和HPV DNA分子量鉴定,虽然灵敏度高，但因操作复杂,需要新鲜组织标本，不便在临床上大规模使用。
B斑点印迹其敏感度和特异性均低于核酸印迹原位杂交法,虽然经济实用，但实验过程存在有放射性污染，是环保所不能轻视的问题。
C原位杂交（in situ hybridization,一种核酸杂交技术，可用来测定基因或特定核苷酸序列在核酸分子的所在部位，检测重组体DNA) 通过非放射性探针对石蜡组织进行检测,能作定位检测,假阳性率低,但灵敏度不高,大大降低了临床使用价值。
D杂交捕获法（Hybrid Capture)杂交捕获试验是利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大。
首先使DNA双链释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链,DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂合体，特异性抗体将RNA—DNA杂合体捕获,偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA—DNA杂合体结合，碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂合体的含量。
能检测13种高危型HPV,包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68.各种检测方法的比较各种检测方法的比较HPV基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法）【产品用途】对人乳头瘤病毒(HPV）的感染情况进行定性检测并加以分型，能够检测23种HPV基因型，直接提示感染HPV的基因型;包括18种高危和5种低危型，可用于临床HPV感染的辅助诊断。
基因工程(基因工程的主要技术与原理分子杂交技术)
Southern杂交主要用来判断某 一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片 段的大小。（DNA水平）
Southern杂交也可检测目的基 因的拷贝数。
CK 1 2 3 4 5
Southern bloting
这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面 可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以 检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显 示出目标蛋白。
五、Dot blot hybridization
1、原理：
在Southern杂交的基础上发展起来的用于 快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸 样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂 交检测。
凝胶
3）转移并固定到滤膜上
通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝 胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后 通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
Southern blotting 装置示意图
4）探针的制备及杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预 杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜 本身对探针的吸附。
当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交, 便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分 子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸 分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以 是RNA，或合成的寡核苷酸。
二、基本过程
1、核酸印迹（Nucleic acid blotting): 将核酸样品（DNA、RNA或蛋白质）在凝胶
在1975年，由英国的E. Southern首先设计发明的， 因此又称为Southern杂交（Southern blotting)。
基因操作原理名词解释
第一章1. Gene manipulation基因操作。
将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2. Interrupted genes间断基因。
序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3 .Promotor启动子。
DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
4. Subcloning亚克隆。
当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
第二章1.Restriction and modification限制和修饰。
宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends匹配末端。
识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。
3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Isoschizomer ：同裂酶。
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
5. Isocaudiners ：同尾酶。
来源不同、识别序列不同，•但产生相同粘性末端的酶。
6.Site preferences ：位点偏爱。
某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。
7.Star activity 星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
8. Nicking enzyme 切口酶。
核酸杂交技术.
碱性磷酸酶显色反应示意图
(DAB)
(TMB)
HRP酶显色反应示意图
（2）间接检测
检测含地高辛、荧光素或生物素标记的探针时， 就要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤。
Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联
Dig-DNA探 针 + 抗Dig
抗体-碱性磷
酸酶（或辣 根过氧化物 酶）+ 底物
一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，
即印迹（blotting）。
固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的
温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
Southern印迹杂交的基本步骤：
① 待测DNA样品的限制性内切酶消化
② 酶切DNA样品的电泳分离
③ 凝胶中DNA的变性和Southern转移
（三）Northern印迹杂交
Northern 印迹（Northern blot） 杂交是应用DNA探针检测特异
mRNA的另一种膜上印迹技术。
此项技术的原理和过程与 Southern印迹基本相同，只是检 测的分子是RNA，可用来对组织 或细胞中的mRNA进行定性或定 量分析。
丁肝应该做哪些检查,丁肝最常用的检查方法都在这
丁肝应该做哪些检查，丁肝最常用的检查方法都在这丁肝常见的检查方法凝血酶原时间（PT）、免疫印迹技术、血清胆碱酯酶（CHE）、丙氨酸氨基转移酶(ALT）、AST丁肝一般都有哪些检查方法一、检查1、尿液检查一般急性黄疸型肝炎病人在黄疸症状出现前，尿胆原及尿胆红素都为阳性。
2、血象检查分类计数中性粒细胞减少，淋巴细胞相对增多，白细胞总数正常或偏低。
二、肝功能试验 (1)血清酶测定：血清丙氨酸转氨酶(ALT)在黄疸出现之前就开始上升，在病极期达峰值。
慢性肝炎时ALT会反复波动。
急性肝炎可有极高的酶活性，恢复期随血清胆红素缓慢下降。
重型肝炎在胆红素急剧上升时ALT 反而下降，称为“酶疸分离”，这是病情重笃之征象。
天冬氨酸转氨酶(AST)：AST约4/5存在于细胞线粒体(ASTm)、1/5在细胞液(ASTs)中，线粒体损伤时，血清AST明显升高，反映肝细胞病变的严重性。
在病毒性肝炎时，ALT值高于AST值，尤其在急性病例，AST增高幅度不及ALT。
慢性病毒性肝炎病变持续活动时ALT/AST比例接近1，肝硬化时AST、增高常较ALT显著。
ALT、AST除在病毒性肝炎活动期可增高外，其他肝脏疾病(如肝癌、毒物、药物或酒精性肝损害等)、胆道疾患、胰腺炎、心肌病变、心力衰竭等多种疾病时亦可升高，应注意鉴别。
血清乳酸脱氢酶(LDH)、胆碱酯酶(ChE)、r谷氨酰转肽酶(r-GT)等在急慢性肝损害时都可有改变，但灵敏度及改变幅度均远不及转氨酶。
血清碱性磷酸酶(ALP)在肝内外胆管梗阻、肝占位性病变时可明显升高。
r-GT在胆汁淤积和肝细胞损害时可增高，可用其来鉴别ALP增高是否与肝胆疾病相关。
酗酒也可引起r-GT 增高。
慢性肝炎在排除胆道疾病后，r-GT增高表示病变仍活动，肝衰竭时肝细胞微粒体严重损坏，r-GT合成减少，血r-GT也下降。
(2)血清胆红素：病人在黄疸期血清胆红素为逐日升高状态，一般在1～2周内达高峰。
(3)蛋白代谢功能试验：低清蛋白(Alb)血症是肝脏疾病的一个重要指标，肝病的重度和病期会引起低清蛋白的降低程度。
HPV临床常用检测方法
由于HPV不能在体外细胞培养,故不能用简便的血清血检测进行HPV的诊断和分型。
临床上用于检测HPV的方法包括细胞学方法、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR 等，其中以PCR方法的敏感性最高，是目前应用最多感染的HPV型别、含量、持续时间决定病变的发展与预后，是进行HPV检测的主要内容。
目前主要是通过应用分子生物学方法进行HPV DNA的检测。
1、现有的HPV实验室主要检测手段:①聚合酶链反应（PCR, Polymerase Chain Reaction）:扩增位于两段已知序列之间的DNA片断的方法。
该法有较高的敏感度，可进行HPV分型,缺点是对实验室环境要求较高，容易发生样本间的交叉污染，从而导致假阳性率高。
②核酸杂交检测有较好的特异性和敏感度，还可以进行HPV DNA的分型，各种核酸杂交检测方法有一定的优缺点.A核酸印迹原位杂交适用于HPV分型和HPV DNA分子量鉴定,虽然灵敏度高，但因操作复杂,需要新鲜组织标本，不便在临床上大规模使用。
B斑点印迹其敏感度和特异性均低于核酸印迹原位杂交法,虽然经济实用，但实验过程存在有放射性污染，是环保所不能轻视的问题。
C原位杂交（in situ hybridization,一种核酸杂交技术，可用来测定基因或特定核苷酸序列在核酸分子的所在部位，检测重组体DNA) 通过非放射性探针对石蜡组织进行检测,能作定位检测,假阳性率低,但灵敏度不高,大大降低了临床使用价值。
D杂交捕获法（Hybrid Capture)杂交捕获试验是利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大。
首先使DNA双链释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链,DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂合体，特异性抗体将RNA—DNA杂合体捕获,偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA—DNA杂合体结合，碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂合体的含量。
能检测13种高危型HPV,包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68.各种检测方法的比较各种检测方法的比较HPV基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法）【产品用途】对人乳头瘤病毒(HPV）的感染情况进行定性检测并加以分型，能够检测23种HPV基因型，直接提示感染HPV的基因型;包括18种高危和5种低危型，可用于临床HPV感染的辅助诊断。
核酸分子杂交
59 59
marker 样品
转膜
凝胶
膜
滤纸 滤纸
marker 样品
Western
蛋白质 样品
聚丙烯酰胺凝胶电泳
缓冲液
marker
样品
marker 样品
一抗
二抗
X胶片 曝光
marker 样品
53 53
（二）Northern Blot
是指待测RNA样品经 电泳分离后转移到固相支 持物上，然后与标记的核 酸探针进行固-液相杂 交，检测RNA （mRNA）的方法。
➢ 样品是RNA。
➢ 电泳前，不酶切。
➢ 电泳前，样品变性。
➢ 电泳过程中，样品保 持变性状态。
➢ 电泳后，样品不再变 性，直接转膜。
2. 复性过程：
（1）单链分子间碰撞形成局部双链
（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列
（4）形成完整的双链分子
13
复性过程中的碱基配对
14
Hybridization
15
❖ 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双 链，如：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡 核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA，该特性是体外杂 交技术的基础。
EE
E
EE H
E H
DNA片段：
（最长的DNA片段控制在大约2 kb）
38
2.待测DNA样品的电泳分离
12
2000
1000 750 500
250 100
0.8 ~ 1％ 非变性琼脂糖凝胶
分子诊断技术
非放射性物质如:生物素、地高辛与酶等,杂
交后可通过底物显色、化学发光等技术进
行检测
核酸分子杂交示意图 核酸分子杂交
得程序
常用得核酸分子杂交技术
斑点杂交(spot blot hybridization)
凝胶电泳印迹转移杂交(Southern blot
hybridization)
巢式PCR〔nested-PCR〕
随机引物PCR
原位PCR(in-situ PCR)
简并引物
锚定PCR
多重PCR
…
实时荧光定量PCR荧光检测技术
SYBR Green I。就是一种结合于所有dsDNA
双螺旋小沟区域得具有绿色激发波长得染
料。
TaqMan 水解探针。由产荧光基团,荧光淬
基因芯片
基因芯片(或DNA Chip,或
Microarray)又称DNA微阵列,
就是指固定在固相载体上得高
密度DNA微点阵。即将大量靶
基因或寡核苷酸片段有序地,
高密度地(点与点间距一般小
于500μm)排列在玻璃、硅等
载体上,称之为基因芯片。
DNA Microarray
上图显示大量得DNA探针,按照一
分离、切割病毒得特定核酸片段获得;
用重组技术,将该片段克隆到细菌质粒,经扩
增与纯化大量获得;
选择已知病毒得一段基因序列,用人工方法
合成寡核苷酸,其长度以20个左右最为常用,
过短易出现非特异性杂交。
核酸分子杂交探针得制备
常见得用于标记探针得示踪物质
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斑点杂交法检测结核分枝杆菌临床应用价值探讨
作者：陆文英 作者单位：江苏省盐城市慈航医院， 江苏 盐城 224001
【摘要】 目的：探讨斑点杂交法检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:用抗酸染色法、
L-J培养法、PCR法和斑点杂交法平行检测76例临床标本和28种标准菌株。 结果:46例肺
结核患者痰标本抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法结核分枝杆菌检测阳性率分
别为43.4%、50.0%、73.9%和56.5%；30例非结核患者痰标本、19种非结核分枝杆菌和9
种非分枝杆菌标准株培养法和斑点杂交法检测结果均为阴性，PCR法有3例阳性。结论:斑
点杂交法检测结核分枝杆菌方法简便，结果可靠，可用于结核病的快速诊断。
【关键词】 结核分枝杆菌 点杂交 酸染色 L-J培养
The Clinical Value of Detection Mycobacterium
Tuberculosis by Dot Blot Hybridization
LU Wen-ying, et al
(Cihang Hospital of Yancheng City, Jiangsu Yancheng 224001,China)
Abstract:Objective: To study the clinical value of detecting mycobacterium tuberculosis by
dot blot hybridization. Methods: Acid fast stain , L-J culture ,PCR and dot blot hybridization
was uesd to detect the seventy-six clinical isolates and twenty-eight kinds of normal tuberculosis .
Result:Acid fast stain L-J culture ,PCR ,dot blot hybridization was used to detect the
mycobacterium tuberculosis of sputum of forty-six pulmonary tuberculosis,and their positive rate
was 43.4%,50.0%,73.9%,56.5% respectively.The results of thirty non-pulmonary
tuberculosis ,nineteen kinds of non- mycobacterium tuberculosis and nine kinds of
non-mycobacteri which was detected by culture and dot blot hybridization were all negative. The
results of three specimens were positive when they were detected by PCR.Conclusion:Using dot
blot hybridization to detect mycobacterium tuberculosis is simplified and the results is reliable. It
can be uesd to rapid diagnosis of TB.
Key words: Mycobacterium tuberculosis; Dot blot hybridization; Acid fast stain; L-J
culture
近年来结核病的发病率大幅提高，为早期、快速、准确诊断结核病，我们建立了斑点杂
交法直接检测痰标本中结核分枝杆菌，并应用于临床，同时与传统的涂片抗酸染色法、L-J
培养法、PCR法进行平行观察，以探讨其临床应用价值。
1 材料和方法
1.1 菌种来源: 19种非结核分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所，9种非分枝
杆菌来自中国科学院微生物研究所。
1.2 标本来源：46例结核病人痰标本来自2004年至2006年盐城第一人民医院门诊病
人和盐城市第二人民医院门诊、住院病人，所有病人均经培养或临床证实患有活动性肺结核，
30份非结核病人痰标本来自盐城第一人民医院呼吸科住院病人。标本采集后平行做4项检
查，首先集菌涂片镜检，余下标本经3%NaAC-NaOH处理后分别用L-J培养法、PCR法、
斑点杂交法进行检测。
1.3 试剂和仪器：斑点杂交法所用探针由上海生工公司合成，其5＇端以地高辛标记，
探针序列：5＇-GGT GGA AAG CGC TTT AGC GGT-3＇。FQ-PCR试剂由深圳匹基公司提供，
扩增仪为罗氏公司light cycle型。
1.4 方法
1.4.1 斑点杂交法：根据结核分枝杆菌16s rRNA保守序列设计探针，其5′端以地高
辛标记，标本经3%NaAC-NaOH 消化后，常规异硫氰酸胍裂解，酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀
法提取结核分枝杆菌rRNA，将抽提的rRNA纯化后直接点样于硝酸纤维膜上，用地高辛标
记探针杂交，酶呈色观察结果。
1.4.2 FQ-PCR法，严格按试剂说明书操作，同时作阳性，阴性对照。
1.4.3 集菌涂片抗酸染色法采用结核病诊断细菌学检验规程［1］推荐方法，痰培养采
用L-J培养法［1］。
1.5 统计学处理:采用PEMS3.0统计软件对数据进行X
2 检验。
2 结 果
2.1 四种方法平行检测结核患者痰标本中结核分枝杆菌，结果表明，集菌涂片镜检法，
L-J培养法、PCR法、斑点杂交法结核分枝杆菌的检出率分别为43.4%(20/46)、50.0%(23/46)、
73.9%(34/46)、56.5%(26/46)，结果见表1。表1 46例临床标本斑点杂交法与其它三种方法
平行检测结果（略）
2.2 30例非结核呼吸系统疾病患者痰标本和牛分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海鱼分枝
杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏加分枝杆菌、胃分枝杆菌、次要分枝
杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶然分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、龟分
枝杆菌龟亚种、不产色分枝杆菌、母牛分枝杆菌、浅淡黄分枝杆菌、草分枝杆菌、金黄色葡
萄球菌、表皮葡萄球菌、假白喉杆菌、草绿色甲链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓假单胞菌、卡
他球菌、大肠埃希菌、肺炎球菌检测结果显示，培养法、斑点杂交法均为阴性，PCR法有3
例阳性,培养法、斑点杂交法特异性为100%，而PCR法特异性为94.8%(55/58)。
3 讨 论
斑点杂交法根据结核分枝杆菌菌体内含有大量rRNA的特点，直接将细菌的rRNA抽提
后，点样于硝酸纤维膜上，用地高辛标记探针杂交，酶呈色观察结果，目前国内尚未见报道。
由于rRNA在细菌死后极易降解，一般认为只存在于活菌菌体内，故阳性具有结核分枝杆菌
活菌的诊断价值［2］。该法采用探针杂交的方法，具有较高的特异性，同时又采用酶呈色观
察结果，使杂交信号得以放大，提高了灵敏度，有一定的推广应用价值。
传统的结核分枝杆菌检测方法主要有集菌涂片法和培养法，涂片法具有简便、快速、
价廉的特点，但检出率较低，并需进一步试验才可确定是否为结核分枝杆菌，同时它不能鉴
别菌体的死活。培养法一直被作为结核分枝杆菌检测的金标准，然而检测时间长，不适合临
床早期诊治的需求，同时影响其检出率的因素较多，易造成漏诊。近年来兴起的PCR方法，
大大提高了检出率，但假阳性率较高，又有假阴性，从而影响其临床应用［3］。实验结果显
示，斑点杂交法检测结核患者痰标本中结核分枝杆菌，检出率为56.5%，高于集菌涂片法
（43.4%）和培养法（50.0%），低于PCR法的73.9%；30例对照组、19种非结核分枝杆菌
和9种非分枝杆菌标准株检测结果显示，斑点杂交法、培养法均为阴性，特异性为100%，
而PCR法有3例阳性，特异性为94.8%，由此可以看出，斑点杂交法检测时间短，结果准
确，且不会像PCR检测出现假阳性，可以用结核病的快速诊断。
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【参考文献】
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