MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT实验原理、步骤、注意事项
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT实验原理、步骤、注意事项
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
l MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2．MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
MTT法原理、步骤以及注意事项
MTT法原理、步骤以及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml 的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
MTT原理步骤结果分析方法及注意事项(精)
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项发布日期:2006-12-6 热门指数:2025MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
MTT步骤如下：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
注意事项：（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
MTT实验原理步骤注意事项
MTT实验原理步骤注意事项MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）实验是一种间接法测定细胞的代谢活性的方法。
MTT是一种黄色的溶液，在细胞内会被活细胞的线粒体内还原为紫色的结晶形式。
这些紫色结晶通过一定的溶解步骤转变为紫色的溶液，并使用酶标仪测量其吸光度。
吸光度的变化可以反映细胞的增殖和活性水平，从而评估药物或物质的细胞毒性。
1.细胞培养：选择需要研究的细胞株，并使用细胞培养基将其培养至对数生长期。
2.细胞接种：将对数生长期的细胞用细胞培养基洗涤，获得单细胞悬浮液，并在96孔板中接种相应的细胞密度。
3.处理药物：根据实验需求，选择适当浓度的药物或化合物，并将其加入每个孔中。
4.处理时间：根据需求和实验目的，将药物处理时间设定为不同的时间段。
5.加入MTT溶液：在处理药物和处理时间后，将MTT溶液加入每个孔中，并使其充分与细胞接触。
6.溶解晶体：处理一段时间后，将培养基和MTT溶液完全吸取，然后添加溶解晶体溶液，使晶体溶解。
7.检测吸光度：待溶解晶体完全溶解后，使用酶标仪测量每个孔的吸光度，并将结果记录下来。
8.数据分析：根据吸光度的变化，可以计算得到药物对细胞的毒性，评估药物或物质的效果。
1.培养条件：选择合适的细胞培养基和培养条件，确保细胞能够保持良好的生长状态。
2.细胞密度：将细胞密度恰当控制在合适范围内，避免过度或不足，影响实验结果。
3.药物浓度：选择适当的药物浓度范围，避免浓度过高或过低，影响实验的结果。
4.处理时间：根据需求和实验目的，选择合适的处理时间，使药物对细胞产生明显的影响。
5.溶解晶体溶液：使用溶解晶体溶液时，要充分搅拌使晶体完全溶解，避免气泡产生。
6.数据分析：对实验结果进行正确的数据分析，根据实验的目的和要求进行合理解读。
总结：MTT实验通过将MTT溶液与细胞相互作用，最终通过吸光度的变化来评估药物或物质的细胞毒性。
MTT法原理步骤以及注意事项
MTT法原理步骤以及注意事项MTT法（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide法）是一种常用的细胞活力检测方法。
它通过测量细胞对MTT染料的还原能力来评估细胞的代谢活性和存活率。
MTT法的原理简单，步骤清晰，但也需要注意一些关键点以确保结果的准确性。
下面将详细介绍MTT法的原理、步骤以及注意事项。
1.原理：MTT是一种黄色的可溶性染料，它可以进入活细胞并被还原为紫色的形式，同时在还原过程中生成的产物能够积累在细胞内，形成紫色晶体结构。
这种紫色产物可以通过加入有机溶剂（如二甲基亚砜或二甲基甲酰胺）来溶解，并且通过测量其吸光度，可以对细胞的代谢活性进行定量分析。
2.步骤：MTT法通常包括以下步骤：步骤一：培养细胞首先，需要将细胞培养在含有适当培养基的组织培养皿中，并放置在37°C的恒温培养箱中培养到细胞达到一定密度。
步骤二：接种细胞将需要检测活力的细胞接种在96孔板中，每孔含有适当数量的细胞。
通常每孔含有约1×10^4至5×10^4个细胞。
步骤三：添加MTT染料将MTT染料溶液加入到每孔中，使其与细胞均匀接触。
染料浓度通常为0.5至1mg/mL。
步骤四：孵育细胞将96孔板放回恒温培养箱中，继续孵育细胞。
通常在37℃下孵育2至4小时，使细胞有足够的时间还原MTT染料。
步骤五：加入溶解剂去除培养液后，加入溶剂（如DMSO）溶解产生的紫色晶体。
溶剂的用量通常为100µL至200µL。
步骤六：测量吸光度用多通道酶标仪或分光光度计测量溶液的吸光度。
使用波长为570nm 至650nm的滤光片进行测量，同时使用一个基准波长（例如630nm）来进行校正。
3.注意事项：-MTT染料的浓度和作用时间应根据实验要求进行优化。
过高的浓度可能引起细胞中产生结晶体积过大，影响测量准确性。
-为了确保细胞的一致性和准确性，需要在实验开始前培养细胞的时间和条件相同。
MTT原理方法及操作步骤
MTT原理方法及操作步骤MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
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MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
（可参考Sigma，货号M5655，Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
l MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2．MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
（个人觉得其溶解的能力不如DMSO强）该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS 结晶全部溶解后再使用。
五、MTT法实验步骤1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。
细胞详细计数方法请参照中的相关文章。
对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。
以一般细胞培养常用的25cm2为例，1)细胞密度在长到约80%~90%（下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态），消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。
2)另取一支新的15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml培养基.3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。
4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2×104/ml），细胞毒性实验每孔5000—10000个（相当于细胞悬液密度为5×104/ml）。
此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。
比如：生长较快的细胞密度可略小。
2．将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。
注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。
3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。
下图可做为96孔板的的参考步局。
●对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。
但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。
另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。
4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。
下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。
5.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
6.终止培养，准备溶解结晶。
●溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解1)MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。
将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。
有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。
个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。
采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。
2)每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
●另一种方法，用三联溶解液（见上面MTT甲瓒溶解液）1)MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。
这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。
（该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。
）2)放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。
通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。
如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。
如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。
在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。
个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
六、MTT结果分析关于如何计算IC501、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：药物浓度ug/ml100502512.5MTT所有问题大汇总实验前应明确的问题1. 选择适当的细胞接种浓度。
一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。
但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2. 药物浓度的设定。
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。
切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。
在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4. 培养时间。
200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6. 理论未必都是对的。
要根据自己的实际情况调整。
7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8. 避免血清干扰。
用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。
由于试验本底增加，会试验敏感性。
因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。
在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。