液相色谱基本知识
液相色谱的结构原理和基本知识 液相色谱操作规程
液相色谱的结构原理和基本知识液相色谱操作规程液相色谱(HPLC)法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的固定相的柱色谱分离技术。
液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用液相色谱来分析。
液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
液相色谱分析原理(1)、液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在佳条件下得以分离。
(2)、液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
液相色谱介绍
液相色谱介绍液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种分离和分析样品成分的实验室技术，属于色谱分析方法的一种。
它是利用样品在固定相和移动相之间分配系数的不同，实现成分分离和检测的方法。
液相色谱因其高灵敏度、高分辨率、广泛的应用范围等特点，在化学、生物、食品、环境等领域具有重要意义。
液相色谱的主要组成部分包括：1. 色谱柱：色谱柱是液相色谱的核心部件，用于分离样品成分。
它由固定相（stationary phase）和填充物组成，固定相的选择取决于分离目标和样品性质。
2. 流动相：流动相是液相色谱中用于载带动态成分的溶液。
其选择和配比对于色谱分离效果至关重要。
通常，流动相由溶剂、缓冲液和添加剂组成。
3. 进样器：进样器用于将样品引入色谱柱。
常见的进样器有手动进样器和自动进样器。
4. 检测器：检测器用于检测分离后的样品成分。
常见的检测器有紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
5. 泵：泵用于驱动流动相在色谱系统内循环，保证样品分离过程的进行。
液相色谱的保养知识包括：1. 色谱柱保养：长时间不用时，色谱柱内应充满溶剂，两端封死。
正相色谱柱使用相应的有机相，如ACN。
2. 手动进样器：使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。
3. 流动相：使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。
4. 带seal-wash的1100，要配制90%水10%异丙醇，以每分23滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。
5. 定期检查和维护：根据说明书或现场工程师的建议，定期检查液相色谱仪的性能，确保其在良好状态下运行。
总之，液相色谱技术的应用领域广泛，可为科研和生产提供准确、有效的分析手段。
了解液相色谱的原理、保养方法以及相关应用，有助于更好地利用这一技术进行科学研究和生产实践。
液相色谱基础知识
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
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■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
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■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
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梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
经典液相色谱知识点总结
经典液相色谱知识点总结液相色谱（Liquid Chromatography, LC）是一种以液相为驱动相，将待测样品在静态相中进行分离的色谱分析方法。
液相色谱在分离生化样品、药物、天然产物等化合物时得到了广泛的应用。
本文将系统总结液相色谱的知识点，包括原理、分类、仪器设备、色谱柱、检测方法等方面的内容。
一、原理液相色谱的原理基于化合物在静态相（色谱柱填料）和流动相（溶剂）之间的分配与分离过程。
待分析的化合物在流动相与静态相之间的分配系数不同，因此当待测样品溶液通过色谱柱时，根据不同化合物在静态相中的分配行为，可以实现化合物的分离。
在液相色谱中，流动相主要由溶剂和缓冲液组成，可以根据需要进行调整。
而静态相则是色谱柱填料，填料的选择对色谱分离效果至关重要。
填料的种类、粒径、表面性质等都会影响到分离效果。
二、分类根据静态相的不同，液相色谱可以分为几种常见的类型：1、反相色谱：静态相是疏水性填料，流动相是亲水性溶剂，被分离物质的极性与填料相反。
反相色谱对极性化合物具有较好的分离效果，因此在分析生化样品、药物等方面得到了广泛的应用。
2、离子交换色谱：静态相是带电离子交换树脂填料，可进行阴离子或阳离子的分离。
离子交换色谱适用于分析离子化合物，如蛋白质、核酸等。
3、尺寸排除色谱：静态相是孔径大小均一的凝胶填料，根据分子大小进行排除分离。
尺寸排除色谱适用于分析大分子化合物，如蛋白质、多糖等。
4、亲和色谱：通过生物亲和分离剂与化合物间的特异性结合实现分离，主要应用于生化分析领域。
5、扩展液相色谱：液相色谱的一种改良方法，通过使用超高性能色谱柱和压力增加装置来提高分辨率。
三、仪器设备液相色谱仪器主要包括流动相输送系统、样品进样装置、色谱柱和检测器等部分。
1、流动相输送系统：用于输送流动相的高性能泵，包括梯度泵和等速泵两种，可实现不同流动相梯度的传送。
2、样品进样装置：通常采用自动进样系统，可实现自动进样、样品预处理等功能。
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
液相色谱知识原理
液相色谱知识原理液相色谱（Liquid Chromatography，LC）是一种基于溶液通过固定相进行分离的色谱技术。
液相色谱广泛应用于化学、生物、医药和环境等领域，可对复杂样品进行分离和定性、定量分析。
液相色谱的原理包括四个基本步骤：压力或重力注射进样、样品分离、组分检测和数据处理。
液相色谱的原理可分为两个方面：固定相和流动相。
固定相指的是涂覆在色谱柱内壁的固定介质，主要用于对样品进行分离。
流动相则是被推动通过色谱柱的溶剂，也称为移动相。
固定相的选择是液相色谱分离的关键。
常用的固定相是固定在色谱柱内壁上的吸附剂，如硅胶、C18硅胶等。
这些吸附剂具有不同的极性和亲水/亲油性，可用于分离样品中的不同组分。
固定相也可以是离子交换柱，用于分离带电离子。
流动相的选择取决于样品的特性和分离条件。
它可以是有机溶剂（如甲醇、乙醇等）和水的混合物，也可以是含有缓冲剂和离子对试剂的溶液。
流动相的选择应使得样品中的组分在色谱柱中得以分离并得到适当的保留时间。
液相色谱的分离原理基于物质在固定相和流动相之间的分配行为。
当样品进入色谱柱时，固定相上的吸附剂会与样品中的化学物质发生相互作用。
化学物质在固定相表面上吸附的速度会受到如温度、溶剂浓度、样品pH值等因素的影响。
在液相色谱中，样品溶解在流动相中形成一个移动流动液。
这个移动流动液会在固定相上形成一个或多个流动液前线，流动液前线能退火样品分子的吸附速率。
当样品分子到达不同程度的吸附速度时，它们会得到分离。
这种分离可以通过调整溶剂比例、固定相性质和样品分子结构等方法进行优化。
组分检测是液相色谱的另一个重要步骤。
常用的检测方法包括紫外可见光谱、荧光检测、电化学检测等。
紫外可见光谱检测是最常用和常见的检测方法，它基于化合物吸收可见光和紫外光的特性进行分析。
数据处理是液相色谱实验的最后一步。
数据处理的目的是对分离出的组分进行定量分析和定性分析。
常用的数据处理方法包括校正曲线法、内标法等。
液相色谱教程-液相色谱基础知识2
YOU
拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
色谱图名词术语
基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号 – 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化 – 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动 – 谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象
-25%
液相色谱的应用
目的:得到数据-定性及定量分析
– 灵敏度的要求 – 样品的复杂性 – 样品量的要求 – 精度及准确度的要求 – 容易使用
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液相色谱的应用
制备型液相色谱 目的:得到纯品-分离及纯化 • – 化合物的稳定性 • – 样品的复杂性 • – 制备量的要求 • – 纯度的要求，及纯度的鉴定 • – 方法的安全性
半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通 过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两 侧相交两点之间的距离
色谱图名词术语
– 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高对应峰宽的一 半
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色谱图名词术语
死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留 的组分,从进样到出现峰最大值所需的时 间 – 保留时间(tR)(Retention time):组分从 进样到出现峰最大值所需的时间
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结
高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）HPLC应用一、样品测定1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。
所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。
弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。
某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml 和50ml），因此应注意进样量是否一致。
（可改变样液浓度）5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。
有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。
否则会使柱床下塌，叉峰。
柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。
如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。
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流动相注意点
离子对试剂的使用 具有缓冲盐流动相的使用 分析结束
及开始
流动相平衡 加快平衡时间 异丙醇的使用
返回
柱塞往复泵
马达和凸轮
泵头
柱塞杆 柱塞杆密封圈
单向阀 10 -100uL
单向阀
单向阀结构
宝石球 抛光面
Si
正相HPLC色谱柱
硅胶型 氰基型 氨基型 糖类分析 二醇基型 蛋白质分析
Si Silica gel
-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
Si
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Modified Si
色谱柱的联接
不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时,会造成 色谱峰展宽致使柱效下降。
渗漏。Βιβλιοθήκη 色谱柱的保护建立色谱柱的在线保护装置 在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱 目的：给色谱柱提供物理及化学保护
色谱柱的活化
对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 硅胶柱的一般方法：先用甲醇洗去极性杂质， 再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100～200ml依 次活化
液相色谱基本知识
液相色谱流程图
进样器 输液泵 流动相
色谱柱 柱温箱
检测器 数据处理
流动相
流动相选择注意事项： ▪ 纯度：采用“ HPLC ”级溶剂及超纯水 ▪ 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶
剂 ▪ 对试样有适宜的溶解度 ▪ 溶剂粘度要小 ▪ 与检测器相匹配 ▪ 流动相配制时的顺序 ▪ 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内。 ▪ 缓冲液（盐）的浓度
流动相
▪ 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱 柱。
▪ 过滤膜种类 水系过滤膜 有机系过滤膜
流动相前处理
脱气：采用超声或过滤方式。
目的：除去流动相中溶解或因混合而产生 的气泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比 单个溶剂所能容纳的空气总量要小
吸滤头
材料：不锈钢烧结或陶瓷，孔径10um 故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成 措施：不锈钢烧结材料用异丙醇或5％稀硝酸，
垫圈 不锈钢接头
PEEK接头
优点：灵敏度高；对温度及梯度不敏感
缺点：对紫外无吸收物质无法检测
二极管阵列检测器
优点：得到多个波长的色谱图；
得到每个色谱峰全波段的吸收光谱图；
得到三维谱图
可进行峰纯度检查，定性能力强
管线选择
材料 不锈钢 Teflon PEEK (聚醚酮)
尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.
Teflon (用于柱后阻尼管、反应管和排液管) 化学惰性大 能承受 5 kgf/cm2 压力
接头
不锈钢接头 / 垫圈 主要用于输液泵、进样器的连接 能承受 400 kgf/cm2压力 一旦固定，垫圈不可再动
PEEK接头 主要用于色谱柱、检测器的连接 易于安装 能承受 250 kgf/cm2压力 容易产生死体积
球座 流动相
单向阀原理
吸液冲程
排液冲程
出口单向阀
泵头 进口单向阀
高压/低压梯度系统
高压梯度
低压梯度
混合器
低压梯度比例阀
脱气机
高压/低压梯度系统
高压梯度系统
梯度准确度好 系统复杂 (需两台或三台泵)
低压梯度系统
系统简单 需在线脱气机 存在时间滞后效应
返回
进样器
▪ 自动进样器 ▪ 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
返回
手动进样器的原理图
装填状态
进样状态 返回
进样体积与响应值关系
检
测
器
响 应
部分注入
值
定量管体积的一半
全量注入 3倍定量管体积
进样体积 返回
色谱柱的使用
拿到一根从未用过的色谱柱时，一定要先看其 使用说明！
测柱效：拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留 在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试 条件，定期检测柱效，定期检测仪器的谱带展 宽
注意流动相的转换；流速(压力)的变化幅度； 温度的变化幅度；各专用色谱柱对样品及溶剂 的要求
反 相 HPLC 色 谱 柱
C18 (ODS) type C8 (octyl) type C4 (butyl) type Phenyl type
Non-polar property -Si-C18H35
输液时不要打开排液阀
LC-10AD :::::::
000 0
000 0
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
7
8
9
4
5
6
1
2
3
0
xxxx
Back
色谱柱柱效降低原因
滤片或填料堵塞 样品或流动相中杂质吸附 机械振动及突然失压产生空隙 填料变性
色谱柱
使用注意点：
1）柱压低于200kgf/cm2（bar） 2）柱温在40℃左右，好不超过50℃ 3）流动相pH使用范围为2～7.5 4）不要用纯水冲洗柱子
示差检测器
原理：基于测定流动相中溶液折射率来 测定试样中各组分浓度
优点：通用
缺点：对温度变化敏感
不能用于梯度
灵敏度中等
管线材料
不锈钢 (可用于所有连接) 能承受几千 kg/cm2 压力 酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时)
PEEK (可用于所有连接) 能承受高达 250 kg/cm2压力 可在整个pH范围(pH 1-14)内使用 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等
键合相柱(烷基)的一般方法：20倍柱体积的 甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗
记住∶每种色谱柱可能有特定的方法，一定要 先看其使用说明！
色谱柱的存放
存放前的处理：除去杂质、缓冲盐 合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干涸 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度
机械振动及突然失压产生空隙
不要撞击色谱柱如 色谱柱掉落或柱压急剧变化
返回
LC检测器
▪ 紫外可见检测器（UV/VIS） ▪ 二极管阵列检测器（PDA） ▪ 示差检测器（RID） ▪ 电导检测器（CDD） ▪ 荧光检测器（RF） ▪ 电化学检测器（L-ECD） ▪ 质谱检测器（MS） ▪ 蒸发光散射检测器（ELSD）
紫外检测器
原理：基于被分析组分对紫外吸收的强度进行 检测