GST pull down的原理以及具体操作流程
GST-pull-down实验技术原理和实验流程
➢ 5、3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清（注意不要扰动底层 的Sepharose）；
➢ 6、重复步骤5三次; ➢ 7、吸干Sepharose上面的液体后，加入20~30微升1 ×蛋白电泳
上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于-20℃备用； ➢ 8、做SDS-PAGE和Western blot检测另一个蛋白。
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化
➢ 1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子， 4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心5min，弃上清。该Ni-NTA珠子上结 合了His-B融合蛋白。
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
➢ 1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%Glutathione Sepharose 4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合 了GST-A融合蛋白。
Western Blot
GST pull-down原理：
基本原理：
GST pulldown实验技术
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
GST pull-down实验
百泰派克生物科技
GST pull-down实验
GST pull-down实验原理
Pull-down（拉下实验）是一种体外亲和纯化蛋白的技术，Pull-down技术利用被亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）标记的已知的蛋白特异性识别混合体系中的配体蛋白，以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。
当诱饵蛋白被谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记时进行的Pull-down实验，称为GST pull-down实验，也称GST pull-down融合蛋白沉降技术。
GST pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来发掘未知的蛋白或肽的相互作用。
GST pull-down实验应用
了解蛋白质间的相互作用可进一步探究某项生理活动的分子机制，GST pull-down 技术在研究不同生物体内蛋白相互作用方面得到了广泛的应用。
GST pull-down技术联合高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)可对相互作用蛋白进行定性定量分析，研究蛋白互作网络及由此介导的信号通路和调节机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的GST pull-down蛋白互作分析一站式服务，后续基于液质联用技术（LC-MS/MS）对IP、Co-IP样品及GST融合蛋白Pull-down等纯化样本中的蛋白/蛋白混合物的质谱鉴定。
欢迎免费咨询152-****7680。
gstpulldown实验流程
gstpulldown实验流程GST pull down是将GST融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上，与溶液中的目的蛋白相结合。
可用来确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用。
先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上，再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育，这样互作蛋白便一起吸附在Beads上。
洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，即GST pull down产物。
这种互作复合物既可以用WesternBlot检测已知蛋白，也可用质谱鉴定出未知蛋白。
辉骏生物可制备GST融合蛋白，多种GST pulldown蛋白互作方案供客户选择，保证GST融合蛋白沉降技术服务到成功发表文献。
糖代谢异常是癌症的突出特征，作者前期研究发现肝细胞癌(HCC)中的糖原含量降低，并与患者总体生存情况不良相关。
探索HCC中的异常糖代谢机制或许可以为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。
>RNA-seq和qPCR等结果显示HCC组织中的GYS2(糖原合成酶2)显著下调，并与患者不良预后相关>细胞和小鼠实验表明GYS2的缺失促进了肝癌细胞增殖和肿瘤生长>GYS2敲除细胞的RNA-seq实验发现p53通路都受到明显抑制>Co-IP和GST pull down证明GYS2通过与p53的直接相互作用发挥肿瘤抑制功能>CO-IP和GST pull down实验发现GYS2、p53和E3泛素连接酶MDM2相互作用形成复合体，GYS2与p53竞争结合MDM2来抑制p53泛素化，稳定p53蛋白水平>荧光素酶和ChIP等实验表明p53蛋白结台GYS2启动子，通过p300介导的乙酰化，在转录水平上抑制GYS2>对HBV阳性肝中的关键致癌蛋白HBx的研究发现,HBx、HDAC1与乙酰化的p53相互作用,共同抑制了GYS2本研究首次报道了HCC组织中糖原含量显著降低，并与不利的患者预后相关，这归因于新发现的HBx/GYS2/p53信号轴。
GST pull-down实验技术
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
gst pull down原理
gst pull down原理Gst Pull Down原理Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。
这种技术可以提高视频的平滑度和流畅度，使观看体验更佳。
本文将详细介绍Gst Pull Down的原理。
一、什么是Gst Pull Down？Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。
在电影制作中，通常使用24帧/秒来拍摄和编辑电影。
但是，在播放时，大多数电视和显示器都以30帧/秒的速度播放视频。
因此，如果直接播放24帧/秒的电影，则会出现画面抖动或不流畅等问题。
二、为什么需要Gst Pull Down？在播放24帧/秒的电影时，由于每个画面之间存在较长时间间隔，因此画面会出现抖动或不流畅等问题。
而将24帧/秒转换为30帧/秒，则可以使画面更加平滑流畅，提高观看体验。
三、Gst Pull Down原理1. 3:2 Pulldown在进行Gst Pull Down时，通常采用3:2 Pulldown方法。
这种方法利用了电影制作中使用的24fps（frames per second）与NTSC （National Television System Committee）制定的30fps之间的差异。
具体来说，将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频，需要将每个电影画面分成两个半画面，然后再将其转换为三个NTSC画面。
2. 操作步骤具体来说，Gst Pull Down的操作步骤如下：（1）将24fps的电影分成两个半画面（Odd Field和Even Field）；（2）将Odd Field插入到第一帧和第二帧之间，形成一个新的NTSC 画面；（3）将Even Field插入到第三帧和第四帧之间，形成另一个新的NTSC画面；（4）重复以上步骤，直到所有24fps电影画面都被转换为30fps视频。
3. 效果通过Gst Pull Down处理后，原本24fps的电影就可以以30fps的速度播放，并且画面更加平滑流畅。
GST-pull-down实验原理与步骤
GST pull down实验原理与步骤GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。
此方法操作方便，简单易行。
GST pull down实验原理GST pull down的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合。
简单来说，我们假定a蛋白和b 蛋白可能存在互作，将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST 的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。
通过Western blot检测结果，我们可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应的条带，即表明了a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-a pull down（GST对照只显示一个条带）。
GST pull down实验步骤一、GST-a融合蛋白的制备1．GST-a融合蛋白的表达(1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中；(2)挑取单克隆到含有5ml LB培养基（加入5ul氨苄）的10ml试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜；(3)将培养菌液转移到含有500ml LB（含500ul氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200rpm培养数小时；(4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm 条件下培养10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）；(5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50ml离心管中，4℃4000rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中；(6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10min后弃去上清，再按每10ml菌液沉淀1ml PBS 的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中；(7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）1、⽤GST-PAK-CRIB融合蛋⽩载体转化BL21感受态细菌，37℃培养过夜，12-16h之后出现菌
落；
2、挑取阳性单克隆，接种到含有抗⽣素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中剧烈振摇⾄菌
液OD600值在0.4-0.6之间时，加⼊IPTG 0.1mmol/L诱导，继续孵育3-4h，离⼼，收集菌体（可
以-70℃保存备⽤）；
3、加⼊2 ml细菌裂解液（含蛋⽩酶抑制剂），重新悬浮菌体，冰上振荡15 min；
4、12000 rpm离⼼10 min，取上清；
5、向上清中加⼊100 µl的含有⾕胱⽢肽的琼脂糖磁珠（⽤之前需⽤washing buffer洗涤3
次），4℃旋转混合⾄少30min，再⽤washing buffer洗3次；
6、从培养的细胞中提取全蛋⽩，取蛋⽩200µg，与上述琼脂糖磁珠混合，⽤washing buffer 补
⾜300 µl，4℃旋转孵育⾄少1 h，⽤于沉淀细胞中的⽬的蛋⽩，（注：此步反应的温度和孵育时
间均需根据不同的的蛋⽩进⾏优化，孵育的最后阶段进⾏略微的涡旋震荡能够去掉⾮特异性结
合的蛋⽩，降低背景）；
7、⼩⼼移去上清，⽤400 µl washing buffer 洗3-5次，第⼀次可室温孵育5 min，并在孵育过程
中偶尔进⾏混匀；
8、向琼脂糖磁珠中加⼊30 µl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，沸⽔浴5 min，直接加样进⾏SDS-
PAGE蛋⽩电泳；
9、以下实验操作同westernblotting（见前天实验流程）。
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实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。
用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离.
试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160）
实验操作程序：
材料及试剂
探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物
细胞蛋白裂解液，洗脱液：
PBS及PBS+1%Triton-100
PBS (1L)
NaCl：8g
KCl：0.2g
Na2HPO4： 1.44g
KH2PO4：0.24g
加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！
PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃
（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）
1：原核融合蛋白A的获得
1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株
1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜
1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整）.6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N
1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀
1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。
至裂解液充分清凉
1.6：11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清，-80℃保存备用
2：真核融合蛋白B的获得
2.1：将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上，进行细胞转染xq
3：48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融
4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。
5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。
留取20ul（PBS+Beads）作Offer。
6：同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分钟。
7：吹打收集至1.5mlEP管，超声破碎。
13000rpm，15分钟，4℃离心取上清。
8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！4℃旋转结合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。
10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，Run –SDS PAGE 做Western Blot检测。
用HA或者myc Blot。
注意GST-pull down的对照问题。
（以A-GST和B-6*His为例）
1. 跑SDS-PAGE时点一个input的蛋白（即B-6*His）用于做阳性对照看一下western操作过程中，试剂，操作步骤有没有问题。
2. 谷胱甘肽琼脂珠上只固定GST蛋白，input B-6*His，用于做阴性对照看一下是否GST 会与input的蛋白相互作用。