实验二 孚尔根核染色
染色体变异与孚尔根反应
【操作过程】
• 染色：
• 取四只指形管，分别标上1）、2 ）、3）、 4），并且在1）和3）中加入适量1N盐酸，2） 和4）中加入蒸馏水放入60°C的水浴锅中预热， • 将上述4支试管中的根尖对应放入1）2）3）4） 中水解10min。完成后立即将盐酸、蒸馏水吸 干。 • 四支试管中均滴加席夫试剂，浸没根尖染色 20min。然后用蒸馏水清洗四次，每次2min。
【实验原理】
• 利用1N HCl 、60℃下水解时，可将DNA分 子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打 断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖释放醛基 与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有 DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此 利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。
【实验器材】
• （1）洋葱（2n=16）、大蒜根尖（2n=16） • （2）水浴锅、试管若干、指形管、镊子、 显微镜、烧杯等 • （3）卡诺氏固定液、1N盐酸、蒸馏水、席 夫试剂、45%醋酸
【பைடு நூலகம்论与建议】
1，培养根尖：因为是在常温下培养，将 近一周时间才长1—2cm，可以放在温 箱中培养。 2，水解：因为第2,、4组是用蒸馏水， 所以根尖细胞并没有松散开，后来压 片的时候根尖不容易被压成薄层细胞。 可以用能分散细胞但不使核酸释放出 醛基的溶液代替蒸馏水，如纤维素酶。
【讨论与建议】
3，镜检：染色不太明显，细胞有重叠。 可能染色时间可以长一点。 4.，本实验比较简单，及验证孚尔根染 色。为了更好得理解孚尔根，可以设 计更复杂一点的实验。
【操作过程】
• 培养根尖：
• 洋葱鳞茎和大蒜在常温下培养发根。一周后，根 长到1—2cm。
【操作过程】
• 取材并固定：
• 剪下根尖，将洋葱和大蒜根尖各分为两组 放入四支试管中，每支试管中约6个根尖， 对应洋葱1，洋葱2，大蒜1，大蒜2标上1、 2、3、4。同时加入卡诺氏固定液密封，在 低温下固定24小时后蒸馏水洗净。
实验二孚尔根核染色
孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek 于1924年提出的鉴定细胞中DNA的组织 化学方法。其优点是制片清洁、染色体 清晰、组织软化好，易于压片。但对小 型染色体（如玉米、水稻）效果较差。
实验方法
水洗：把已经固定好的洋葱根尖用50％乙醇和清 水分别冲洗, 再把它放入室温的1mol/L HCl中处 理2-3min。
将根尖换入60℃预热的HCl，置于恒温水浴中， 在600.5℃的条件下水解10min。
吸出热HCl，换入室温1mol/L HCl再处理2min， 然后水洗2-3次。
吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，黑暗条 件下染色30min或过夜。
为什么RNA在此过程中不会着色？
由于在酸解条件下，RNA较DNA分子 更加稳定，它的醛基难以游离，所以 在用Schiff试剂染色时RNA分子不会 着色。
小心倒出Schiff试剂,然后用漂洗液洗3次。
漂洗液配置方法：取10ml10 %亚硫酸氢钠母液， 加200ml蒸馏水，再加10ml1NHCL，即成漂 洗液，使用前配置。
蒸馏水漂洗后取根尖置于载玻片上，只保留 分生区，再加一滴45%的醋酸，压片镜检。
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根尖形态与结构
温度过高，时间过长：则DNA过度水 解，游离的核苷酸会漂移细胞质中， 造成染色浅或不均一 。
为什么要在实验材料从60℃盐酸中倒 出后，再放入室温的盐酸中呢？
材料从60℃的盐酸倒出后温度还相当高，如 果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发 生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入 室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff 试 剂分解。
植物染色体的孚尔根染色法
四、实验步骤
1. 希夫试剂的配制
• 将0.5g碱性品红徐徐加入煮沸的 碱性品红徐徐加入煮沸的100ml蒸馏水中 用玻璃棒搅拌 蒸馏水中, 碱性品红徐徐加入煮沸的 蒸馏水中 用玻璃棒搅拌, 使之充分溶解, 待溶液冷却至58°C左右 过滤于棕色瓶中。 使之充分溶解 待溶液冷却至 ° 左右, 过滤于棕色瓶中。 左右 • 当滤液冷却至 °C时, 再加入 当滤液冷却至26° 时 再加入10ml的1M盐酸和 盐酸和0.5g亚硫酸氢钠 的 盐酸和 亚硫酸氢钠 或偏重亚硫酸钠(钾 摇动, 溶解后密封于棕色瓶中, 或偏重亚硫酸钠 钾), 摇动 溶解后密封于棕色瓶中 置于黑暗 低温处。次日检查溶液颜色, 须呈无色透明或淡茶色才可使用。 低温处。次日检查溶液颜色 须呈无色透明或淡茶色才可使用。 • 若稍呈红色可加入 若稍呈红色可加入0.5g活性炭连续摇动 在4°C下静置过夜 然 活性炭连续摇动, 下静置过夜, 活性炭连续摇动 ° 下静置过夜 后过滤脱色。 后过滤脱色。
2. 染色过程
① 取固定好的根尖, 用水洗2-3分钟, 放入室温条件下的1N HCl处理根尖 材料2-3分钟。 ② 将根尖换入60℃预热的HCl, 置于恒温水浴中, 在60±0.5℃的条件下水 解8-10分钟。 ③ 吸出热HCl, 换入室温1N HCl再处理1-2分钟, 然后水洗2-3次。 ④ 吸净水分, 加入Schiff试剂, 盖上盖子, 在黑暗条件下染色30分钟, 也可 过夜。 ⑤ 用水漂洗, 去掉细胞中残存的一些有色的品红分子。 ⑥ 取根尖置载玻片上, 用镊子夹碎后, 加一滴45%醋酸, 然后盖上盖片。 ⑦ 压片、观察。
玉米染色体核型图(2n=20), Feulgen 染色
玉米染色体核型图(2n=20+2B)
玉米染色体核型图(2n=20+4B) /mnl/79/18rosado.htm
孚尔根染色
孚尔根染色法中Schiff试剂配方的研究一、实验目的1、进一步深入了解孚尔根染色的基本原理2、探究尝试用非传统的方法配置Schiff试剂并观察其染色效果二、实验原理DNA是遗传的物质基础，应用Feulgen反应法显示细胞DNA是常用的组化染色技术，其中Sehitt试剂是染色成败的关键因素。
Sehiit试剂(希夫试剂)，又称品红醛试剂，与醛类反应呈紫红色。
它有多种不同的配制方法，归结起来有经典热配法以及冷配法。
实验室经常采用的热配法，配制过程繁琐，常会因一个步骤的偏差而造成配制失败，实验中尝试改用冷配法，可收到与热配法同样的染色效果。
Schiff试剂的主要成分是碱性品红，属三氨基三苯甲烷类，它由副品红、品红、二号碱性品红组成四。
碱性品红在酸性环境下与亚硫酸盐作用，生成无色品红。
其配制方法有2种：热配法(将碱性品红加热煮沸)是通过热效应来加速分子运动，使染料溶解与脱色；冷配法(室温下采用振荡或搅拌的方法)是通过增加分子间的碰撞，促进染料溶解与脱色。
2种方法的反应机制相同。
三、实验器材实验材料：蚕豆根尖实验器具：显微镜、载玻片、盖玻片、电炉、滤纸、烧杯、纱布、量筒、锥形瓶、标签、刀片、容量瓶实验药品：蒸馏水、卡诺氏液、0.1mol/L的盐酸、碱性品红、盐酸、偏重亚硫酸钠、活性炭。
四、实验方法1.浸种催芽选择无虫、饱满、大小均匀的蚕豆种子50粒放入蒸馏水的烧杯中， 25℃浸泡24h,其中换水1次。
种子吸胀后，在培养皿中铺一层脱脂棉，倒入足量的蒸馏水，将种子置于其中25 ℃培养2至3天，期间随时补充水分，大部分初生根长至1～2cm左右。
2.不同试剂配置1. 热配法（常规法）称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角瓶），时时振荡，继续煮5min（勿使之沸腾），充分溶解。
然后冷却致50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/L HCl，冷却致25℃时，加入0.5g偏重硫酸钠，充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h（有时需要2至3天），使其颜色退至淡黄，然后加入0.5g 活性碳，用力振荡一分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封瓶塞，外包黑纸。
实验二孚尔根染色法
实验二孚尔根染色法一、实验原理染色体是遗传物质的载体，它的主要化学成分是脱氧核糖核酸(DNA)，DNA系核苷酸的多聚体，核苷酸又由碱基脱氧核糖和磷酸所组成，当细胞经60℃、1mol·1-1HCl处理后，不仅使分生组织的细胞彼此分离，而且可以破坏核内DNA链上的嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键，嘌呤脱下，脱氧核糖上的醛基暴露，形成含醛基的无嘌呤结构物，醛基与希夫试剂反应显紫红色。
细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此所以根据紫红色出现的部位就可鉴定脱氧核糖核酸(DNA)的存在，并广泛应用于核及染色体的研究中。
二、实验目的学习和掌握孚尔根反应染色法，鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。
三、实验材料、用具及药品1．材料：洋葱或大蒜的根尖2．用具显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、吸管、烧杯、量筒、3．药品希夫氏试剂(无色碱性品红液)、漂洗液、1mol·1-1 HCl、45％醋酸等。
四、实验步骤1. 取材与固定：待大蒜根尖长1cm 时，于上午8时剪下根尖，经过预处理后投入卡诺固定液中固定2-24h。
固定后，保存在70%的酒精中，放入冰箱中冷藏供用。
2.水解试管1：取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，换1N HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1N HCl 浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟（视材料而定，水解时间可以从10分钟延长至30分钟）。
然后吸去热1N HCl，换入冷1N HCl洗一次，再用清水将根尖洗三次。
试管2（对照）取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，入预热60℃的蒸馏水浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟。
以下各步骤两试管相同。
（水解是本实验成败的关键之一。
重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。
如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。
实验02 孚尔根核反应染色法
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有丝分裂各时期
中期 ——极面
后期
末期
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子细胞
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有丝分裂各时期
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20
六、注意事项
1. 水解时间和温度是实验的关键因素；
2. Schiff试剂中SO2的含量影响孚尔根反应的 颜色表现；
3. 压片技术是视野观察清晰与否的关键；
4. 材料的不同（DNA含量的不同），是影响 显色反应强度的根本因素；
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五、实验步骤
材料
培养的植物根尖长到2cm左右时，切下；或取幼小 花药或叶表皮或愈伤组织，或动物组织，或果蝇唾 腺等材料。
固定
将取出的材料放入新配制的Carrnoy固定液（无水 乙醇:冰醋酸=3:1）处理2~24hr→95%乙醇洗2次， 每次10min→80%乙醇洗1次，10min→70%乙醇， 冰箱保存。
染色30min~4h； 漂洗液漂洗2~3次，每次2~5min，待用。
五、实验步骤
以下各人独立完成： 将根尖置载玻片上，切取适当部位； 加45%醋酸洋红1滴； 压片； 镜检； 作图（实验报告）。
有丝分裂各时期
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有丝分裂各时期
间期
前期
中期 ——侧面
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实验二 孚尔根核反应染色法
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1
一、实验目的
1. 学习和了解孚尔根（Feulgen）反应的原理； 2. 掌握对植物组织及细胞中鉴别DNA分布的 孚尔根反应染色方法； 3. 掌握压片方法； 4. 了解制作玻片标本的方法； 5. 观察细胞中DNA的分布。
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Schiff试剂中的无色亚硫酸品红分子与活性醛 基反应而呈现为紫红色化合物。该产物能特异 地吸收峰值为550~570nm的光波。并在一定的 浓度范围内，在550~570nm光波的吸收值与 DNA含量成正比，即符合化学计量学关系。
实验二、DNA的原位显示—Feulgen染色法『目的要求』1、
『思考题』
欲得到一张好的Feulgen反应制片，制片过程 中应注意些什么？
• 水解是本实验成败关键之一。水解时间和温度
一定要合适，如果温度过高或时间过长，造成 水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流 失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基， 都不能呈现颜色反应。
• 用Schiff试剂染色前，蒸馏水的残留不宜过多
，否则会使染色剂浓度降低。
• 漂洗时，所用的亚硫酸水，最好在每次实验前
临时配制，以便保持较浓的SO2。
• 加盖玻片时，切勿用力过大。
『其他固定液』
Flemming固定液：1%铬酸水溶液 25ml，1%冰醋酸 （用前加入）10ml，蒸馏水 60ml
Champy固定液：3%重铬酸钾 70ml，1%铬酸 70ml，2% 锇酸 40ml
实验二、DNA的原位显示—Feulgen染色法
『目的要求』 1、掌握Feulgen反应的基本原理 2、掌握Feulgen反应操作全过程。 3、熟悉细胞化学技术
『实验用品』 光学显微镜、恒温水浴锅、染色缸、小烧杯、滴 管、载玻片、Schiff试剂、1M的HCL溶液、3%的 亚硫酸氢钠溶液，4.5%的醋酸、Carnoy液固定的gen反应的一般步骤： 1、材料准备：取一洋葱鳞茎，置于盛满水的小烧
杯上使其长出新根。待根尖长2cm左右时，于上 午9时剪下根尖用Carnoy固定液固定、保存。 （固定的目的是防止细胞死后变化，保持胞内固 有结构与状态） 2、水解：从冰箱取出预先准备好的洋葱根尖，用 清水洗3次，每次2min，换1M HCl洗一次，倾去 ，换入预热60℃的1M HCl，放入恒温水浴锅中在 60±0.5℃下水解8-15min（视材料而定）。 3、吸去热1M HCl，换入冷1M HCl洗一次，用蒸馏 水漂洗3次，每次2min。
《孚尔根核染色》课件
染色过程
孚尔根核染色包括几个关键步骤：细 胞固定、细胞通透性处理、DNA氧化 、染色和观察。
染色过程需要在弱酸条件下进行，以 促进DNA的氧化和后续的染色反应。
在染色过程中，需要使用特定的染料 ，如Giemsa染料或巴尔巴土染料，这 些染料能够与DNA-蛋白质加合物结 合，产生明显的染色效果。
染色效果
政策支持
政府可以出台相关政策， 支持孚尔根核染色技术的 研发和应用，促进其发展 壮大。
感谢您的观看
THANKS
该技术可用于DNA多态性分析 ，有助于研究基因变异与疾病 的关系。
技术局限性
1 样本量要求
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
2 交叉污染风险
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
3 假阳性结果
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
减少人工操作误差。
降低成本
通过优化试剂和设备， 降低检测成本，使更多 实验室和医疗机构能够
应用该技术。
05
孚尔根核染色技术的未来发展
技术发展趋势
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的发展，孚尔根 核染色技术将逐渐实现自动化和智能化，提 高染色效率和准确性。
环保与可持续发展
随着环保意识的提高，未来的孚尔根核染色 技术将更加注重环保和可持续发展，减少对 环境的污染和资源消耗。
《孚尔根核染色》PPT课件
目录
• 引言 • 孚尔根核染色技术原理 • 孚尔根核染色技术的应用 • 孚尔根核染色技术的优缺点 • 孚尔根核染色技术的未来发展
01
引言
核染色技术简介
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不够彻底，醛基暴露不充分，染色会 过浅。 温度过高，时间过长：则DNA过度水 解，游离的核苷酸会漂移到细胞质中， 造成染色浅或不均一 。
为什么要在实验材料从60℃盐酸中倒 出后，再放入室温的盐酸中呢？
材料从60℃的盐酸倒出后温度还相当高，如 果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发 生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入 室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff 试
快完全除掉，脱氧核糖中潜在的的醛基获得自由状态，
水解条件下形成半缩醛羟基，与Schiff试剂反应，形成
紫红色化合物。
孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek 于1924年提出的鉴定细胞中DNA的组织 化学方法。其优点是制片清洁、染色体 清晰、组织软化好，易于压片。但对小
型染色体（如玉米、水稻）效果较差。
医学遗传学实验
实验2 洋葱根尖孚尔根染色法
实验目的 实验原理
实验方法
注意事项
பைடு நூலகம்
实验作业
思考问题
实验目的
掌握孚尔根核染色的方法。
了解孚尔根染色的原理。
实验原理
Na2S2O3+ HCl→→亚硫酸根
亚硫酸根+碱性品红→无色的亚硫酸品红—Schiff试剂
DNA在60℃，1mol/L HCl作用下，核酸中的嘌呤碱很
件下染色30min或过夜。
小心倒出Schiff试剂,然后用漂洗液洗3次。
漂洗液配置方法：取10ml10 %亚硫酸氢钠母液， 加200ml蒸馏水，再加10ml1NHCL，即成漂 洗液，使用前配置。
蒸馏水漂洗后取根尖置于载玻片上，只保留
分生区，再加一滴45%的醋酸，压片镜检。
根尖形态与结构
成熟区
实验方法
水洗：把已经固定好的洋葱根尖用50％乙醇和清
水分别冲洗, 再把它放入室温的1mol/L HCl中处
理2-3min。
将根尖换入60℃预热的HCl，置于恒温水浴中，
在600.5℃的条件下水解10min。
吸出热HCl，换入室温1mol/L HCl再处理2min，
然后水洗2-3次。
吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，黑暗条
HE XI UNIVERSITY
伸长区
分生区
根冠
注意事项
Schiff试剂小心取放，及时清洗吸取
Schiff试剂的吸管。
黑暗条件下染色。
实验作业
绘制你所观察到的图象，并说明是有丝
分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。
前期、中期、后期、末期
为什么要严格掌握DNA的水解条件？
温度过低，时间过短：则DNA的水解
剂分解。
为什么RNA在此过程中不会着色？
由于在酸解条件下，RNA较DNA分子
更加稳定，它的醛基难以游离，所以 在用Schiff试剂染色时RNA分子不会 着色。