实验02 孚尔根核反应染色法
染色体变异与孚尔根反应
【操作过程】
• 染色：
• 取四只指形管，分别标上1）、2 ）、3）、 4），并且在1）和3）中加入适量1N盐酸，2） 和4）中加入蒸馏水放入60°C的水浴锅中预热， • 将上述4支试管中的根尖对应放入1）2）3）4） 中水解10min。完成后立即将盐酸、蒸馏水吸 干。 • 四支试管中均滴加席夫试剂，浸没根尖染色 20min。然后用蒸馏水清洗四次，每次2min。
【实验原理】
• 利用1N HCl 、60℃下水解时，可将DNA分 子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打 断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖释放醛基 与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有 DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此 利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。
【实验器材】
• （1）洋葱（2n=16）、大蒜根尖（2n=16） • （2）水浴锅、试管若干、指形管、镊子、 显微镜、烧杯等 • （3）卡诺氏固定液、1N盐酸、蒸馏水、席 夫试剂、45%醋酸
【பைடு நூலகம்论与建议】
1，培养根尖：因为是在常温下培养，将 近一周时间才长1—2cm，可以放在温 箱中培养。 2，水解：因为第2,、4组是用蒸馏水， 所以根尖细胞并没有松散开，后来压 片的时候根尖不容易被压成薄层细胞。 可以用能分散细胞但不使核酸释放出 醛基的溶液代替蒸馏水，如纤维素酶。
【讨论与建议】
3，镜检：染色不太明显，细胞有重叠。 可能染色时间可以长一点。 4.，本实验比较简单，及验证孚尔根染 色。为了更好得理解孚尔根，可以设 计更复杂一点的实验。
【操作过程】
• 培养根尖：
• 洋葱鳞茎和大蒜在常温下培养发根。一周后，根 长到1—2cm。
【操作过程】
• 取材并固定：
• 剪下根尖，将洋葱和大蒜根尖各分为两组 放入四支试管中，每支试管中约6个根尖， 对应洋葱1，洋葱2，大蒜1，大蒜2标上1、 2、3、4。同时加入卡诺氏固定液密封，在 低温下固定24小时后蒸馏水洗净。
果蝇唾腺染色体的几种染色方法比较
果蝇唾腺染色体的几种染色方法比较双翅类昆虫如黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的唾腺染色体（Salivary chromosome）比普通染色体大的多，处于体细胞同源染色体的配对状态，是由于唾腺染色体经过多次复制而并不分开形成的，大约有1000～4000根染色体丝的拷贝，故又称为多线染色体（Poly－tene chromosome）。
它是观察染色体形态、研究染色体结构变异等的好材料。
制作果蝇唾腺染色体标本的染色方法一般有3种：醋酸洋红法、苯酚品红法和孚尔根（Feuglen）染色法（除此之外还有其他方法）、各种方法都有其自身的特点及适用的条件，因此没有1种染色方法是普遍适用完美无缺的。
现将3种常用方法的优缺点分述如下，并提出1个实用的永久封片制作方法。
一、醋酸洋红法洋红的常用浓度为0.5%～1.0%，醋酸常用浓度为45%～50%，一般现配挪用较好。
洋红是从胭脂虫（Coccrs cacti）的雌虫中提取的作为染料的提取物,提取物的品质因胭脂虫的种类而异，是一种混合物，其中具有染色活性的是洋红酸。
洋红酸是一种二元弱酸，如果溶于碱性溶液中，则具有酸性染料的性质，可使细胞质着色；如果溶于酸性溶液中，则具有磁性染料的性质，可使染色质（体）着色。
此法多用满架法，快速简便，为改进其染色效果，也可采用浸染法，并辅以火焰微热（即滴加醋酸洋红盖片后在酒精灯火焰上微热），增加本底清晰度，加大反差。
醋酸洋红的配制和染色都比较简中，对细胞穿透力较强，这是其主要优点，此外它对染色体和核仁均对染色，故也适用于减数分裂的细胞染色。
但其染色强度和分色效果不及其他染色剂，通常只作临时染色观察，不用于制作永久性装片。
也可以用醋酸地衣红替代洋红，这样细胞质着色较少，效果较好。
二、孚尔根染色法孚尔根染色法是常用于鉴别细胞中DNA的一种组织化学方法，细胞核经过温和的盐酸的水解作用（I mol HCI，60℃而破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键，这样嘌呤碱脱掉而使脱氧核糖的第1个碳原子上潜在的醛基获得自由状态。
九孚尔根Feulgen核反应染色法
实验设计
5分钟 50度 60度 70度
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
10分钟
15分钟
以+,++,+++……表示染色效果强弱,+号最多表示染色最佳.
水解时DNA中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打 断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基 与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有 这种专一反应，因此可鉴定DNA的存在。
三 、实验方法和步骤
（一）材料准备 取一洋葱鳞茎，置于盛满水的小烧杯
上使其长出新根。待根尖长2cm 时，于上 午8时剪下根尖进行预处理、固定、保存 （请参考实验一）。
（二）水解
取准备好的洋葱根尖，装到青霉素瓶中，水洗三 次，换1M HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1M HCl，覆盖样品即可，放入恒温水浴锅中在60℃下 水解10分钟，然后吸去热1M HCl，换入冷1M HCl洗 一次，再水洗三次。
水解是本实验成败的关键。重要的是温度和时间。 如果温度过高或时间过长，造成水解过度，核糖与 醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，不能 呈现颜色反应。
（三）染色
加入适量的Schiff试剂，避光染色30分 钟，然后用漂洗液漂洗2～3次，水洗后压片。 （四）压片、镜检
取一根尖置于载玻片，切下0.3cm生长 区部位，加一滴亮绿液对染一分钟，吸去亮 绿液，加一滴清水或醋酸水溶液压片，镜检， 观察有丝分裂各个时期的染色体。
以小组为单位，探究温度高低与酸水解 时间长短对孚尔根核反应的影响。
实验九 孚尔根（Feulgen）核反应染色法
一、实验目的 1、学习孚尔根核反应染色法，鉴
定染色体、DNA的存在。 2、探究水解时间及温度对孚尔根
实验二孚尔根核染色
孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek 于1924年提出的鉴定细胞中DNA的组织 化学方法。其优点是制片清洁、染色体 清晰、组织软化好，易于压片。但对小 型染色体（如玉米、水稻）效果较差。
实验方法
水洗：把已经固定好的洋葱根尖用50％乙醇和清 水分别冲洗, 再把它放入室温的1mol/L HCl中处 理2-3min。
将根尖换入60℃预热的HCl，置于恒温水浴中， 在600.5℃的条件下水解10min。
吸出热HCl，换入室温1mol/L HCl再处理2min， 然后水洗2-3次。
吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，黑暗条 件下染色30min或过夜。
为什么RNA在此过程中不会着色？
由于在酸解条件下，RNA较DNA分子 更加稳定，它的醛基难以游离，所以 在用Schiff试剂染色时RNA分子不会 着色。
小心倒出Schiff试剂,然后用漂洗液洗3次。
漂洗液配置方法：取10ml10 %亚硫酸氢钠母液， 加200ml蒸馏水，再加10ml1NHCL，即成漂 洗液，使用前配置。
蒸馏水漂洗后取根尖置于载玻片上，只保留 分生区，再加一滴45%的醋酸，压片镜检。
HE XI UNIVERSITY
根尖形态与结构
温度过高，时间过长：则DNA过度水 解，游离的核苷酸会漂移细胞质中， 造成染色浅或不均一 。
为什么要在实验材料从60℃盐酸中倒 出后，再放入室温的盐酸中呢？
材料从60℃的盐酸倒出后温度还相当高，如 果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发 生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入 室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff 试 剂分解。
实验二孚尔根染色法
实验二孚尔根染色法一、实验原理染色体是遗传物质的载体，它的主要化学成分是脱氧核糖核酸(DNA)，DNA系核苷酸的多聚体，核苷酸又由碱基脱氧核糖和磷酸所组成，当细胞经60℃、1mol·1-1HCl处理后，不仅使分生组织的细胞彼此分离，而且可以破坏核内DNA链上的嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键，嘌呤脱下，脱氧核糖上的醛基暴露，形成含醛基的无嘌呤结构物，醛基与希夫试剂反应显紫红色。
细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此所以根据紫红色出现的部位就可鉴定脱氧核糖核酸(DNA)的存在，并广泛应用于核及染色体的研究中。
二、实验目的学习和掌握孚尔根反应染色法，鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。
三、实验材料、用具及药品1．材料：洋葱或大蒜的根尖2．用具显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、吸管、烧杯、量筒、3．药品希夫氏试剂(无色碱性品红液)、漂洗液、1mol·1-1 HCl、45％醋酸等。
四、实验步骤1. 取材与固定：待大蒜根尖长1cm 时，于上午8时剪下根尖，经过预处理后投入卡诺固定液中固定2-24h。
固定后，保存在70%的酒精中，放入冰箱中冷藏供用。
2.水解试管1：取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，换1N HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1N HCl 浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟（视材料而定，水解时间可以从10分钟延长至30分钟）。
然后吸去热1N HCl，换入冷1N HCl洗一次，再用清水将根尖洗三次。
试管2（对照）取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，入预热60℃的蒸馏水浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟。
以下各步骤两试管相同。
（水解是本实验成败的关键之一。
重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。
如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。
植物染色体的孚尔根染色法
染色过程
取固定好的根尖, 用水洗2-3分钟, 放入室温条件下的1N HCl处理根尖材料2-3分钟。
添加标题
将根尖换入60℃预热的HCl, 置于恒温水浴中, 在600.5℃的条件下水解8-10分钟。
添加标题
吸出热HCl, 换入室温1N HCl再处理1-2分钟, 然后水洗2-3次。
添加标题
吸净水分, 加入Schiff试剂, 盖上盖子, 在黑暗条件下染色30分钟, 也可过夜。
希夫试剂的配制
当滤液冷却至26C时, 再加入10ml的1M盐酸和0.5g亚硫酸氢钠或偏重亚硫酸钠(钾), 摇动, 溶解后密封于棕色瓶中, 置于黑暗低温处。次日检查溶液颜色, 须呈无色透明或淡茶色才可使用。
若稍呈红色可加入0.5g活性炭连续摇动, 在4C下静置过夜, 然后过滤脱色。
将0.5g碱性品红徐徐加入煮沸的100ml蒸馏水中, 用玻璃棒搅拌, 使之充分溶解, 待溶液冷却至58C左右, 过滤于棕色瓶中。
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二、实验目的
在熟悉火焰干燥法制片的基础上, 掌握弗尔根染色法, 并观察有丝分裂的各个时期
三、材料、方法、器具、药品
小麦根尖 希夫试剂， 45%醋酸， Carnoy’s固定液 碱性品红、偏重亚硫酸钠、活性炭、1M盐酸 镊子 载玻片 盖玻片 显微镜 青霉素瓶子 恒温水浴锅
四、实验步骤
PART 1
实验四 植物染色体的孚尔根染色法
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一、实验原理
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01
孚尔根（Feulgen）染色法是鉴别细胞核中DNA的组织化学方法, 其原和盐酸作用而生成的, 为无色透明的溶液, 它遇醛类物质即呈紫红色, 故可用于鉴定醛基的存在。
细胞生物学实验孚尔根反应
中国海洋大学实验报告一、【实验目的】1、熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法。
2、对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识。
3、对组织切片进行染色，并观察组织中的细胞核。
二、【实验原理】Feulgen反应（Feulgen reaction）是显示DNA的最典型的组织化学反应，是学者Feulgen和Rossenbeck在1924年首次发明出来的，简称为Feulgen法。
因对DNA的显示反应具有高度专一性，因此常常被用来显示细胞内DNA的分布情况。
自Feulgen等发明出显示DNA的Feulgen反应方法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已基本取得共识。
其具体反应原理是：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。
Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。
也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。
其反应机制如下图所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3三、【实验用品】1、材料：香柏油5瓶，擦镜纸5本，镊子5把，盖玻片20片，用carnoy's固定液固定的肝脏和精巢切片20片。
2、试剂：（1）schiff氏试剂将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。
在使用前加入0.5g活性碳, 摇1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。
（2）亚硫酸水(洗涤剂) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。
细胞生物学实验（吉林大学）孚尔根反应
1．观察细胞内糖类的分布2．掌握糖类的染色方法及过碘酸雪夫反应原理二．实验原理：组织内的多糖、粘多糖及粘蛋白等都用PAS法来显示。
其化学基础是利用过碘酸的氧化作用。
过碘酸是一种强氧化剂，能破坏各种结构内的C-C键，若有1，2乙二醇基（CHOH-CHOH）存在，可变为二醛（CHO-CHO），然后与Schiff试剂反应，与Schiff 试剂生成紫红色反应物。
过碘酸较常用的氧化C-C键的试剂（KmnO4、H2CRO4、H2O2等）灵敏而优越，不再氧化所产生的醛基，与Schiff试剂生成紫色反应物以此得到定位。
三．实验仪器及药品：1.实验器材：显微镜，染色缸，盖玻片。
2实验药品：1%过碘酸，Schiff试剂，0.5%偏重亚硫酸钠溶液，纯酒精，95％酒精，二甲苯。
Schiff试剂的配制：蒸馏水100ml煮沸后取下，立即放入碱性品红使之溶。
冷却至50摄氏度时用滤纸过滤。
加偏重亚硫酸纳（或钾）（或亚硫酸氢盐）及1mol/L HCl 20ml。
避光放置18～24小时（室温）。
溶液变为草黄色。
然后加入300mg活性炭，用力摇动1分钟，过滤。
过滤后即得无色品红。
此液配就后，封严瓶塞，外包黑纸，贮于4摄氏度冰箱备用，用前升至室温。
3.实验材料：兔或鼠的肝、肾、心肌、骨胳肌、马铃薯。
四．实验步骤：1.石蜡切片到复水的步骤如石蜡切片的步骤。
2．0.5%~1%过碘酸水溶液浸泡约4min（不能过长）。
3．倒去过碘酸，注意组织别随之一起倒掉，加蒸馏水洗约1min。
4．Schiff试剂浸泡15min。
注意避光处理，将其放在抽屉里，且Schiff试剂别沾到其他地方。
5．15min后，从抽屉中拿出载玻片，用亚硫酸盐溶液浸泡三次，共6min6．将载玻片放在自来水冲洗5min。
并用胶头滴管挡住组织切片。
7．蒸馏水浸泡1min。
8．倒掉蒸馏水，滴加苏木精复染胞核约7min。
9．流水洗5min。
滴加一滴蒸馏水，盖上盖玻片，吸干玻片外的蒸馏水，放在显微镜下进行镜检。
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有丝分裂各时期
中期 ——极面
后期
末期
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子细胞
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有丝分裂各时期
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六、注意事项
1. 水解时间和温度是实验的关键因素；
2. Schiff试剂中SO2的含量影响孚尔根反应的 颜色表现；
3. 压片技术是视野观察清晰与否的关键；
4. 材料的不同（DNA含量的不同），是影响 显色反应强度的根本因素；
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五、实验步骤
材料
培养的植物根尖长到2cm左右时，切下；或取幼小 花药或叶表皮或愈伤组织，或动物组织，或果蝇唾 腺等材料。
固定
将取出的材料放入新配制的Carrnoy固定液（无水 乙醇:冰醋酸=3:1）处理2~24hr→95%乙醇洗2次， 每次10min→80%乙醇洗1次，10min→70%乙醇， 冰箱保存。
染色30min~4h； 漂洗液漂洗2~3次，每次2~5min，待用。
五、实验步骤
以下各人独立完成： 将根尖置载玻片上，切取适当部位； 加45%醋酸洋红1滴； 压片； 镜检； 作图（实验报告）。
有丝分裂各时期
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有丝分裂各时期
间期
前期
中期 ——侧面
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实验二 孚尔根核反应染色法
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一、实验目的
1. 学习和了解孚尔根（Feulgen）反应的原理； 2. 掌握对植物组织及细胞中鉴别DNA分布的 孚尔根反应染色方法； 3. 掌握压片方法； 4. 了解制作玻片标本的方法； 5. 观察细胞中DNA的分布。
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Schiff试剂中的无色亚硫酸品红分子与活性醛 基反应而呈现为紫红色化合物。该产物能特异 地吸收峰值为550~570nm的光波。并在一定的 浓度范围内，在550~570nm光波的吸收值与 DNA含量成正比，即符合化学计量学关系。
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四、原理
此法既可定位用于细胞或组织化学染色反应， 观察DNA的分布，又可用显微分光光度计和图 像分析仪对细胞或组织中DNA的含量进行定量 分析。紫红色的产生，是由于反应产物的分子 内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜 色。对照组或采取不经盐酸处理，或预先用热 三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA 而得到阴性反应。
Cells in the body reproduce by mitosis.
Mitosis produces cells with exact copies of the parental cell chromosomes and genes.
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二、实验材料
植物（大蒜）根尖（或其他材料），经预处理。
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三、仪器药品
显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、刀片、 载玻片、盖玻片、吸水纸 染液（醋酸洋红）、卡诺固定液、HCl、 剂、醋酸、乙醇、亮绿，等
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四、原理
有丝分裂又称间接分裂，特征是有丝分裂器的 产生。
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五、实验步骤
以下分组：每6~10人一组 以2~3个根尖/人为标准，取根尖置于1.5ml离心管中； 蒸馏水荡洗2~3次； 加1mol/L HCl（材料浸入），室温2~3min，倾弃； 加预热到60±0.5℃的1mol/L HCl，放入恒温水浴锅
中， 60±0.5℃水解5~15min，倾弃； 加1mol/L HCl（材料浸入），洗1~2min，倾弃； 蒸馏水荡洗2~3次，倾弃蒸馏水； 加Schiff试剂，盖紧离心管，黑暗、10 ℃左右条件下
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有丝分裂
G0期：休眠期
S
G1期：DNA合
G1
成前期 G2 S 期：DNA合
成期
G0
G2期: DNA合
成后期
M
M 期：有丝分 裂期
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Cell cycle checkpoints
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四、原理
孚尔根反应是鉴别细胞中DNA的组织化学方 法，细胞内的DNA在1mol/L HCl，60℃下水解， 部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱基之间的糖苷 键，嘌呤碱基脱掉，使脱氧核糖的第一个碳原 子上潜在的醛基获得自由状态；
5. 实验成功的玻片标本可制备为永久玻片标 本。
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为什么视野中大部分细胞没有进行有丝分裂？
细胞周期分为包括间期和分裂期，大部分细胞 处于间期，分裂期只占10%。比如蚕豆的细胞 周期为19.5 h，分裂期只有2h。
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秋水仙素的作用？
降低细胞质黏度，使染色体缩短分散。 抑制纺锤体形成，让更多细胞处于分裂中期。
有丝分裂器是指有丝分裂时产生的，由微管及 其结合蛋白所组成的星体和纺锤体。星体是指 围绕中心体向外辐射状放射的微管。纺锤体是 由大量微管在赤道面垂直排列所形成的中部宽 阔、两极缩小的细胞器，形如纺锤。
有丝分裂是一个核改组的连续动态过程，包括 交替出现间期和分裂期，并可分为几个不同阶 段。
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Feulgen反应对DNA染色稳定、颜色鲜明、能 定量，因此在细胞化学和组织化学中成为一个 既古老、传统又经久不衰的DNA标记方法。
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有丝分裂
前期 中期 后期 末期 子细胞
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有丝分裂
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Cells reproduce by a cell cycle
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固定的作用？
固定好的材料用蒸馏水冲洗后，放入1 N HCl， 60℃解离8~10 min。 作用
使细胞间果胶质分解，细胞壁软化或分解，从而 使染色体容易分散压平，便于观察
解离时间
按材料和解离液成分定。时间短，细胞不易压散； 时间长，细胞容易压碎，影响染色。
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七、实验报告
绘制2张（或以上）实验观察到的不同时期 （或阶段）的有丝分裂图片。 要求：
为简化实验报告，不需要写目的、原理、材料、 方法等文字，只需图并注明时相，不需根据放大倍 数绘制，也不必注明放大倍数。
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