实验二孚尔根染色法
染色体变异与孚尔根反应
【操作过程】
• 染色：
• 取四只指形管，分别标上1）、2 ）、3）、 4），并且在1）和3）中加入适量1N盐酸，2） 和4）中加入蒸馏水放入60°C的水浴锅中预热， • 将上述4支试管中的根尖对应放入1）2）3）4） 中水解10min。完成后立即将盐酸、蒸馏水吸 干。 • 四支试管中均滴加席夫试剂，浸没根尖染色 20min。然后用蒸馏水清洗四次，每次2min。
【实验原理】
• 利用1N HCl 、60℃下水解时，可将DNA分 子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打 断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖释放醛基 与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有 DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此 利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。
【实验器材】
• （1）洋葱（2n=16）、大蒜根尖（2n=16） • （2）水浴锅、试管若干、指形管、镊子、 显微镜、烧杯等 • （3）卡诺氏固定液、1N盐酸、蒸馏水、席 夫试剂、45%醋酸
【பைடு நூலகம்论与建议】
1，培养根尖：因为是在常温下培养，将 近一周时间才长1—2cm，可以放在温 箱中培养。 2，水解：因为第2,、4组是用蒸馏水， 所以根尖细胞并没有松散开，后来压 片的时候根尖不容易被压成薄层细胞。 可以用能分散细胞但不使核酸释放出 醛基的溶液代替蒸馏水，如纤维素酶。
【讨论与建议】
3，镜检：染色不太明显，细胞有重叠。 可能染色时间可以长一点。 4.，本实验比较简单，及验证孚尔根染 色。为了更好得理解孚尔根，可以设 计更复杂一点的实验。
【操作过程】
• 培养根尖：
• 洋葱鳞茎和大蒜在常温下培养发根。一周后，根 长到1—2cm。
【操作过程】
• 取材并固定：
• 剪下根尖，将洋葱和大蒜根尖各分为两组 放入四支试管中，每支试管中约6个根尖， 对应洋葱1，洋葱2，大蒜1，大蒜2标上1、 2、3、4。同时加入卡诺氏固定液密封，在 低温下固定24小时后蒸馏水洗净。
2福林(Folin)-酚试剂法测定
摇匀，在室温下放置30分钟后在500nm下比色 OD500
附：7200型分光光度计的操作程序
连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。 接通电源，使仪器预热20分钟。 用<MODE>键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A）， 已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F） 方式。 用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。
将参比样品溶液和被测样 品溶液分别倒入比色皿中， 打开样品室盖，将盛有溶 液的比色皿分别插入比色 皿槽中，盖上样品室盖。 一般情况下，参比样品放 在第二个槽位中。
将0％T校具（黑体）置入 光路中，在T方式下按“0 ％T”键，此时显示器显示 “000.0”
按 MODE键选择A模式
将参比样品拉入光路中， 按“0A/100％T”键调 0A/100％T，此时显示器 显示的“BLA”直至显示 “0.000”A为止。
福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质 的浓度
一、原理
蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨
酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸 化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合 物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比， 可用比色法测定。
二、实验仪器 1.卵清蛋白片 2.7220分光光度计 3.试管 4.移液管 三、实验试剂 1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液 甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中 乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。 临用时按甲：乙=50：1混合使用。 2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷 酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上 磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴 数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至 1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的 氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至 相当于1mol/L的酸。 3.500ug/mL卵清蛋白液：称取0.5g卵清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并 稀释至 1000ml
实验二孚尔根核染色
孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek 于1924年提出的鉴定细胞中DNA的组织 化学方法。其优点是制片清洁、染色体 清晰、组织软化好，易于压片。但对小 型染色体（如玉米、水稻）效果较差。
实验方法
水洗：把已经固定好的洋葱根尖用50％乙醇和清 水分别冲洗, 再把它放入室温的1mol/L HCl中处 理2-3min。
将根尖换入60℃预热的HCl，置于恒温水浴中， 在600.5℃的条件下水解10min。
吸出热HCl，换入室温1mol/L HCl再处理2min， 然后水洗2-3次。
吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，黑暗条 件下染色30min或过夜。
为什么RNA在此过程中不会着色？
由于在酸解条件下，RNA较DNA分子 更加稳定，它的醛基难以游离，所以 在用Schiff试剂染色时RNA分子不会 着色。
小心倒出Schiff试剂,然后用漂洗液洗3次。
漂洗液配置方法：取10ml10 %亚硫酸氢钠母液， 加200ml蒸馏水，再加10ml1NHCL，即成漂 洗液，使用前配置。
蒸馏水漂洗后取根尖置于载玻片上，只保留 分生区，再加一滴45%的醋酸，压片镜检。
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根尖形态与结构
温度过高，时间过长：则DNA过度水 解，游离的核苷酸会漂移细胞质中， 造成染色浅或不均一 。
为什么要在实验材料从60℃盐酸中倒 出后，再放入室温的盐酸中呢？
材料从60℃的盐酸倒出后温度还相当高，如 果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发 生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入 室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff 试 剂分解。
植物染色体的孚尔根染色法
四、实验步骤
1. 希夫试剂的配制
• 将0.5g碱性品红徐徐加入煮沸的 碱性品红徐徐加入煮沸的100ml蒸馏水中 用玻璃棒搅拌 蒸馏水中, 碱性品红徐徐加入煮沸的 蒸馏水中 用玻璃棒搅拌, 使之充分溶解, 待溶液冷却至58°C左右 过滤于棕色瓶中。 使之充分溶解 待溶液冷却至 ° 左右, 过滤于棕色瓶中。 左右 • 当滤液冷却至 °C时, 再加入 当滤液冷却至26° 时 再加入10ml的1M盐酸和 盐酸和0.5g亚硫酸氢钠 的 盐酸和 亚硫酸氢钠 或偏重亚硫酸钠(钾 摇动, 溶解后密封于棕色瓶中, 或偏重亚硫酸钠 钾), 摇动 溶解后密封于棕色瓶中 置于黑暗 低温处。次日检查溶液颜色, 须呈无色透明或淡茶色才可使用。 低温处。次日检查溶液颜色 须呈无色透明或淡茶色才可使用。 • 若稍呈红色可加入 若稍呈红色可加入0.5g活性炭连续摇动 在4°C下静置过夜 然 活性炭连续摇动, 下静置过夜, 活性炭连续摇动 ° 下静置过夜 后过滤脱色。 后过滤脱色。
2. 染色过程
① 取固定好的根尖, 用水洗2-3分钟, 放入室温条件下的1N HCl处理根尖 材料2-3分钟。 ② 将根尖换入60℃预热的HCl, 置于恒温水浴中, 在60±0.5℃的条件下水 解8-10分钟。 ③ 吸出热HCl, 换入室温1N HCl再处理1-2分钟, 然后水洗2-3次。 ④ 吸净水分, 加入Schiff试剂, 盖上盖子, 在黑暗条件下染色30分钟, 也可 过夜。 ⑤ 用水漂洗, 去掉细胞中残存的一些有色的品红分子。 ⑥ 取根尖置载玻片上, 用镊子夹碎后, 加一滴45%醋酸, 然后盖上盖片。 ⑦ 压片、观察。
玉米染色体核型图(2n=20), Feulgen 染色
玉米染色体核型图(2n=20+2B)
玉米染色体核型图(2n=20+4B) /mnl/79/18rosado.htm
细胞生物学实验（吉林大学）孚尔根反应
1．观察细胞内糖类的分布2．掌握糖类的染色方法及过碘酸雪夫反应原理二．实验原理：组织内的多糖、粘多糖及粘蛋白等都用PAS法来显示。
其化学基础是利用过碘酸的氧化作用。
过碘酸是一种强氧化剂，能破坏各种结构内的C-C键，若有1，2乙二醇基（CHOH-CHOH）存在，可变为二醛（CHO-CHO），然后与Schiff试剂反应，与Schiff 试剂生成紫红色反应物。
过碘酸较常用的氧化C-C键的试剂（KmnO4、H2CRO4、H2O2等）灵敏而优越，不再氧化所产生的醛基，与Schiff试剂生成紫色反应物以此得到定位。
三．实验仪器及药品：1.实验器材：显微镜，染色缸，盖玻片。
2实验药品：1%过碘酸，Schiff试剂，0.5%偏重亚硫酸钠溶液，纯酒精，95％酒精，二甲苯。
Schiff试剂的配制：蒸馏水100ml煮沸后取下，立即放入碱性品红使之溶。
冷却至50摄氏度时用滤纸过滤。
加偏重亚硫酸纳（或钾）（或亚硫酸氢盐）及1mol/L HCl 20ml。
避光放置18～24小时（室温）。
溶液变为草黄色。
然后加入300mg活性炭，用力摇动1分钟，过滤。
过滤后即得无色品红。
此液配就后，封严瓶塞，外包黑纸，贮于4摄氏度冰箱备用，用前升至室温。
3.实验材料：兔或鼠的肝、肾、心肌、骨胳肌、马铃薯。
四．实验步骤：1.石蜡切片到复水的步骤如石蜡切片的步骤。
2．0.5%~1%过碘酸水溶液浸泡约4min（不能过长）。
3．倒去过碘酸，注意组织别随之一起倒掉，加蒸馏水洗约1min。
4．Schiff试剂浸泡15min。
注意避光处理，将其放在抽屉里，且Schiff试剂别沾到其他地方。
5．15min后，从抽屉中拿出载玻片，用亚硫酸盐溶液浸泡三次，共6min6．将载玻片放在自来水冲洗5min。
并用胶头滴管挡住组织切片。
7．蒸馏水浸泡1min。
8．倒掉蒸馏水，滴加苏木精复染胞核约7min。
9．流水洗5min。
滴加一滴蒸馏水，盖上盖玻片，吸干玻片外的蒸馏水，放在显微镜下进行镜检。
实验02 孚尔根核反应染色法
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有丝分裂各时期
中期 ——极面
后期
末期
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子细胞
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有丝分裂各时期
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六、注意事项
1. 水解时间和温度是实验的关键因素；
2. Schiff试剂中SO2的含量影响孚尔根反应的 颜色表现；
3. 压片技术是视野观察清晰与否的关键；
4. 材料的不同（DNA含量的不同），是影响 显色反应强度的根本因素；
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五、实验步骤
材料
培养的植物根尖长到2cm左右时，切下；或取幼小 花药或叶表皮或愈伤组织，或动物组织，或果蝇唾 腺等材料。
固定
将取出的材料放入新配制的Carrnoy固定液（无水 乙醇:冰醋酸=3:1）处理2~24hr→95%乙醇洗2次， 每次10min→80%乙醇洗1次，10min→70%乙醇， 冰箱保存。
染色30min~4h； 漂洗液漂洗2~3次，每次2~5min，待用。
五、实验步骤
以下各人独立完成： 将根尖置载玻片上，切取适当部位； 加45%醋酸洋红1滴； 压片； 镜检； 作图（实验报告）。
有丝分裂各时期
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有丝分裂各时期
间期
前期
中期 ——侧面
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实验二 孚尔根核反应染色法
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一、实验目的
1. 学习和了解孚尔根（Feulgen）反应的原理； 2. 掌握对植物组织及细胞中鉴别DNA分布的 孚尔根反应染色方法； 3. 掌握压片方法； 4. 了解制作玻片标本的方法； 5. 观察细胞中DNA的分布。
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Schiff试剂中的无色亚硫酸品红分子与活性醛 基反应而呈现为紫红色化合物。该产物能特异 地吸收峰值为550~570nm的光波。并在一定的 浓度范围内，在550~570nm光波的吸收值与 DNA含量成正比，即符合化学计量学关系。
实验二、DNA的原位显示—Feulgen染色法『目的要求』1、
『思考题』
欲得到一张好的Feulgen反应制片，制片过程 中应注意些什么？
• 水解是本实验成败关键之一。水解时间和温度
一定要合适，如果温度过高或时间过长，造成 水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流 失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基， 都不能呈现颜色反应。
• 用Schiff试剂染色前，蒸馏水的残留不宜过多
，否则会使染色剂浓度降低。
• 漂洗时，所用的亚硫酸水，最好在每次实验前
临时配制，以便保持较浓的SO2。
• 加盖玻片时，切勿用力过大。
『其他固定液』
Flemming固定液：1%铬酸水溶液 25ml，1%冰醋酸 （用前加入）10ml，蒸馏水 60ml
Champy固定液：3%重铬酸钾 70ml，1%铬酸 70ml，2% 锇酸 40ml
实验二、DNA的原位显示—Feulgen染色法
『目的要求』 1、掌握Feulgen反应的基本原理 2、掌握Feulgen反应操作全过程。 3、熟悉细胞化学技术
『实验用品』 光学显微镜、恒温水浴锅、染色缸、小烧杯、滴 管、载玻片、Schiff试剂、1M的HCL溶液、3%的 亚硫酸氢钠溶液，4.5%的醋酸、Carnoy液固定的gen反应的一般步骤： 1、材料准备：取一洋葱鳞茎，置于盛满水的小烧
杯上使其长出新根。待根尖长2cm左右时，于上 午9时剪下根尖用Carnoy固定液固定、保存。 （固定的目的是防止细胞死后变化，保持胞内固 有结构与状态） 2、水解：从冰箱取出预先准备好的洋葱根尖，用 清水洗3次，每次2min，换1M HCl洗一次，倾去 ，换入预热60℃的1M HCl，放入恒温水浴锅中在 60±0.5℃下水解8-15min（视材料而定）。 3、吸去热1M HCl，换入冷1M HCl洗一次，用蒸馏 水漂洗3次，每次2min。
《孚尔根核染色》课件
染色过程
孚尔根核染色包括几个关键步骤：细 胞固定、细胞通透性处理、DNA氧化 、染色和观察。
染色过程需要在弱酸条件下进行，以 促进DNA的氧化和后续的染色反应。
在染色过程中，需要使用特定的染料 ，如Giemsa染料或巴尔巴土染料，这 些染料能够与DNA-蛋白质加合物结 合，产生明显的染色效果。
染色效果
政策支持
政府可以出台相关政策， 支持孚尔根核染色技术的 研发和应用，促进其发展 壮大。
感谢您的观看
THANKS
该技术可用于DNA多态性分析 ，有助于研究基因变异与疾病 的关系。
技术局限性
1 样本量要求
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
2 交叉污染风险
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
3 假阳性结果
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
减少人工操作误差。
降低成本
通过优化试剂和设备， 降低检测成本，使更多 实验室和医疗机构能够
应用该技术。
05
孚尔根核染色技术的未来发展
技术发展趋势
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的发展，孚尔根 核染色技术将逐渐实现自动化和智能化，提 高染色效率和准确性。
环保与可持续发展
随着环保意识的提高，未来的孚尔根核染色 技术将更加注重环保和可持续发展，减少对 环境的污染和资源消耗。
《孚尔根核染色》PPT课件
目录
• 引言 • 孚尔根核染色技术原理 • 孚尔根核染色技术的应用 • 孚尔根核染色技术的优缺点 • 孚尔根核染色技术的未来发展
01
引言
核染色技术简介
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实验二孚尔根染色法
一、实验原理
染色体是遗传物质的载体，它的主要化学成分是脱氧核糖核酸(DNA)，DNA系核苷酸的多聚体，核苷酸又由碱基脱氧核糖和磷酸所组成，当细胞经60℃、1mol·1-1HCl处理后，不仅使分生组织的细胞彼此分离，而且可以破坏核内DNA链上的嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键，嘌呤脱下，脱氧核糖上的醛基暴露，形成含醛基的无嘌呤结构物，醛基与希夫试剂反应显紫红色。
细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此所以根据紫红色出现的部位就可鉴定脱氧核糖核酸(DNA)的存在，并广泛应用于核及染色体的研究中。
二、实验目的
学习和掌握孚尔根反应染色法，鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。
三、实验材料、用具及药品
1．材料：洋葱或大蒜的根尖
2．用具显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、吸管、烧杯、量筒、
3．药品希夫氏试剂(无色碱性品红液)、漂洗液、1mol·1-1 HCl、45％醋酸等。
四、实验步骤
1. 取材与固定：待大蒜根尖长1cm 时，于上午8时剪下根尖，经过预处理后投入卡诺固定液中固定2-24h。
固定后，保存在70%的酒精中，放入冰箱中冷藏供用。
2.水解试管1：取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，换1N HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1N HCl 浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟（视材料而定，水解时间可以从10分钟延长至30分钟）。
然后吸去热1N HCl，换入冷1N HCl洗一次，再用清水将根尖洗三次。
试管2（对照）取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，入预热60℃的蒸馏水浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟。
以下各步骤两试管相同。
（水解是本实验成败的关键之一。
重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。
如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。
）
3. 染色两试管中均滴加希夫试剂，浸没根尖，立即置于暗处处理0.5—1h，然后用漂洗液换洗3次，每次2min；再用蒸馏水换洗2次，每次2min。
4. 压片镜检。
分别取上述两试管中的根尖，置于载玻片上，滴加1滴45%醋酸，然后压片镜检。
〖注意事项〗注意水解时间和温度。
五、作业
1.经孚尔根染色的压片，用指甲油将盖玻片的四周封固成临时片，储于冰箱中。
2.比较根尖经盐酸水解处理与否所获得的结果，并作出解释。
附试剂配制
1．Schiff试剂称1g碱性品红于200ml煮沸的蒸馏水中，5分钟后断电使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入1N HCl 20ml，继续冷却至25℃，加入3g偏重亚硫酸钠，摇动瓶子使其溶解。
密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（4℃左右），18～24小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用。
如有不同程度的红色未褪，可加入1g活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。
密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。
2．漂洗液在200ml蒸馏水中，加入10ml 1N HCl 和10ml 10%亚硫酸钠溶液。
此液在临用前配制。
3．1N HCl 准确量取86.2ml浓盐酸（比重1.18）加入到913.8ml蒸馏水中。