石蜡切片技术

3.注意事项
(1) 冲洗彻底——否则收缩、变硬、抽取 (2)不能时间太长太急——变软，肿胀（吸水）
(3) 摇动有利于冲洗干净——加快分子运动
（四）脱水
1. 目的：
因石蜡与水不混合，在用石蜡透入前必须将细 胞中的水彻底脱掉，否则石蜡进不去材料，无 法让细胞变硬，无法进行切片。
2.方法
脱水剂的选择 原则：①凡与水和石蜡亲和性好的②且不使细胞剧 烈收缩膨胀，③不能大量抽提细胞成分均可作为脱水剂。 常用的是乙醇和丙酮，使用乙醇最多，此外还有叔丁醇、 正丁醇等。 脱水的一般过程：多采用静止脱水15%——35%—— 50%——70%——83%——95%——100%（2~3次），丙酮 较酒精快，浓度相应低一些。起始浓度的选择主要根 据材料的性质而定，动物和幼嫩植物一半从15%或35% 开始；老的或木质成分多从15%~或70%开始。如木本 植物的茎。 脱水时间：每次脱水时间也是根据细胞的老嫩即含水 量和组织块大小及温度而定，原则是嫩短老长，嫩的 15-30m，老的30m-4h，还可长达8-12h，如洋葱一般 为1h 脱水的温度：室温和0-4°C两种，前者时间短，后者 缓慢一些。

3.注意事项：



脱水一定要脱干净，彻底，否则石蜡很难进入而 导致不能切片。 脱水时间长短要合适，太短脱不干净，太长低浓 度容易细胞变软，膨胀；太长高浓度则细胞收缩， 变脆，提取严重，影响切片。 梯度不能太大，负责拉伤，最后100%乙醇脱水要 2-3次，以保证脱水完全。 保存，只能在70%酒精中保存（0~4℃）若时间不 够可暂时保存在70%酒精中过夜，第二天再继续 实验。也可长期保存几个月，在1：1：1=甘油： 蒸馏水：95%酒精中保存最好（低温）
操作：
纸盒——标签——加组织——倒石蜡——拨正 组织块——放入水盆——沉底 盆中放满冷水，点燃温台下的酒精灯或（电热 板），放3个解剖针和纸盒在温台上. 将标签放入盒底，文字朝下 将温箱中取出的石蜡杯，将材料拨入纸盒内， 再倒入新鲜的石蜡，将材料拨到适当位臵。 将纸盒轻轻提取放入盆面，表面凝固后倾斜使 冷水进入盒中，立即沉入水中迅速冷却， 30min~1h可取出，取出蜡条备用。

（2）冲洗方法


静臵冲洗：加入冲洗液，静臵一段时间，倒出 该液，加入新的冲洗液，反复几次（5~6次）， 每次30分钟左右，振荡有好处。（时间开始一 次为20~30分钟，以后几次可延长1~2h，）具 体时间与材料性质、大小和温度有关。 流水冲洗：将小瓶用纱布蒙住，放入盆中，流 水冲洗，效果较静臵冲洗为好，时间为12~24h， 但流水不能太大太急，也不能太长，太长使组 织变软肿胀，冲洗时间有时长达24h左右，如 木本植物的木质部。

（二）固定
1.目的： 为了使取样的细胞在形态结构和成分方面 保持与生活的状态一样，就必须迅速杀死细胞 避免失水变形，自溶破坏结构等。 固定液的选择：快；不溶解；不收缩膨胀； 软硬适中；增加折光度；增加染色能力；长期 保存等7项。
2.方法

（1）固定剂的种类：一般采用化学固定 单纯固定：只用一种试剂固定： 混合固定：用两种或两种以上的试剂混 合在一起进行固定如：




3.注意问题：
（1）包埋时石蜡不能过早冷却（放在温台上） （2）冷却要快 （3）若出现白色、浑浊结晶，可能是由于： a.脱水不干净； b.组织内部或石蜡中混有透明剂； c.组织块倒入时，周围蜡已凝固： d.石蜡冷却太慢； e.石蜡质量不好。
（八）切片
1. 目的：将观察的材料变薄，光线容易穿过； 2．方法： （1）固定：取出蜡块，修整材料长条形，避 免损伤。然后将底部粘于金属和渗蜡木块上。 （2）修块：修块使切片成蜡带而不弯曲，组 织便于镜检，组织块需要修整齐，最好为梯形、 长方形、正方形。 组织块必须①上下平行，⑵但左右的蜡、上下 的蜡不要太多或太少；③正方形或长方形，可 各切去一角，以便识别。


F.A.A固定液 又称标准固定液,万能固定液.适 用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片.在植 物形态解剖研究上应用极广; FAA固定液的优点在于：兼有保存剂作用,冰醋 酸既能抵消酒精和甲醛对组织的收缩作用又是 细胞核的优良固定剂，沉淀核蛋白，且对免疫 组化无碍更无掉片之理。FAA固定液具有强大 的固定效能，较之单纯固定更科学更快更好！ 对染色体的观察效果较差.
（五）透明

1.目的：
为了使石蜡更好进入组织，解决乙醇与石蜡亲 和性较差的问题，并能增加遮光系数，且与封 藏剂很好混合；
2.方法：




（1）透明剂的种类 a.选择的原则：①与乙醇和石蜡均有较好的亲和性， ②又不破坏细胞结构（形态、结构）③不能大量提取 细胞成分 b.种类：二甲苯、氯仿、香柏油，苯胺油，其中以 二甲苯最好 （2）透明过程 （乙醇：二甲苯）2:1——1:1——1:2——纯（二甲 苯）但有时也只用1：1和纯的二甲苯即可，时间要长 （1h）纯的二甲苯要多换几次保证去乙醇完全。 （3）时间：随组织块大而异，也与温度有关。一般 为30m~2h，如洋葱根尖为每次1h （4）温度：多常温。
杀生（取材）——固定——冲洗——脱水— —保存——透明——石蜡透入——包埋—— 切片——复水——染色——脱水——封藏— —观察保存 （一）取材、固定、洗涤、脱水 （二）透明、透蜡、包埋 （三）切片、贴片 （四）染色、封藏



（一）取材
杀生（动物） 1.目的：动物必须杀生，然后取出所需组织 2.方法：一般采用乙醚（氯仿）麻醉后解剖， 取出所需组织。 3.注意事项： 性别合适 麻醉前动物生活正常，以免影响其代谢活动， 进而影响细胞结构 取材部位要准， 速度快
1.目的：
让石蜡透入细胞，代替二甲苯支持细胞，增加 强度，防止在切片时细胞变形和破碎，便于切 片。
2.透蜡
（1）对石蜡的要求 （2）透蜡的过程
（1）对石蜡的要求
①熔点已知 ②质量：结构细腻， ③光滑均匀 ④无灰尘和挥发物；a透明：b无不透明的物；c 无气泡 种类：石蜡熔点在42~60℃之间，包埋石蜡在 50~60℃之间，可分为两种①软石蜡52~56℃ （动物）②硬石蜡54~58℃（植物）③浸片 （4um以下）用56~60℃为好。
透蜡的过程



植物：二甲苯:石蜡——纯石蜡 50ml烧杯2个 1/2二甲苯＋1/2石蜡→石蜡→石蜡，根据组 织块的大小，每步20min~60min，温度62℃ 换蜡的方法：A：移材料： B:倒石蜡 动植物材料在透蜡的过程中前者时间短后者 时间长，透蜡时以换蜡不转移材料为好。 动物：从透明剂中取出——透明剂石蜡混合 液（15~20min）——纯石蜡——换一次新鲜 石蜡。（透蜡时间为1~1.5h）洋葱根尖为1h。

卡诺氏固定液(Carnoy's Fluid) 适用于一般植物 组织和细胞的固定,常用于根尖,花药压片及子房 石蜡切片等.有极快的渗透力,根尖材料固定15— 20min即可,花药则需1h左右,此液固定最多不超过 24h,固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止;如 果材料不马上用,需转入70%酒精中保存.固定液的 重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染 色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱 性，达到优良染色效果。
（2）固定方法


பைடு நூலகம்
静臵固定：将组织块放入盛有固定液的小的 称量瓶、小烧杯或青霉素瓶中，在室温或低 温（0~4℃）固定一段时间，不断摇动能增 加固定效果，植物和动物经常使用这种方法。 灌注固定：常用于动物，将固定液通过已麻 醉的动物血管中，让血液流动，固定所需细 胞，该方法有点，固定均匀，不出现自溶现 象，但较繁琐。



石蜡好坏可用以下方法辨别： a.熔入纸盒中无气泡（挥发物；） b.无不透明颗粒（灰尘），断裂处无颗粒 （灰尘，切片无细小颗粒（灰尘） C.在30-35℃放臵24小时无气泡或不透明结 晶状小点。 不好石蜡的利用： ①加热至开始冒烟后移至火焰较小的的灯上， 再加热数小时，除去挥发物和水分； ②冷却后杂质下沉可除去，所以使用过的石 蜡可再重复利用切效果较好。
第二章 石蜡切片技术
一、显微切片技术产生的原因



光学显微镜发展到一定程度之后，渴望知道细胞 结构 由于组织太厚，光线很难穿过 压片可使组织变薄，但引起变形、易位，除核外， 看不到其他结构，因此需要切片变薄。 因细胞水多，太软，无法切片

鉴于上述情况找到一种方法使细胞水被替代， 变硬，能直接切片的方法，最广泛使用的就是 石蜡切片技术
（一）取材
1.目的：得到所需要的组织 2.方法：a.用剪刀剪下组织 b.冲洗动物组织，动物（生理盐水、糜蛋白酶溶 液）植物（缓冲液或水）冲洗干净，防止失水，避免压挤 损伤，用生理盐水、糜蛋白酶冲去表面的血、粘液和赃物。 c.切成小块 3注意事项： 要准 要快 避免损伤（方向，刀要快，不能挤压） 植物取材：用剪刀剪下材料时一定要植物生活正常，不要 因缺水、营养和温度光照发生明显改变，影响细胞结构， 同时发育程度、部位要准。
单纯固定：



福尔马林formalin:10%的甲醛（37%——40%） 醋酸（0.3%~5%） 苦味酸（饱和溶液，三硝基苯酚） 铬酸0.5~1% 锇酸1~2% 升汞（氯化汞饱和水溶液约7%）
混合固定：



用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如： 卡诺氏固定液 酒精：冰醋酸（3：1） 酒精：冰醋酸：氯仿（6：1：3）适用于动植物一 般组织细胞。 FAA 福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收缩;还 可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸发和材料变硬. 但单细胞及丝状藻类除外，也不适于细胞学研究
3.注意事项