实验六：薄层层析与柱层析
柱层析和薄层层析实验报告
柱层析和薄层层析实验报告篇一：柱层析实验报告柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂6．饱和氯化钠溶液3．丙酮7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃）8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
实验柱层析和薄层层析
实验柱层析和薄层层析层析法是通过分离混合物组分的一种方法，主要有柱层析和薄层层析两种。
本文将介绍它们的原理、步骤和应用。
实验柱层析原理实验柱层析是一种液相色谱分离技术，基于混合物组分在固定相和流动相之间相互分配的差异进行分离。
实验柱层析一般采用正交试验法，即通过改变柱填料、流动相、流速和溶质质量浓度等参数，以缩小响应面，得到最佳分离条件。
步骤1.选择合适的柱径和柱高，并选用合适的柱填料。
2.准备流动相，并过滤除杂质。
将柱填料与流动相充分浸泡，使柱填料达到平衡状态。
3.将混合物加到柱顶，并开始淋洗。
此时各组分在流动相和固定相之间交替分配，被固定相吸附或溶解，同时前进，终于分离。
4.根据检测结果，确定样品组分并计算出分离效果和纯度。
应用实验柱层析作为一种分离技术，广泛应用于医药、化学、生物学等领域。
常见的应用包括：1.分离蛋白质、核苷酸等生物大分子。
2.对化合物进行分离、纯化和定量分析。
3.分离和提取天然产物和药物。
薄层层析原理薄层层析是一种比较简单、快速的分离方法，其原理与柱层析类似，只是采用了薄层硅胶或氧化铝等作为固定相，可直接对液态和固态样品进行分离。
步骤1.准备薄层柱。
2.准备固定相毛细管与混合样品。
3.在薄层柱上涂上一层液态固定相，然后将其晾干。
4.将样品分别点于薄层柱的一端，放入发展槽中，加入足量发展剂。
5.等到液面距离薄层柱顶端约0.5cm时取出，划线，停发展，晾干。
6.在笼罩于发展剂蒸汽中的小钵中烘干至静止。
应用薄层层析作为快速分离、纯化和检测生物和化学样品的一种常用手段，其应用包括：1.对合成的物质进行纯化和分离。
2.植物药的含量测定。
3.对复杂化学物质进行溶剂系统选择和定性分析。
实验柱层析和薄层层析都是常见的层析法，虽然原理类似但有各自的优缺点和应用场景。
在实际应用中，需要根据具体的分离任务选择合适的方法。
薄层色谱和柱色谱分离法
Rf = 溶质的最高浓度中心至原点中心的距离/溶剂前沿至原点中心的距离
薄层层析可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离：也可用于多达５００mg样 品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。
三、 仪器及试剂
硅胶薄板、展开缸、苏丹红乙醇溶液、间硝基苯胺乙醇溶液、苏丹红间硝基苯胺混合溶液、 乙酸乙酯：石油醚（5:95）
薄层色谱和柱色谱分离法
一、 实验目的
１．了解色谱分离的原理及其应用。
2．初步掌握薄层色谱和柱色谱的操作技能。
二、 实验原理
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同， 使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。 流动的液体称为流动相，流动相可以是气体，也可以是液体；固定不动的物质称为固定相，可 以是固体也可以是液体（需吸附在支持剂上）。根据组分在固定相中的作用不同，分为吸附色 谱、分配色谱、离子交换色谱等。按操作条件可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱和 液相色谱等。层析缸ຫໍສະໝຸດ 层析板 试样点展开剂
展开版
四、 操作要点和说明
１． 铺板 本实验直接使用购买的薄层硅胶板，每人一块
２． 点样 用毛细管点样，样点距玻璃板１cm，样点直径不超过２mm，三个样点间距５-６mm。
３． 展开 薄层色谱的展开，需要在展开缸中进行如图。展开方式采用倾斜上行法。
４． 计算Rf值 准确地找出原点，溶剂前沿以及三个样品展开后斑点的中心，分别测量溶剂前沿和样点 在薄层板上移动的距离（如图），求出其Ｒf值。
柱色谱是利用各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解析能力不同，使混合物随流动相 流过固定相，发生反复多次的吸附和解析过程，从而使混合物各组分分离开。所用仪器为色谱 柱。纸色谱、气相色谱和液相色谱看教材。
薄层色谱与柱层析
叶绿素 叶绿素
叶黄素'， " 叶黄素
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色谱法的分类(fēn lèi)
1)根据流动相分类: 气相色谱—以气体作流动相 液相色谱—以液体作流动相 超临界色谱—流动相是在接近它的临界温度
和压力下工作(gōngzuò)的液体 2)根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱
反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定(gùdìng)（液 ）相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为 反相分配色谱。当分离脂溶性或极性较小的成分， 如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反 相分配色谱。实践中有70%以上的分配色谱都采用 反相色谱。
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分配柱色谱的应用 分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物
。
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Rf值测量(cèliáng)示意图
Rf与组分性质 (xìngzhì)、流动相 及溶解度有关 极性组分→易保留 ，Rf 小 非极性组分→易流 出, Rf大
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薄层固定相
按照固定相的种类，薄层板可分为正相薄层板（如 硅胶薄层板、聚酰胺薄层板）、反相薄层板（如 C18键合相薄层板）等。
） Rf值＋斑点颜色特征（原位化学反应） 多种展开剂体系展开进行验证 与其他技术联用
第二十三页，共50页。
展 开 (z hǎ n kā i) 后 的 薄 层 板
第二十四页，共50页。
（二）定 量
目视比较法
将不同量的标准品作为系列，同样样品分 别点在同一薄层上展开，显色后，目测比较斑点颜色的 深浅和面积大小，求出未知物含量的近似值，作为半定 量法，精密度为±10%。
实验六：薄层层析与柱层析
实验六薄层层析及柱层析实验目的1.了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2.掌握薄层层析的基本操作,薄层层析分离顺、反式偶氮苯。
3.了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法4.采用柱层析分离反式偶氮苯及靛红的混合物实验原理偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。
含有两个苯基分别及偶氮基–N=N–两端相连的结构。
偶氮苯有毒，易燃。
偶氮苯有顺（Z）-反（E）-异构体。
反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。
反式的热力学性质稳定。
当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物。
偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。
顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。
色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。
待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，及流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。
薄层色谱属于固-液吸附色谱。
薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。
由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。
TLC除了用于分离外，还可以通过及已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展开剂的手段。
上图中红色化合物的R f等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。
柱层析也属于固-液吸附色谱。
在一根玻璃“分离柱”中进行。
管中装上适当的粉末作为国定相。
待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。
靛红及偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者分离。
柱层析实验报告
柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂 6．饱和氯化钠溶液3．丙酮 7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用. 2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
柱色谱和薄层色谱分离技术
样品的收集
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸 附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可 以采用氧化铝作固定相。另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果 用大试管，可能一根就收到了三个样品， 如果都用小试管那工作量又太大。
减压柱层析在进行溶剂洗脱时是将溶剂在真空下全部抽出,使固定相“干”后才加入新的 洗脱剂作下一组分的收集.其原理相当于薄层层析的多次展开,它的分离效果可与薄层层析 媲美。
加压实例就不一一详举了，下面几个是最好。柱子长了，相应的塔板数就高。 柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较 薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样 品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶 剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易 得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂 了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保 的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱 子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具 体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所 需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用 小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不 到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的， 也可以减小淋洗剂的极性等等。
薄层色谱（TCL） 柱色谱
TLC的作用 •跟踪反应进程 •为柱层析选择适当的淋洗剂
a/l或b/l
=0.2~0.3
选择适当的展开剂是首要任务.。一般常用溶剂按照极性 从小到大的顺序排列大概石油迷<己烷<苯<乙醚 <THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往 往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使 用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的 溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有： Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Ac etone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH 2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate
实验六柱层析
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2．掌握柱层析的操作技术。
二．实验原理层析法是一种物理分离方法。
柱层析法是层析方法中的一个类型，分为吸附柱层析法和分配柱层析法。
本实验仅介绍吸附柱层析法。
吸附柱层析法是分离、纯化和鉴定有机物的重要方法。
它是根据混合物中各组分的分子结构和性质（极性）来选择合适的吸附剂和洗脱剂，从而利用吸附剂对各组分吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同达到分离目的。
吸附柱层析法通常是在玻璃层析柱中装入表面积很大、经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂（常用的吸附剂有氧化铝、硅胶等）。
当混合物溶液流过吸附柱时，各组分同时被吸附在柱的上端，然后从柱顶不断加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物吸附能力不同，从而随着溶剂下移的速度不同，于是混合物中各组分按吸附剂对它们所吸附的强弱顺序在柱中自上而下形成了若干色带，如图9-1示。
在洗脱过程中，柱中连续不断地发生吸附和溶解的交替现象。
被吸附的组分被溶解吸出来，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒，把组分从溶液中吸附出来，而继续流下的新溶剂又使组分溶解而向下移动，这样经过适当时间移动后，各种组分就可以完全分开，继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，再继续加溶剂直至各组分依次全部由柱中洗出为止，分别收集各组分。
本实验是用活性氧化铝作吸附剂，分离甲基橙和亚甲蓝混合物。
氧化铝是一种极性吸附剂，对极性较强的物质（如甲基橙）的吸附力强；对极性较弱的物质（如亚甲蓝）的吸附力较弱。
所以应选择极性小的洗脱剂（乙醇）首先将亚甲蓝洗脱，甲基橙则留在层析柱的上部，甲基橙的洗脱则要用极性大的水为洗脱剂。
三．实验仪器及药品1．仪器层析柱，抽滤瓶，烧杯，铁架台，水泵（或油泵），长玻棒，小量筒，脱脂棉。
2．药品活性氧化铝，95%乙醇，0.5%甲基橙与亚甲蓝的乙醇溶液。
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实验六薄层层析与柱层析实验目的1.了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2.掌握薄层层析的基本操作,薄层层析分离顺、反式偶氮苯。
3.了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法4.采用柱层析分离反式偶氮苯与靛红的混合物实验原理偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。
含有两个苯基分别与偶氮基–N=N–两端相连的结构。
偶氮苯有毒，易燃。
偶氮苯有顺（Z）-反（E）-异构体。
反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。
反式的热力学性质稳定。
当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物。
偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。
顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。
色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。
待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，与流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。
薄层色谱属于固-液吸附色谱。
薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。
由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。
TLC除了用于分离外，还可以通过与已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展开剂的手段。
上图中红色化合物的R f等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。
柱层析也属于固-液吸附色谱。
在一根玻璃“分离柱”中进行。
管中装上适当的粉末作为国定相。
待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。
靛红与偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者分离。
仪器与试剂分析天平，TLC，锥形瓶，毛细管，层析柱，棉花，量筒，硅胶，蒸发皿，展缸；EtOAc, CH2Cl2, 石油醚，靛红；请自带尺子（用于计算R f值）颜老师在实验开始之前已经准备好的试剂：a. 偶氮苯的溶液（15 mg in 1mL EtOH）；b.靛红的溶液（15 mg in 1mL CH2Cl2）；c. 靛红与偶氮苯的均匀混合物（靛红1.4 g + 偶氮苯3.5 g）。
实验内容a)光照异构化取0.1 g反式偶氮苯溶于5 mL无水乙醇中，将此溶液放于试管中，密封，置于可见光下二星期，以便与光照前的溶液进行对比。
b)薄层层析取管口平整的毛细管吸取光照后的偶氮苯溶液，在离薄层板边沿约0.5 cm 的起点线上点样。
再用另一毛细管吸取未经光照的反式偶氮苯溶液点样。
待乙醇挥发后，将点好样品的薄层板放入内衬滤纸的展缸中。
展缸内已放置展开剂（乙酸乙酯/石油醚=1/40）。
薄层板的点样端在下方，浸入展开剂，展开剂不要没过起点线，也不要碰到样品点。
待展开剂前沿上升到离板的上端约1 cm处时，取出薄层板，立即用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，置于空气中晾干。
可观察到薄层板上经光照后的偶氮苯溶液点样处上端有两个黄色斑点（哪一个斑点是顺式的？哪一个斑点是反式的？）。
计算异构体的R值。
f用上述相同的方法，采用Ethyl Acetate : Petroleum Ether = 1:1为展开剂，对靛红与偶氮苯的混合物进行TLC，为下面的柱层析选择展开剂。
c)柱层析1．将层析柱固定在铁架台上，一定要保持柱子竖直。
2．将层析柱洗净后在柱底部放入一小团脱脂棉花。
3．在锥形瓶中称重7g 硅胶（SiO2），并用Ethyl Acetate :Petroleum Ether (1:40)调匀。
在层析柱的下方放置一个锥形瓶，以收集流下的液体。
加入少量洗脱剂于层析柱中，以润湿棉花，使其贴在柱子下端。
4．打开层析柱活塞，控制溶剂下流，将硅胶悬浊液沿柱子侧壁加入，并用少量的溶剂洗去残余的硅胶，并加入柱中。
用装有橡皮管或塞子由下向上轻轻敲击柱子外壁，将气泡赶出，使硅胶填装均匀。
并加压使硅胶紧密，以获得较好的分离效果。
轻轻敲击，使硅胶最上层成均匀平面，然后用药匙沿柱子侧壁，轻轻地、慢慢地在硅胶表面覆盖一层海砂（注意：不要破坏硅胶的上平面）。
关闭活塞，备用。
5．打开活塞，当溶剂液面降至海砂表面时，关闭活塞。
用滴管沿柱子侧壁加入靛红与偶氮苯混合物的溶液（称取40 mg，置于1.5mL的塑料样品管，加入1 mL二氯甲烷（CH2Cl2），超声振荡使其溶解）。
打开活塞，使溶剂液面降至海砂表面，关闭活塞。
再用少量的展开剂洗塑料样品管，加入层析谱中，并注意洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，流到液面，关闭活塞。
重复上述操作，直到将所有化合物冲到硅胶里面。
6．沿侧壁加入大量的洗脱剂Ethyl Acetate : Petroleum Ether (1:40)，打开活塞，加压保持一定的流速，观察色带的形成和分离。
7．当第一个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形瓶，打开活塞，收集全部色带。
然后，改用Ethyl Acetate : Petroleum Ether(1:1)作为洗脱剂。
关闭活塞，换一个空的且干净的锥形瓶，打开活塞。
当第二个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形瓶，打开活塞，收集全部色带。
柱层析分离结束。
8．柱层析分离结束后，采用TLC对上述分离的两个溶液进行分析，总结分离效果。
同时，打开层析柱活塞，在加压下让展开剂流干，然后将硅胶倒入指定的固体废物桶中。
切勿倒入水槽或普通垃圾桶。
预习时的问题1.在薄层层析实验中，为什么点样的样品斑点不可浸入展开剂的溶液中？为什么进行薄层层析时展缸要盖上盖？2.当用混合物进行薄层层析时，如何判断各组分的在薄层板上的位置？靛红与偶氮苯，哪一个的极性较强？为什么？3.柱层析时柱中若留有空气或者是填装不均匀，对分离效果有何影响？如何避免？4.偶氮苯和靛红物理化学性质？毒性？有什么应用？偶氮苯光照异构化的机理？why is trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?其它阅读材料1.光化学由光的作用引起的化学反应近年来日益受到人们的重视，光合作用就是最重要的光化学反应。
研究激发态分子化学行为的光化学反应已经成为有机化学的一个重要分支。
光不仅可以引起多种多样的化学反应，合成各种前所未有的奇妙反应分子，而且与我们的日常生活及生命现象有着密切的联系。
2. 薄层色谱1.固定相的选择氧化铝和硅胶是薄层层析色谱常用的固定相。
氧化铝多用于分离碱性或中性有机物；而硅胶的吸附性源于表面的Si-OH基，主要用于分离酸性、中性有机物质。
薄层色谱用的硅胶有薄层色谱用的硅胶有60G、6OGF254、60H、60HF254和60HF254+366等类型，其中G表示含有13％硫酸钙（作为黏合剂）；H表示不含硫酸钙；F254表示含有2％无机荧光物质，在254 nm的紫外光照射下发出绿色荧光。
与硅胶相似，氧化铝也因含有黏合剂或荧光剂而分为氧化铝H、氧化铝G、氧化铝HF254和氧化铝GF254等类型。
黏合剂除硫酸钙外，还可用淀粉、羧甲基纤维素（CMC)。
2.操作方法①点样在薄层板一端约1cm处，用铅笔轻轻划一条作为起点线。
样品用易挥发性溶剂溶解后，用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触到起点线的某一位置上。
如果溶液太稀，可多点几次，但要等第一次样品溶剂挥发后，再点第二次。
点好样品后，待溶剂挥发干净，才可以进行下面的展开过程。
②展开剂的选择选择展开剂，首先应考虑对被分离物有一定的溶解度和解吸能力。
由于硅胶和氧化铝都是极性吸附剂，所以展开剂的极性越大，试样在薄板上移动的距离越远，R值（f R值是一个化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比f值）越大。
例如，在分离过程中常发现R太小，说明展开剂极性不够，需要考f虑加入一种极性强的展开剂进行调控。
发现R值太小，说明展开剂极性不够，f需要考虑加入一种极性强的展开剂进行调控。
常用展开剂的洗脱力由小到大的顺序为：石油醚、环己烷、四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡啶、有机酸等。
此外，在展开过程中，展开缸内展开剂的蒸气须始终处于饱和状态。
一般可用一块方型滤纸贴于缸壁上（下端浸于展开剂中），盖好密封一段时间。
取放薄层板应迅速。
③显色展开后，要等溶剂挥发完才能显色。
若被分离的是有色组分，展开板上即呈现出有色斑点。
若化合物本身无色，则可以在紫外灯观察有无荧光斑点；或用碘蒸气熏的方法显色。
显色后，用铅笔轻轻画出斑点位置，计算R值。
f3．柱色谱吸附层析柱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱溶剂的选择，而且与制成的层析柱有关；要求柱中的吸附剂用量为被分离样品量的30-40倍，若需要可增至100倍。
柱高与直径之比为4:1至10:1，一般为7.5:1。
实验室常用的层析柱,其直径在0.5-10 cm之间。
当吸附物的色带占吸附剂高度的1/10—1/4时，此层析柱已经可作层析分离了。
柱层析常用吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙及活性炭等，吸附剂要求颗粒大小均匀，越细分离效果越佳，但此时洗脱阻力会增大，所以要选择合适大小的吸附剂。
氧化铝分酸性、中性和碱性三种，本实验应用中性氧化铝。
化合物的吸附能力与它的极性成正比，具有较大极性基团的化合物，其在吸附剂上吸附能力较强。
氧化铝对各化合物的吸附性按以下次序递减：酸>醇，胺，硫醇>酯，醛，酮>烃>卤化物，醚>烯>饱和烃。
强吸附性的化合物要用强极性溶剂来洗脱。
作为洗脱剂的溶剂要求其具有一定极性，适合于被分离物的分离，体积尽量要小，此外要求易挥发，易除去(乙醚等挥发性太大的溶剂不合适)。
洗脱剂的极性按下列次序递增：己烷或石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸。
装柱要求吸附剂必须均匀填充于柱内，不能有气泡和裂缝，否则将影响洗脱和分离。
在装柱时，通常把柱子竖直固定好，关闭下端活塞，底部用少量脱脂棉轻轻塞紧，加入0.5 cm厚的海砂，然后加入溶剂到柱子体积的1/4，用一定量的溶剂与吸附剂在烧杯中调成糊状，打开柱下端的活塞，让溶剂一滴一滴地滴入锥形瓶中，同时把糊状物快速倒入柱中，吸附剂通过溶剂慢慢下沉，进行均匀填充。
柱顶部1/4处一般不填充吸附剂：以便使吸附剂上面始终保持一液层。