新一代测序技术组装拼接软件velvet使用简介
生物信息学大实验_实验指导
实验1基因组序列组装（软件CAP3的使用）一、实验目的1．了解基因组测序原理和主要策略；2．掌握CAP3序列组装软件的使用方法。
二、实验原理基因组测序常用的两种策略是克隆法（clone-based strategy）和全基因组鸟枪法（whole genome shotgun method）。
克隆法先将基因组DNA打成大的片段，连到载体上，构建DNA文库；再对每一个大片段（克隆）打碎测序。
序列组装时先组装成克隆，再组装成染色体。
克隆测序法的好处在于序列组装时可以利用已经定位的大片段克隆, 所以序列组装起来较容易, 但是需要前期建立基因组物理图谱, 耗资大, 测序周期长。
全基因组鸟枪法测序无需构建各类复杂的物理图谱和遗传图谱，采用最经济有效的实验设计方案，直接将整个基因组打成不同大小的DNA片段构建Shotgun文库，再用传统Sanger测序法或Solexa等新一代测序技术对文库进行随机测序。
最后运用生物信息学方法将测序片段拼接成全基因组序列。
该方法具有高通量、低成本优势。
序列组装时，先把把单条序列（read）组装成叠连群（contig）、再把叠连群组装成“支架”（scaffold），最后组装成染色体。
本实验将练习在Linux环境下用CAP3软件组装流感病毒基因组。
1．CAP3序列组装程序简介Huang Xiaoqiu. 和 Madan，A. 开发的一套用于序列拼接的软件，此软件适用于小的数据集或 EST 拼接，它有如下特征：1. 应用正反向信息更正拼接错误、连接contigs。
2. 在序列拼接中应用 reads 的质量信息。
3. 自动截去 reads5`端、3`端的低质量区。
4. 产生 Consed 程序可读的ace 格式拼接结果文件。
5. CAP3 能用于Staden软件包的中的GAP4 软件。
2．下载此软件可以免费下载，下载地址：http：///download.html。
填写基本信息表格，即可下载。
新一代测序技术的原理
新一代测序技术的原理新一代测序技术（Next Generation Sequencing, NGS）是一种高通量、高效、低成本的基因组测序技术，能够同时获取大量DNA片段的序列信息。
它的原理基于DNA的放大和分离，并使用特殊的荧光探针来测定每个碱基的序列。
首先是DNA放大和分离。
新一代测序技术使用PCR（聚合酶链式反应）方法，将原始DNA样品放大成大量的DNA片段。
PCR是一种体外体系中，利用DNA聚合酶的反复扩增特异性DNA序列的技术。
首先，在PCR反应中加入二个特异性引物，引物的碱基序列对应着待扩增片段的两个端点。
然后，在PCR反应中引入DNA聚合酶，该酶能够在适当的温度下，在引物的作用下，将DNA双链分离，并在两个引物的作用下，在新合成的DNA链上进行反复扩增，使DNA片段增加到成千上万倍的数量。
这样，DNA样品就得到了充分的扩增。
其次是碱基识别和测定。
新一代测序技术使用的碱基识别方法主要包括荧光ddNTP法和合成法。
荧光ddNTP法是通过不同颜色的荧光标记的氧化型二脱氧核苷酸（ddNTP）来识别碱基。
在合成DNA链的过程中，当酶到达一些位置时，会加入带有不同颜色荧光标记的ddNTP，并且会在末尾加上一个磷酸二酯键，阻止DNA链的进一步延伸。
这样，就可以根据不同的荧光信号来推断碱基的序列。
合成法则是一种体外合成DNA片段的方法。
通过在玻璃基底上逐渐加上碱基和荧光标记组成的碱基盖片，合成整个DNA片段。
合成的过程中，每加一个碱基，会检测并记录下其含有的荧光信号，从而推断出该位置上的碱基。
无论是荧光ddNTP法还是合成法，都需要将片段放入专用仪器中，通过激光器和荧光探测器测定每个碱基的信号。
这些信号通过计算机软件进行处理，最终得到DNA片段的完整序列信息。
新一代测序技术的优势在于其高通量、高效和低成本的特点。
相比传统的Sanger测序技术，新一代测序技术能够一次性测序数以百万计的DNA片段，大大提高了测序效率，缩短了测序周期，并且降低了测序成本。
新一代基因测序技术原理和应用
新一代基因测序技术原理和应用基因测序技术是解读生物基因组的重要方法之一，对于深入了解生物基因的结构和功能起着至关重要的作用。
近年来，随着科学技术的不断发展，新一代基因测序技术的出现，进一步提高了测序速度与准确度，为基因研究和应用提供了更多可能性。
一、新一代基因测序技术的原理新一代基因测序技术相比传统的Sanger测序技术，采用了高通量并行测序的方法，能够在短时间内同时测定大量的DNA序列，大大提高了测序的效率和准确度。
目前，常用的新一代基因测序技术主要包括Illumina/Solexa 测序、ABI SOLiD测序、454测序和Ion Torrent测序等。
1. Illumina/Solexa测序原理Illumina/Solexa测序是目前应用最广泛的测序技术之一。
其原理主要基于DNA合成过程中的核酸链延伸和荧光信号的检测。
首先，DNA样本经过片段化处理，生成短小的DNA片段。
随后，这些片段会与具有固定引物的光纤芯片上的端子进行连接。
接下来，在PCR反应中进行扩增，生成成千上万个复制物。
之后，将芯片放入Illumina测序仪中，通过循环终止法进行测序。
在每个循环中，通过在碱基末端发行碱基的可逆终止法，每次只释放一种具有特定荧光标记的碱基，并通过激光检测其荧光信号。
最终，通过分析测序结果的荧光信号，可以获得DNA序列。
2. ABI SOLiD测序原理ABI SOLiD（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection）测序技术是一种通过链接寡核苷酸和检测碱基的方法进行测序。
其核心原理是通过两个同时存在的碱基标记对DNA进行测序。
首先，DNA片段经过端修复，再通过连接引物的方法进行适配体制备。
然后，在适配体上引入特定的引物序列，将这些标记不同的适配体引物链接到DNA片段上。
在测序过程中，利用红外线激光对适配体的碱基进行激发，并通过信号检测系统检测每个碱基的颜色和强度，进而确定序列。
DNA测序技术在基因组拼装中的应用教程
DNA测序技术在基因组拼装中的应用教程引言：随着生物学和医学研究的不断发展，DNA测序技术成为了基因组研究和人类遗传学领域中不可或缺的工具。
其中，基因组拼装作为DNA测序分析的重要一步，通过将短序列片段组装成完整的基因组，从而实现对基因组结构和功能的深入研究。
本文将介绍DNA测序技术在基因组拼装中的应用教程，以帮助读者更好地了解并应用这一重要的研究技术。
一、DNA测序技术概述1.1 Sanger测序方法Sanger测序方法是最早被开发出来的测序技术，通过合成退火技术，逐个地确定DNA序列。
该方法虽然被取代，但在一些特殊研究领域仍然有应用。
1.2 高通量测序技术高通量测序技术代表着第二代测序技术的进步。
其中包括Illumina测序，Ion Torrent测序和PacBio测序等。
这些技术以其高效、快速和经济的特点成为了目前主流的测序方法。
二、基因组拼装简介2.1 基本概念基因组拼装是指将所得的测序reads按照正确的顺序组装起来，恢复出原始基因组的过程。
通过基因组拼装，可以得到较长的连续序列，有助于揭示基因组结构和功能以及生物学上的重要信息。
2.2 拼装技术2.2.1 重叠图拼装重叠图拼装是最早被开发出来的拼装技术，通过比对reads之间的相似性构建序列间的重叠图，然后通过图论算法将重叠图拼接到一起。
2.2.2 de novo拼装de novo拼装是目前主流的拼装技术，通过组装算法将测序reads拼接成连续的序列。
常用的de novo拼装算法包括：Velvet，SPAdes，SOAPdenovo等。
三、DNA测序技术在基因组拼装中的应用教程3.1 实验流程3.1.1 样品准备和DNA提取首先需要选择适当的样品进行研究，并进行DNA提取。
样品可以是任何含有DNA的生物样本，如细菌、植物、动物的组织或血液样本等。
3.1.2 文库构建和测序将提取到的DNA片段进行文库构建并选择合适的测序平台进行测序。
目前常用的平台包括Illumina HiSeq，Ion Torrent PGM等。
新一代基因测序技术的使用教程
新一代基因测序技术的使用教程随着科技的迅速发展，基因测序技术的更新迭代也越来越快。
新一代基因测序技术的出现，不仅提高了测序的速率和准确性，还降低了成本，使得基因测序更加广泛应用于医学、农业、环境等领域。
本文将为大家介绍新一代基因测序技术的使用教程。
基因测序是通过测定DNA或RNA序列的顺序来研究和识别基因的过程。
传统的基因测序方法主要依靠Sanger测序技术，但其速度慢、成本高、需要大量样品等缺点限制了其应用范围。
而新一代基因测序技术则实现了高通量、高效率的测序，大大提高了测序的速度和准确性。
首先，新一代基因测序技术的核心之一是通过DNA片段的大规模并行测序来实现高通量测序。
其中，常用的新一代测序技术包括Illumina测序、Ion Torrent测序、454测序等。
以Illumina测序为例，下面将为大家详细介绍其使用教程。
1. 样品准备：首先，需要从感兴趣的生物样品中提取出DNA。
可以使用常规的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒等。
2. 文库构建：接下来，需要将提取的DNA样品转化为可以进行测序的文库。
Illumina测序使用的是双链DNA文库，可以通过化学或机械方法将DNA片段连接到测序芯片上的小孔中。
在此过程中，需要根据实验要求选择合适的文库构建方法。
3. PCR扩增：为了增加测序的灵敏度和可靠性，需要对文库中的DNA片段进行扩增。
Illumina测序使用PCR扩增来增加DNA片段的数量，并添加特定序列的引物。
4. 测序芯片加载：将PCR扩增产物混合物加载到Illumina测序芯片上。
一个测序芯片通常可以容纳数百万个小孔，并且每个小孔都是一个独立进行测序的反应室。
5. 测序反应：将测序芯片放入Illumina测序仪中，通过合成反应逐个测序小孔中的DNA片段。
Illumina测序技术采用碱基加入法，逐个加入碱基，并使用荧光标记标识不同的碱基。
6. 数据分析：测序完成后，需要对所得的原始数据进行处理和分析。
新一代DNA测序技术的原理与应用
新一代DNA测序技术的原理与应用随着科学技术的不断发展和进步，人们对生物学研究的关注度越来越高，而新一代DNA测序技术的问世，也为生物学研究提供了新的方法和技术手段。
本篇文章将介绍新一代DNA测序技术的原理及其应用。
一、新一代DNA测序技术的原理DNA测序的核心原理是在DNA序列分析时，利用DNA聚合酶将单链DNA进行多轮扩增，并通过循环化学反应进行高通量读取，最终得到整个DNA序列信息。
而新一代DNA测序技术基本上是通过多段分离技术，将DNA样本拆分成成千上万的微小片段，通过高通量测序仪进行快速读取，最终拼接出完整的DNA序列。
目前常用的新一代DNA测序技术主要包括Illumina测序技术、Ion Torrent技术、Pacific Biosciences技术和Nanopore技术。
1.Illumina测序技术Illumina测序技术是目前使用最为广泛的新一代DNA测序技术之一。
它基于桥式PCR扩增和重复的循环化学反应，将单一的DNA模板扩增成可读取的簇。
通过4色荧光技术，记录DNA链的不同碱基发出的荧光信号。
最终，通过测量不同颜色的荧光信号来确定DNA序列，该技术具有高度可靠性、准确性和高效性的优点。
2.Ion Torrent技术Ion Torrent技术是一种简单易用的新一代DNA测序技术，它采用了晶体管芯片技术，可以实现快速、准确的DNA测序。
通过测量不同离子的信号变化来确定DNA序列，该技术不需要光化学反应和荧光检测，更快、更便捷，并且具有较高的可靠性和准确性。
3.Pacific Biosciences技术Pacific Biosciences技术（简称"PacBio"）通过分离技术将DNA 样本拆分成许多极小而长的DNA分子，并将其扩增；同时，利用独特的单分子实时（SMRT）测序技术进行数据采集。
SMRT技术通过DNA多次通过单分子探针，可实时记录单个DNA分子的碱基序列和修改信息。
生物信息学中的基因序列分析技术解析
生物信息学中的基因序列分析技术解析生物信息学是一门综合学科，将生物学、计算机科学和统计学等领域的知识相结合，致力于从大规模的生物学数据中提取有用的信息和知识。
基因序列分析是生物信息学中的重要研究内容之一，通过对基因组中的DNA序列进行分析，可以揭示基因的结构、功能和调控机制。
本文将对生物信息学中的基因序列分析技术进行深入解析。
一、基因序列获取在进行基因序列分析之前，首先需要获得待分析的基因序列。
目前，基因序列获取的主要方法是基于高通量测序技术的方法，如Sanger测序、二代测序和三代测序。
1. Sanger测序Sanger测序是一种经典的测序方法，基于链终止法原理。
该方法通过引入低浓度的二进制链终止剂，使DNA合成过程中的链终止在不同的碱基位置。
然后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同长度的DNA片段分离出来，并根据电泳结果确定序列。
尽管Sanger测序方法准确可靠，但速度较慢，无法满足高通量测序的需求。
2. 二代测序二代测序技术是目前广泛应用的高通量测序技术，包括 Illumina的测序技术、Ion Torrent的测序技术等。
这些技术采用了片段拼接和PCR扩增的方法，将DNA样本分割成小片段，并使用高度并行的测序反应同步测序。
这种高通量测序技术具有快速、成本低廉和数据量大等优点，为后续的基因序列分析提供了强大的数据支持。
3. 三代测序三代测序技术相比于二代测序技术具有更高的读长，能够直接测序较长的DNA分子。
代表性的三代测序技术有Pacific Biosciences （PacBio）和Oxford Nanopore Technologies（ONT）的测序技术。
这些技术主要基于单分子测序原理，通过测量单个DNA分子的链延伸或通过测量基于纳米孔的离子电流来进行测序。
三代测序技术的发展为更好地解析复杂的基因组结构和重复序列提供了可能。
二、基因序列比对基因序列比对是生物信息学中的重要任务，它主要通过将待分析的基因序列与已知参考序列进行比较，从而确定相似性和差异性。
新一代测序技术的原理
新一代测序技术的原理新一代测序技术是指相对于传统的Sanger测序技术而言的一种高通量测序技术。
其原理基于DNA链延伸的过程，通过将DNA片段或其衍生物附着到载体上，并在合适的条件下进行扩增，最终通过单个核苷酸的顺序实现对DNA序列的解码。
1.文库构建：首先，需要将待测DNA样品加工处理，得到一系列的DNA片段。
常用的加工处理方法包括PCR扩增、酶切和随机切割等。
接着，将这些DNA片段与特定的引物序列连接，构建成DNA文库。
引物序列上一般含有适配子，用来附着到测序载体上。
2.测序载体连接：将文库中的DNA片段与测序载体结合，形成连接物。
测序载体通常是一种环形DNA分子，它能够稳定地固定DNA片段，并提供特定引物的结合位点。
3.PCR扩增：通过PCR扩增，将连接后的DNA片段进行扩增。
PCR扩增是通过引物来引导DNA的多轮循环扩增，每一轮循环会合成新的DNA片段，数量呈指数级增加。
4.测序反应：扩增后的文库将被添加到测序反应体系中，这个体系中包含有可递归连接的引物、DNA聚合酶和特殊的核苷酸。
在每次扩增过程中，测序反应体系会在特定核苷酸的位置加入一个可辨识的标记物，这个标记物对应于这个特定核苷酸。
5.DNA插件固定：将反应体系中的DNA片段插入到固定基体上，可以是微流控芯片或玻璃芯片等，这些基体表面上覆盖着大量携有已知序列的DNA片段。
6.信号检测：通过特殊的仪器，检测固定基体上标记物的信号。
每个核苷酸的标记物会发出独特的信号，可以通过光学或者电子探测器来测量。
7.数据分析：得到的信号数据将用于测序结果的分析和重组。
首先，将观测到的信号序列与参考基因组或其他已知基因组进行比对，以确定DNA片段的顺序和位置。
然后，通过将不同片段的顺序重组在一起，得到完整的DNA序列。
新一代测序技术相较于传统的Sanger测序技术，具有更快的测序速度和更高的通量。
它通过并行测序和高效的数据收集，使得每次测序可以同时读取成千上万个DNA片段。
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velveth result 29 -fastq -short sequence.fastq 建立 hash 子集后用 velvetg 命令进行组装，输入./velvetg 也会出来帮助： Usage: ./velvetg directory [options] directory Standard options: -cov_cutoff <floating-point|auto> allow the system to infer it (default: no removal) -ins_length <integer> no read pairing) -read_trkg <yes|no> tracking) -min_contig_lgth <integer> (default: hash length * 2) -amos_file <yes|no> system to infer it (default: no long or paired-end read resolution) Advanced options: -ins_length2 <integer> -ins_length_long <integer> (default: no read pairing) -ins_length*_sd <integer> 10% of corresponding length) [replace '*' by nothing, '2' '_long' as necessary] -scaffolding <yes|no> on) -max_branch_length <integer> bubble (default: 0.2) -max_gap_count <integer> -min_pair_count <integer> : maximum number of gaps allowed in the alignment of : minimum number of paired end connections to justify the two branches of a bubble (default: 3) the scaffolding of two long contigs (default: 10) -max_coverage <floating point> : removal of high coverage nodes AFTER tour bus (default: no removal) -long_mult_cutoff <int> (default: 2) -unused_reads <yes|no> no) : export unused reads in UnusedReads.fa file (default: : minimum number of long reads required to merge contigs : maximum length in base pair of bubble (default: 100) -max_divergence <floating-point>: maximum divergence rate between two branches in a : scaffolding of contigs used paired end information (default: : est. standard deviation of respective dataset (default: : expected distance between two paired-end reads in the : expected distance between two long paired-end reads second short-read dataset (default: no read pairing) : export assembly to AMOS file (default: no export) -exp_cov <floating point|auto> : expected coverage of unique regions or allow the : minimum contig length exported to contigs.fa file : tracking of short read positions in assembly (default: no : expected distance between two paired end reads (default: : removal of low coverage nodes AFTER tour bus or : working directory name
新一代测序技术组装拼接软件 velvet 使用简介
目前用于新一代的测序的主要仪器有 Illumina/Solexa 的 Genome Analyzer、ABI 的 Solid 和 Roche 的 454，它们都能高通量的测序，产生大量的测序结果，接下来就要对序列进行拼接，用于拼接的软件也 有很多，比如 velvet、soap、abyss、maq 等，454 的还有专门的 newbler。平时用 velvet 比较多， 就简单介绍一下。 velvet 对短序列的拼接效果比较好，所以多用于对 Illumina 等产生的短序列片段进行组装拼接。下面以 Illumina 的 GAII 产生的结果为例进行说明。 一、单端测序 单端测序可以直接对 fastq 格式的原始文件进行处理，首先是用 velveth 命令建立 hash 表子集 输入./velveth 会出来使用帮助： Usage: ./velveth directory hash_length {[-file_format][-read_type] filename} [options] directory hash_length reduced) filename File format options: -fasta -fastq -fasta.gz -fastq.gz -eland -gerald Read type options: -short -shortPaired -short2 -shortPaired2 -long -longPaired Options: -strand_specific Output: directory/Roadmaps directory/Sequences 这一步主要是要确定使用的 hash 值，hash 值必须为奇数，且小于 MAXKMERLENGTH，这个值默认为 31，但是在安装的时候可以调整。具体的命令可以是： : for strand specific transcriptome sequencing data (default: off) : path to sequence file or – for standard input : directory name for output files : odd integer (if even, it will be decremented) <= 75 (if above, will be
Output: directory/contigs.fa directory/stats.txt coverage cutoff directory/LastGraph graph directory/velvet_asm.afg : (if requested) AMOS compatible assembly file : special formatted file with all the information on the final : fasta file of contigs longer than twice hash length : stats file (tab-spaced) useful for determining appropriate
这里主要用到的参数是-cov_cutoff（覆盖度）这个参数，其他都可不加，其实覆盖度参数也可以省略， 但是最好还是加上，增加可靠性。还有-exp_cov 这个参数加上后会对重复区域进行处理，也最好加上， 后面的数值用 auto 就可以了。其他的一些参数就根据你自己的喜好来设置。具体的命令可以是： velvetg result -cov_cutoff 30 -exp_cov auto -min_contig_lgth 100 最后根据出来的 n50 和 max contig 长度来判断拼接的效果，为了达到最好的拼接效果，一般要对 hash 值和覆盖度进行一系列的设置来进行比较。 二、双端测序 双端测序与单端测序相比在运行 velveth 时将-short 参数改为-shortPaired，其他一样。 在运行 velvetg 时可加入-ins_length 和-ins_length_sd 参数提高拼接的准确性。具体命令可以是： velvetg result -cov_cutoff 30 -ins_length 300 -ins_length_sd 100 -exp_cov auto -min_contig_lgth 100 其实运行这几个命令很简单，最重要的还是根据你的测序数据选择合适的参数。