新一代测序技术solaxe+solid+454
新一代测序法简介
新一代测序法简介新一代测序方法是一种直接测序法，它既可以分析基因和DNA的组成(定性分析)，也可以测定同一类型基因在表达过程中产生的数量（定量分析），以及不同类型基因或DNA 之间的差别所在（交叉对比分析）。
自2004年，454测序技术发展以来，已经出现的测序产品超过六种之多。
这些产品的技术特点见下表：产家名称产品技术特点优缺点化学反应测序方法误读率样品准备高通量程度Roche(454 Life Science) 焦磷酸标记的链反应焦磷酸基标记<1% 较复杂，需PCR 中等Illumina（Solexa）四色可逆终止码合成法1%—3% 较复杂，需PCR 中—高ABI(SOLID) 双色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高Helicos Bioscience 单色可逆终止码合成法2%—8% 简单，无需PCR 高—超高Intelligent Biosystm 四色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高Pacific Bioscience 四色焦磷酸基标记焦磷酸基标记3%—8% 简单，无需PCR 高VisiGen 焦磷酸基标记FRET 焦磷酸基标记3%—8% 简单，无需PCR 高在这些技术中，从所分析的样本在测序前是否需要扩增，大致可以分为两类，即克隆扩增型和单分子测序型。
两种类型在测序技术上区别并不大，但对结果的影响却有不小的差别。
主要体现在两个方面：（1）单分子测序更能反应细胞或组织内分子的真实情况，尤其是在需要定量分析的情况下。
而克隆扩增型中的PCR反应使得样品中DNA分子的扩增机会并不完全均等，这会对基因表达的定量分析造成影响；（2）单分子测序具有通量更高的优势。
克隆扩增使得同一类型的分子数目急剧上升，在提高同类型分在在固相表面出现的几率同时，也降低了不同类型分子出现的机会。
面重点介绍Pacific Biosciences公司推出的Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing（单分子实时DNA测序）。
新一代基因测序技术及其应用
新一代基因测序技术及其应用基因测序技术是指通过对生物DNA（脱氧核糖核酸）序列进行高精度测定，以获得生物基因组的完整信息，进而深入探究生物的遗传特征。
随着科技的不断发展，基因测序技术也在不断升级。
近年来，新一代基因测序技术的出现，让科学家们在基因领域的研究拥有了更加丰富和详尽的数据来源，也为生命科学的发展带来了更加广阔的前景。
新一代基因测序技术简述新一代基因测序技术（Next-generation sequencing，简称NGS）是指在短时间内快速获得大量基因序列数据的技术。
相比第一代基因测序技术，NGS具有更高的非重复区域覆盖度和更高的准确性。
它采用高通量的并行测序技术，大大缩短了基因测序时间和成本，同时也降低了测序错误率。
NGS技术包括Illumina Solexa技术、Roche 454技术、ABI SOLiD技术等，其中Illumina Solexa技术是最常用的一种。
它采用“桥式扩增”技术，即将DNA片段固定在流芯表面上，通过反复的扩增和测序，最终得到完整的DNA序列数据。
NGS技术的应用领域NGS技术可广泛应用于各个领域，例如：1.疾病诊断：基因突变是很多疾病发生的重要原因，通过NGS 技术，可以检测这些基因的序列变异，并进一步推断疾病的发生机制。
2.药物研究：NGS技术可以量化基因表达谱数据，帮助科学家们发现新的药物靶点以及研究药物如何影响基因表达，进而缩短药物研究的时间和降低成本。
3.作物育种：NGS技术可以测量作物的基因型和表型，帮助作物育种者更快速地选育高产、抗病性好的新品种。
4.环境监测：NGS技术可以检测环境中的微生物以及它们的生态系统，从而帮助保护和修复生态环境。
5.人类进化发展：NGS技术可以用于分析人类基因组的演化历程，为了解人类进化史提供基础支持。
发展前景NGS技术的出现，标志着基因测序技术的一个飞跃。
它的应用领域非常广泛，从人类健康到作物育种再到环境保护都有应用。
新一代高通量测序技术SOLiD简介
新一代高通量测序技术SOLiD简介目前市场上有四种高通量测序仪，分别是Solexa，454 (GS-FLX)，SOLiD和Polonator。
根据测序原理，它们可以被分为两大类：使用合成法测序(Sequencing by Synthesis)的Solexa和454，及使用连接法测序(Sequencing by Ligation)的Polonator和SOLiD。
这些高通量测序仪的共同点是不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增，且测序所得序列较短：其中的454序列最长，为200～300个碱基，其余三种序列都只有几十个碱基。
测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用领域。
这就要求我们在熟悉各种高通量测序仪内在技术特点的基础上进行选择。
基因组所引进的SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)是ABI（Applied Biosystems）公司生产的高通量测序仪。
目前这台SOLiD运行稳定，SOLiD实验及数据分析小组也可以为大家提供专业的技术服务。
所以接下来的关键是如何把SOLiD测序仪应用到符合其技术特点的科研项目中。
本短文将简单介绍SOLiD测序流程，双碱基编码原理及数据分析原理，以帮助大家了解SOLiD测序仪的技术特点和应用范围。
1.SOLiD关键技术及其原理SOLiD使用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。
1.1. SOLiD文库构建使用SOLiD测序时，可根据实际需要，制备片段文库(fragment library)或末端配对文库(mate-paired library)。
简单地说，制备片段文库就是在短DNA片段（60～110 bp）两端加上SOLiD 接头（P1、P2 adapter）。
454测序技术基本原理
454测序技术基本原理454测序技术是一种基于DNA串联式测序的高通量测序技术。
该技术利用PCR扩增的方式将DNA分子固定在微球上，然后将这些微球均匀地分散在pico流水仪上，通过单个核苷酸连续测序的方式得到DNA序列信息。
本文将从实验步骤、原理和优缺点三个方面阐述454测序技术的基本原理。
实验步骤1、DNA提取测序前需要从样品中提取目标DNA物质。
对于不同的样品，提取方法不同，通常采用化学试剂、机械破碎或针刺取等方法提取DNA。
2、PCR扩增PCR扩增是将DNA序列按照一定的温度循环条件进行复制的过程。
PCR扩增由若干次循环组成，通常可分为三步：a) 熔解（Denaturation）：高温（95℃~98℃）使DNA双链分离成两个单链，形成单链DNA模板。
b) 合成（Annealing）：温度回降（50℃~70℃），引物结合到单链DNA上，形成DNA 双链结构。
c) 延伸（Extension）：DNA聚合酶将双链DNA沿模板链向3'端延伸合成新的DNA链。
PCR扩增反应得到的DNA产物可分为两种类型：大量扩增的目标DNA和微球放置板上随机捕获的非模板DNA。
3、微球固定4、测序反应测序反应通过单个核苷酸的连续探测，对目标DNA序列进行识别和测序。
精细的光学和声学系统检测每次核苷酸加入后发出的光信号，然后排除错误数据并将相邻的场景、质量和信号强度合并以产生最终测序可靠的序列。
原理1、基于串联式测序在测序反应中，每个核苷酸单元依次加入为该反应产物的单一串联链的一部分。
这种串联式测序方式将初步测序的精度扩展到所有测序反应产物的终端序列。
2、基于荧光原理测序反应中每个核苷酸单元的加入和检测均通过荧光技术实现。
特殊荧光分子被加入到产物反应液中，随着核苷酸单元的加入和反应的进行，每个反应产生的荧光信号与特定的核苷酸单元有关。
3、基于高通量454测序技术结合了反应批处理和DNA克隆，大大增加了读取的序列数量。
第三代测序技术介绍
• 基因测序，硝烟再起。总部位于加利福尼 亚州卡尔斯巴德的Life Technologies公司宣 布，今年将在第一代测序仪 Personal Genome Machine的基础上推出一 款新的测序机器：Ion Proton。它是由 Life Technologies的子公司Ion Torrent研发的， 能够在一天内完成全部基因组测序，而且 所需花费不到1000美元。
3. Oxford Nanopore Technologies公司 公司
• Oxford Nanopore Technologies公司正在研究 的纳米孔单分子技术是一种基于电信号测 序的技术。他们设计了一种以α-溶血素为材 料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子 接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时， 被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和 纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响 流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的 变化幅度就成为每种碱基的特征。
2. Pacific Biosciences公司 公司
• Pacific Biosciences公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想， 以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有 很多ZMW(zero-mode waveguides)孔的厚度为100 nm的金属片。 将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的 底部，进行合成反应。与其他技术不同的是，荧光标记的位置 是磷酸基团而不是碱基。当一个dNTP被添加到合成链上的同时， 它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧 光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。此外由于dNTP在 荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）与它进入和离开的时间 （ 微秒级） 相比会很长，所以信号强度会很大。其它未参与合 成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一 个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合 物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测 区。
高通量测序技术的最新进展
高通量测序技术的最新进展高通量测序技术是生物学领域中一项革命性的技术创新。
这项技术的应用范围广泛，涉及医药、农业、环保和生物信息学等一系列领域。
在这些领域，高通量测序技术的应用可以帮助人们更好地理解和解释生命的本质，进一步探究自然界中各种生物的遗传机制和进化规律。
本文将着重介绍高通量测序技术的最新进展。
一、新一代高通量测序技术随着科技的不断进步，不同世代的高通量测序技术也不断更新迭代。
第一代高通量测序技术是由ABI公司开发的Sanger测序技术，其亚单元内核苷酸鉴定的精准度和测序长度都可以达到一定的指标要求。
不过这种技术的缺点主要是高昂的成本和高复杂度的实验流程，所以发展空间相对较小。
第二代高通量测序技术则摆脱了这个困境，常见的技术有Roche/454、Illumina、ABI/SOLiD，这些技术的优点是处理效率高，覆盖面积大，读取长度各不相同，但总体上相对第一代技术大幅度提高。
第三代高通量测序技术又一次颠覆了第二代技术的局面，它不仅提高了精度和准确度，更降低了实验成本和时间。
长读长、无准备和单分子测序是三大特征。
二、单细胞测序技术单细胞测序技术是将细胞解离后，对单个细胞进行SR（short reads）或LL（long reads）测序，并构建细胞RNA和DNA谱系关系的技术。
该技术在癌症、生殖、免疫和神经学等研究领域中具有广泛的应用前景。
现在，Broad Institute已经开发出具有30micor-meter空间分辨率，可以对大量斑点排序，在短时间内分析分辨单个细胞的测序设备。
这些设备的出现使得单细胞测序技术的广泛应用成为了可能。
三、基因组学与行为研究基因组学与行为研究是目前最为热门的研究方向之一。
在这个研究中，高通量测序技术在调查时间和遗传倾向性之间的贡献方面展示出了强大的力量。
比如，通过对子孙的基因进行快速测序，科学家可以更好的探究基因变异和突变的原因。
对于这个问题，过去往往需要100多个纯系人，经过最新技术手段的支持，甚至一对堆积来实现这种研究。
新一代测序技术的先锋--SOLiD系统
料。
探针 3’端 1～5 位:随机碱基，可以是 ATCG 中一种
1、2 位构成的碱基对：是表征探针染料类型的编码区 3～5 位的“n”表示随机碱基 6～8 位的“z”指的 是可以和任何碱基配对的特殊碱基。
测序过程
单向 SOLiD 测序包括五轮测序反应， 每轮测序反应含有多次连接反应。
(1)连接引物“n”介导，由于每个磁珠只含 有均质单链 DNA 模板，所以这次连接反应 掺入一 种 8 碱基荧光探针。 (2)SOLiD 测序仪记录下探针第 1、2 位编 码区颜色信息。
(3)化学处理断裂: 探针 3’端第 5、6 位碱基 间的化学键，并除去 6~8 位碱基及 5’末端 荧光基团，暴露探针第 5 位碱 基 5’磷酸， 为下一次连接反应作准备。
原理
几个循环之后，引物重置，开始 第二轮的测序。由于第二轮连接引物 n-1 比第一轮错开一位，所 以第二轮 得到以 0，1 位起始的若干碱基对的 颜色信息。五轮测序反应反应后，按 照第 0、1 位， 第 1、2 位... …的顺 序把对应于模板序列的颜色信息连起 来，就得到由“0，1，2，3…”组成 的 SOLiD 原始颜色序列。 。
SOLiD 工作)。
B. 乳液 PCR/微珠富集
(1)在微反应器中加入测序模板、
PCR 反应元件、微珠和引物，进行乳 液 PCR（Emulsion PCR）。 (2)PCR 完成之后，变性模板， 富集带有延伸模板的微珠，去除多余 的微珠。微珠上的模板经过 3’ 修饰， 可以与玻片共价结合。 特点:是可以形成数目庞大的独立 反应空间以进行 DNA 扩增。
新一代测序技术的先锋—SOLiD系统
刘莉莉
新一代基因测序技术原理和应用
新一代基因测序技术原理和应用基因测序技术是解读生物基因组的重要方法之一，对于深入了解生物基因的结构和功能起着至关重要的作用。
近年来，随着科学技术的不断发展，新一代基因测序技术的出现，进一步提高了测序速度与准确度，为基因研究和应用提供了更多可能性。
一、新一代基因测序技术的原理新一代基因测序技术相比传统的Sanger测序技术，采用了高通量并行测序的方法，能够在短时间内同时测定大量的DNA序列，大大提高了测序的效率和准确度。
目前，常用的新一代基因测序技术主要包括Illumina/Solexa 测序、ABI SOLiD测序、454测序和Ion Torrent测序等。
1. Illumina/Solexa测序原理Illumina/Solexa测序是目前应用最广泛的测序技术之一。
其原理主要基于DNA合成过程中的核酸链延伸和荧光信号的检测。
首先，DNA样本经过片段化处理，生成短小的DNA片段。
随后，这些片段会与具有固定引物的光纤芯片上的端子进行连接。
接下来，在PCR反应中进行扩增，生成成千上万个复制物。
之后，将芯片放入Illumina测序仪中，通过循环终止法进行测序。
在每个循环中，通过在碱基末端发行碱基的可逆终止法，每次只释放一种具有特定荧光标记的碱基，并通过激光检测其荧光信号。
最终，通过分析测序结果的荧光信号，可以获得DNA序列。
2. ABI SOLiD测序原理ABI SOLiD（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection）测序技术是一种通过链接寡核苷酸和检测碱基的方法进行测序。
其核心原理是通过两个同时存在的碱基标记对DNA进行测序。
首先，DNA片段经过端修复，再通过连接引物的方法进行适配体制备。
然后，在适配体上引入特定的引物序列，将这些标记不同的适配体引物链接到DNA片段上。
在测序过程中，利用红外线激光对适配体的碱基进行激发，并通过信号检测系统检测每个碱基的颜色和强度，进而确定序列。
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Sample Prep Sample Prepare •Genomic •mRNA •Small RNA •ChIP-Seq Cluster ClusterStation Station Genome 1G Analyzer Analyzer Analysis Pipeline
Sequencing by Synthesis Beads attached to glass surface in a random array Sequencing by synthesis Photons Generated are Captured by Camera Sequencing Image Created
0
Dye XY1 XY2 XY3 XY4 FAM AA CC GG TT
1
Cy3 AC CA GT TG
2
TXR AG GA CT TC
3
Cy5 AT TA CG GC
Sequencing Overview SOLID
A 1st Base
2nd Base C G T
Example II:
A
C
G T
Genome fragmented by nebulization No cloning; no colony picking sstDNA library created with adapters A/B fragments selected using avidin-biotin purification
•Firecrest: Image Analysis •Bustard: Basecalling •Gerald: Sequence Alignment
Sequencing Overview / Solexa
Sequencing Overview / Solexa
Sequencing Overview / Solexa
AB /SOLID Workflow
DNA Library Preparation emPCR Sequencing
DNA Library Preparation Genome fragmented by nebulization Adaptor ligation
Emulsion PCR Amplification
Flow Order 4-mer
T A C G
Measures the presence or absence of each nucleotide at any given position
3-mer
KEY (TCAG)
2-mer
1-mer
Adapted from: Roche 454 James Grabeau 2007 (/Roche%20454%20James%20Grabau%202007.ppt )
Roche /454 GS FLX Workflow
DNA Library Preparation emPCR Sequencing
DNA Library Preparation Genome fragmented by nebulization Adaptor ligation sstDNA library created with adapters A/B fragments selected using avidin-biotin purification
Sequencing Overview GS Flx (454)
5.Sequencing And Image Capture
The sequencing instrument consists of the following major subsystems: (a) a fluidic assembly ， (b) a flow chamber that includes the wellcontaining fibre-optic slide， (c) a CCD camerabased imaging assembly， and a computer that provides the necessary user interface and instrument control.
gDNA
sstDNA library
Sequencing Overview GS Flx (454)
2.Emulsion Based Clonal Amplification
Anneal sstDNA to an excess of DNA capture beads
Emulsify beads and PCR reagents in water-in-oil microreactors
Sequencing Overview / Solexa
Sequencing Overview / Solexa
Sequencing Overview / Solexa
SBS（sequencing-by-synthesis ）
Sequencing Overview / Solexa
Sequencing Overview / Solexa
Large Polystyrene Bead
P2
P1
Centrifuge using a Glycerol Gradient
Captured beads (+ templates) in supernatant
Uncaptured beads (no template) in pellet
SOLiD: 4-color, 2-base encoding
Sequencing Overview GS Flx (454)
3.Loading DNA Beads into the PicoTiter™Plate
Load beads into Pico Titer ™ Plate
Well diameter: average of 44 µm
Load Enzyme beads
P2
P1
P2 Beads with no product Beads with amplified product (~40K PCR products per bead)
Sequencing Overview SOLID
3. Enrichment
P2 enrichment oligo P1 P2
42
NTP PPi PPi + APS ATP ATP + Luciferin
Sequencing Overview GS Flx (454)
luciferase Oxyluciferin + Light
Sequencing Overview GS Flx (454)
1. DNA library preparation
2nd Base
A
C
G
T
• Detecting a single color does not indicate a base • Each reading contains information from two bases • To decode the bases you must know one of the bases in the sequence
3’ N N N G GsZ Z Z
3’ N N N G TsZ Z Z
3’ N N N C TsZ Z Z
3’ N N N C GsZ Z Z
3’ N N N T TsZ Z Z
3’ N N N T GsZ Z Z
3’ N N N T CsZ Z Z
3’ N N N G CsZ Z Z
Following base
Sequencing By Synthesis Load beads into PicoTiter™ Plate Sequencing by synthesis Photons Generated are Captured by Camera Sequencing Image Created
3’ N N N A AsZ Z Z 3’ N N N C CsZ Z Z 3’ N N N A CsZ Z Z 3’ N N N C AsZ Z Z 3’ N N N A GsZ Z Z 3’ N N N G AsZ Z Z 3’ N N N A TsZ Z Z 3’ N N N T AsZ Z Z
0 Dye XY1 XY2 FAM AA CC
1 Cy3 AC CA
2 TXR AG GA
3 Cy5 AT TA
Leading base A C G T
A
C
G
T
XY3
XY4
GG
TT
GT
TG
CT
TCLeabharlann CGGCSequencing Overview SOLID
Consequences of 2 Base Pair Encoding
454 Sequencing: BaseCalling
• Count the photons generated for each “flow” • Base call using signal thresholds • Delivery of one nucleotide per flow ensures accurate base calling
•Start Sequencing • Grow Clusters Clusters • Grow •Start Sequencing •Cluster Density • 5 hours •<30 min. hands-on •3 days single-read Evaluation •Or split process time,5 hours run •4 images per tile in stages •10 days pairedper cycle •Safe stopping end run •Run time: 2-3 points (2*75 bases) days