2005版药典药品微生物限度检查法

试验菌 实验次数 试验组 大肠杆菌 1 54 49 2 98 87 3 45 50 金黄色 1 60 58 葡萄球菌 2 50 45 3 71 73 枯草杆菌 1 49 41 2 38 42 3 74 80 白色念珠菌 1 101 90 2 79 75 3 85 83 黑曲霉 1 61 57 2 49 47 3 95 94
培养 温度
细菌为30～35℃ 霉菌及酵母菌 为23～28℃ 控制菌为35～37℃
一般供试品的检验量为10g或10ml，化学膜 剂为100cm2。贵重药品，微量包装药品的检 验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品， 其检验量应增加10g或10ml。 检验时应从2个以上最小包装单位中抽取供试 品，膜剂还不得少于4片。
菌液制备
验证方法
（1）试验组 取规定量供试液及 10~100cfu试验菌加入增菌培养基中， 依相应控制菌检查法进行检查。 如常规法取10ml供试液加1ml菌液加 入增菌培养基。 当采用薄膜过滤法时，取规定量供试 液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后 一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培 养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。 若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和 控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查； 若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释 法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法 等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑 菌活性，并重新进行方法验证。
检查法
供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。 阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时，应做 阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为 10~100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳 性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验 取稀释液10ml照相应控制菌检 查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生 长。
培养基稀释法
当供试品五种菌中有一种菌的回收率未达到 70体积内的供试品含菌量减少，至不含抑 菌作用。 一般可以0.5ml/皿，0.2 ml/皿，0.1 ml/皿
离心法
离心法有低速离心法和高速离心法 低速离心法是500转/分离心5分钟，取上清液 备用。 高速离心法是3000转/分离心20分钟，弃去上 清液，留底部集菌液约2ml用。
菌种

对试验菌种的要求同细菌、霉菌和酵母菌计数 方法的验证。 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 生孢梭菌 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙 型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养 肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培 养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。 用 0.9% 无 菌 氯 化 钠 溶 液 制 成 每 1ml 含 菌 数 为 10 ～ 100cfu的菌悬液。
非水溶性供试品
取本品10g，置输液瓶中加无菌十四烷酸异丙 脂20ml，充分振摇，使供试品溶解。 然后加45℃ pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml，充分振摇，将输液瓶倒置，静置使油 水明显分层，分别取其水层1ml加入平皿。
验证试验
一 、目的：确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性
中和法
针对品种选用特殊的中和剂或灭活剂。 中和剂或灭活剂可以加在所用的稀释液或培 养基中。
控制菌检查
控制菌检查方法的验证 当建立药品的微生物限度检查法时,应进行控 制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适 合于该药品的控制菌检查.若药品的组分或原 检验条件发生改变可能影响检验结果时,检查 方法应重新验证.
三.双黄连口服液微生物限度检查法
细菌数测定 取本品原液，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml，使分散均匀，采用薄膜过滤法，滤过，以 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（约 100ml/次，冲洗3次），测定细菌数。以金黄色葡 萄球菌[CMCC（B）26 003]为阳性对照。 霉菌及酵母菌数测定 取本品原液，按常规法测定霉菌及酵母菌数。 控制菌检查 取本品原液1ml加入100ml胆盐乳糖增菌液，按常规 法测定。
2005版药典药品微生物限度检查法
概念
微生物限度检查法系指检查非规定灭菌制剂 及其原料，辅料受微生物污染程度的方法。 检查项目包括细菌数，霉菌数及酵母菌数及 控制菌检查
环境条件
应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100 级的单项流空气区域内进行。检验全过程必 须严格遵守无菌操作，防止再污染。洁净区 域应定期进行洁净度验证。
举例
一.六味地黄丸微生物限度检查法
检验方法 取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲 液100ml，使分散均匀，作为1：10供试液； 取供试液按常规法测定细菌数、霉菌及酵母 菌数，并进行控制菌和大肠菌群检查。
方法说明 六味地黄丸处方为熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、 泽泻，均没有明显抑菌作用。验证实验中，采用常规法测定 5株验证菌株（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希 菌、白色念珠菌和黑曲霉）的回收率，均符合要求，故进行 细菌、霉菌及酵母菌计数时可采用常规法测定。对于控制菌 和大肠菌群检查，采用大肠埃希菌为对照，与不加供试液的 阳性对照比较，生长正常，故控制菌和大肠菌群检查亦可按 常规法检验。 注意事项 用于检验的供试品应按药典规定取自至少两个独立包装，取 样前混匀，供试品须经研磨、匀浆等方法尽量分散均匀。
二 、内容：细菌、霉菌及酵母菌数测定（即：对5株阳性
对照实验菌株的回收率逐一进行验证）
三 、菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
[CMCC(B)63501]、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B) 26003]、 大肠杆菌（Escherichia coli） [CMCC(F) 44102]、 白色念珠菌(Candida a lbicans )[CMCC(F ) 98001]、 黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]
薄膜过滤法
取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液,加至适 量的稀释剂中,混匀,过滤.若供试品每1g或1ml所含 的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml,过滤. 用7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲 洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同计数方法的验证 。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或 玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培 养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜.
二、非水溶性供试品（含凡士林基质 及乳膏剂）供试液制备
1、样品：红霉素软膏 2、薄膜过滤法：取供试品10g，加至20ml十四烷酸异丙酯 （必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量），充分振摇，使供 试品溶解。然后加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓 冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取后，静置使油水明显分层， 取其水层为1：10的供试液 3、取供试液1ml注入开放式滤器，用冲洗液冲洗滤膜，每 次冲洗量为100ml，消除抗菌作用后，取出滤膜贴于规定的 琼脂平板，置规定温度培养24-72小时，逐日观察结果 4、阳性对照：薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌
检验量
供试液的制备
液体供试品 固体、半固体或粘稠性供试品
取供试品10 g（10ml) ，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml,混匀，为1：10供试液，

需用特殊供试液制备方法的供试品 非水溶性供试品 膜剂供试品 肠溶及结肠溶制剂供试品 气雾剂、喷雾剂供试品
3．取经25℃ 培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3~5ml盐水
洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 取1 ml 加9 ml生理盐水，逐管 10倍稀释为10-4 ~10-6约50~100个/ ml，做活菌计数备用
常规法
(1) 试验组: 分别取1：10供试液1 ml、试验菌株1ml 同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后， 置规定温度培养24~72小时观察结果。每株试验菌平 行制备2个平皿。 (2) 活菌组 测定每一菌株的试验菌数 各取试验菌液1 ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基， 待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。每 株试验菌平行制备2个平皿。 (3) 供试液对照 测定供试品本底菌数 取1：10供试液1 ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养 基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。 细菌、霉菌及酵母菌平行制备2个平皿。
四 、方法：中国药典2005版微生物限度检查法方法验证实
验
五 、方法验证：细菌、霉菌酵母菌数测定，至少应进行3
次独立的平行实验，每次平行实验回收率逐均应在70%以上
微生物检查方法
常规法 培养基稀释法 离心沉淀集菌法 薄膜过滤法 中和法
回收率测定
1) 试验组：分别1：10供试液1 ml、50~100cfu/
ml 试 验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养 基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结 果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌
2) 活菌组：测定每一菌株加的试验菌数
3) 供试液对照：测定供试品本底菌数
4) 稀释剂对照组
稀释剂对照组
供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或 薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照 组，以考察供试液制备过程中微生物受影响 的程度。
菌液制备
1．取经37℃培养18-24小时，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、
枯草芽孢杆菌肉汤培养物1ml加9ml生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-9，为50~100个/ml，做活菌计数备用
2．取经25℃
培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物 1ml加9 ml生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-7，为50~100个/ml，做 活菌计数备用
回收率计算
样品回收率计算公式=((试验组平均菌数-供试 液对照组平均数)÷活菌组平均菌数)*100%
表1