药品微生物限度检查方法介绍
药品的微生物限度检查
24～48h
紫红胆盐葡 萄糖平板
10-1
无菌落
18～24h
有菌落
报告未检出
10g/10ml/ 100cm2供试品
3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图
以TSB为稀释液制供试液
一定量 肠道增菌肉汤
20～25℃, 2h预增菌
1ml
24～48h
紫红胆盐 葡萄糖平板
报告结果
10-1
18～24h
（六）梭菌的检查
梭菌 增菌 培养 基
供试液的制备
书写检 验记录
哥伦比亚琼脂培养基分离
1.梭菌检查程序
无菌落生长
过氧化氢 酶试验
配培养基和稀释液
最终结果判断
有 菌 落
确证 试验
10g/10ml/ 100cm2供试品
2.供试品梭菌检查操作示意图
各10ml
分别接种
一份80℃保温10min后迅速冷却
10-2
10-31ml10-110-210-3
各管加1ml
查可能菌数表
9ml 稀 释 液
有/无菌落
（二）大肠埃希菌检查
大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。
2015年版《中国药典》规定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。
TSB 增菌 培养
30℃～35℃
3～5d
1.平皿法
（1）基本程序：
数据 处理
结果观察与计数
书写检 验记录
平板 接种
需氧菌 的培养
供试液 的制备
配培养基和稀释液
倒置 培养 3～5d
30～35℃
TSA
不少于 0.1ml
微生物限度检查概述(中药制剂检验课件)
中药制剂微生物限度检查概述
二、必备知识
(一)供试品抽样、保存及检验量
供试品一般按批号随机抽样。每批取检验用量 的3倍量。每批抽样应至少含有2个以上最小包 装单位。
中药制剂微生物限度检查概述
二、必备知识
(一)供试品抽样、保存及检验量
所需样品必须保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以 防原染菌状况发生变化。
物污染程度的方法。主要包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌
数测定。药品制剂中污染活菌数量通常以每克或每毫升供试药品作 为计量单位。
基础 知识
应在不低于B级背景下的A级单向流 空气区域内进行。
检查 条件
意义
确定药物是否污染或其污染程度，控制药品的质 量。保证用药的有效性和安全性；可作为衡量药 品生产全过程卫生水平的根据之一。
中药制剂微生物限度检查概述
二、必备知识
(一)供试品抽样、保存及检验量
检验量系指每次检验所需的供试品量（g、ml或cm2）。
每种药品固体和半固体制剂的检验量为10g（大蜜丸不得少于4 丸）；液体制剂为10ml；膜剂为100cm2（不得少于4片）。
贵重药品、微量包装药品的检验量可酌减。要求检查沙门菌的 供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性 对照）。
二、必备知识
（二）供试液制备
稀释液和冲洗液
①稀释液和冲洗液0.9 ％的氯化钠水溶液 ②pH7.0氯化钠-蛋白 胨缓冲液
中药制剂微生物限度检查概述
、一般供试品（水溶性）： 或 稀释液→1:10供试液
、非水溶性供试品
或
乳化剂（司盘 、单硬脂酸甘油、聚山梨酯 ）→+
→1:10供试液
、具抑菌活性的供试品
中国药典2020微生物限度检查法
我国药典2020微生物限度检查法1.引言我国药典2020版本中，微生物限度检查法是保证药品质量和安全的重要工具。
微生物限度指的是药品中的微生物数量的限定，包括细菌、酵母和霉菌等。
微生物限度检查法的执行对于药品的生产和使用至关重要，它能够保证药品在生产、存储和使用过程中不受到微生物污染，从而确保药品的质量和安全。
2.微生物限度检查法的内容和流程微生物限度检查法主要包括取样、制备试液、接种培养和菌落计数等步骤。
首先要进行取样，从样品中取得代表性的样品；然后是制备试液，将取得的样品溶解或稀释；接下来是接种培养，将制备好的试液接种到适当的培养基上培养；最后是菌落计数，根据培养后的菌落数量来确定微生物的限度。
3.微生物限度检查法的意义微生物限度检查法的实施，可以有效地控制药品中微生物数量的合理范围内，防止药品在生产、储存和使用过程中因微生物污染而导致药品变质、降解或产生毒性。
采用微生物限度检查法，可以杜绝因微生物污染而引起的医源性感染，保障患者用药安全。
4.对我国药典2020微生物限度检查法的个人观点和理解微生物限度检查法是药品质量控制中不可或缺的一部分，它直接关系到患者的用药安全和药品的治疗效果。
我国药典2020版本对微生物限度检查法做了全面更新和完善，包括对检查方法、标准和限度值的详细规定和说明，这对于药品的生产企业和监管部门都具有重要的指导意义。
在日常生产和监管中，执行我国药典2020版的微生物限度检查法，将有助于提高药品的质量和安全水平，保护患者的用药权益，为人民健康事业做出贡献。
5.总结我国药典2020版本中的微生物限度检查法，是药品质量控制中的重要环节。
通过严格执行微生物限度检查法，可以有效地控制药品中微生物数量，防止药品因微生物污染而造成质量问题和安全隐患。
我国药典2020版的微生物限度检查法的更新和完善，将为药品生产和监管提供科学的依据和指导。
在实践中要严格执行微生物限度检查法，确保药品质量和安全，保障患者的用药权益。
微生物限度检查法 葡萄糖酸钙口服液的微生物限度检查(药品生物检定技术课件)
（七）微生物限度标准
非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药 途径和对患者健康潜在的危害以及中药的特殊性而制 订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，中药 提取物及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准 复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微 生物限度均以本标准为依据。
（二）药物制剂的微生物检查的意义
1
确定药物是 否污染或其 污染程度， 控制药品的 质量；
2
保证用药的 有效性和安 全性；
3
可作为衡量 药品生产全 过程卫生质 量的指标之 一。
（三）微生物限度检查的内容
1．微生物总数检查 包括细菌数、真菌数及酵 母菌数检查。
2．控制菌检查 包括大肠埃希菌、沙门菌、铜 绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及 梭菌的检查。
2.控制菌检查常用的培养基： 用于菌液制备的营养琼脂培养基等常规培养基 胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基等20余种用于培养 基适用性检查、方法验证试验及供试品检查的培养基。
三、菌种及培养基
白色念珠菌 玫瑰红钠琼脂培养基
大肠埃希菌 曙红亚甲蓝琼脂培养基
四、 方法的验证试验
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四、方法的验证试验
（一）细菌数、真菌数及酵母菌计 数检查
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（一）细菌、霉菌及酵母菌计数
检测的是药物在单位质量或体积内 所存在的活菌数量。可评价生产过 程中原辅料、设备、器具、工艺、 环境及操作者的卫生状况。
（一）细菌、霉菌及酵母菌计数
1．计数培养基的适用性检查
细菌、真菌及酵母菌计数用培养基应进行 培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培 养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。
微生物限度检测方法
微生物限度检测方法微生物限度检测是指在药品、食品、化妆品等产品中，对微生物的数量和种类进行检测，以确保产品的质量安全。
微生物限度检测方法的选择和执行对产品的质量控制和安全性评价具有重要意义。
本文将介绍常见的微生物限度检测方法及其应用。
一、培养法。
培养法是一种常见的微生物限度检测方法，它通过将样品接种在适当的培养基上，利用微生物在培养基上生长、分裂和形成可见的典型菌落的特性，来检测微生物的数量和种类。
培养法主要包括菌落计数法、膜过滤法等。
菌落计数法是将样品均匀涂布在含有营养物质的琼脂平板上，经过一定时间的培养后，根据菌落的数量来确定微生物的数量。
膜过滤法是将样品过滤到孔径为0.45μm的膜上，然后将膜放置在含有营养物质的琼脂平板上培养，根据在膜上形成的菌落数量来确定微生物的数量。
二、生物学法。
生物学法是利用微生物的生物学特性，通过培养微生物或者利用生物学试剂来检测微生物的数量和种类。
生物学法主要包括酶标记法、PCR法等。
酶标记法是利用酶标记的抗体或抗原来检测微生物的数量和种类，其原理是将酶标记的抗体或抗原与待检测微生物发生特异性反应，然后通过酶反应产生显色物质或荧光物质来进行检测。
PCR法是利用聚合酶链式反应技术，通过扩增微生物的特异基因序列来检测微生物的数量和种类。
三、物理化学法。
物理化学法是利用微生物的生理生化特性，通过测定微生物的生长代谢产物或者利用特定的物理化学性质来检测微生物的数量和种类。
物理化学法主要包括ATP生物发光法、流式细胞术等。
ATP生物发光法是利用微生物在生长过程中产生的ATP来进行检测，通过测定样品中的ATP含量来确定微生物的数量。
流式细胞术是利用流式细胞仪对微生物进行快速、高效的检测和鉴定，通过测定微生物在流式细胞仪中的光散射和荧光信号来确定微生物的数量和种类。
综上所述，微生物限度检测方法多种多样，每种方法都有其适用的范围和特点。
在实际应用中，需要根据产品的特点和检测的目的选择合适的检测方法，并严格按照相应的标准和规范进行执行，以确保产品的质量安全。
微生物限度检查法
无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内 ，室内光照应分布均匀，光照度不低 于300勒克斯。缓冲间和操作间均应 设置紫外线杀菌灯（２～２.5W/m3 ），紫外杀菌灯应距实验台面高度不 超过1M，并应定期检查辐射强度， 不得低于70μW.cm-2（１M距离） 。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更 换。
2.1.1.2温度、湿度 无菌室内温度 和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀 菌效果，故温度应控制在18～ 26℃，相对湿度40～60％。操作 间或净化工作台的洁净空气应保持 对环境形成正压、不低于4.9Pa。
6.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空 气过滤装置，并使其工作不低于 30min。
6.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭 紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作 鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其 他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿 戴无菌衣、帽、口罩、手套。
6.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手， 再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球 ）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开 口处周围，待干后用灭菌的手术 镊或剪将供试品启封。
一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可 由一个或多个菌细胞形成。因此供 试品中所测的菌落数实际为菌落形 成单位数（colony forming unit ，CFU），而不应理解为细菌、霉 菌、酵母菌的个数。
微生物检验项目：细菌总数测定、 霉菌与酵母菌总数测定、控制菌检验（ 包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门 菌、金黄葡萄球菌、破伤风梭菌）以及 活螨的检验。
2.1.2其他设备、净化工作台、恒温 培养箱（30～35℃）、生化培养箱 （25～28℃），微波炉（或其他适 宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆 仪（3000～8000r/min）、恒温 水浴、电热干燥箱（250～300℃） 、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器 （使用时要进行灭菌效果检查并应 定期请有关部门检定）。
微生物限度检查法标准操作规程3篇
微生物限度检查法标准操作规程第一篇：微生物限度检查法标准操作规程概述1.引言微生物限度检查法（Microbial Limit Test, MLT）是药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品产品质量控制检验的重要手段之一。
它的意义在于保证制品中微生物污染的可控性，保障产品的安全有效性。
本篇文章将围绕微生物限度检查法的标准操作规程，对其概述进行介绍。
2.主要内容2.1 微生物限度检查法的定义微生物限度检查法（Microbial Limit Test, MLT）是指对药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品产品中细菌和真菌等微生物数量进行检查的方法和标准。
它是评价产品质量与卫生安全性的重要方法。
2.2 微生物限度检查法的目的微生物限度检查法的目的在于评价药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品产品中的微生物数量是否在规定的限度范围内，以保证产品的安全性和有效性。
同时，微生物限度检查法也可为制品的生产、质量控制和质量管理提供有效依据。
2.3 微生物限度检查法的适用范围微生物限度检查法适用于药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品的质量控制检验。
其中，针对药品类，在我国《药典》中有详细规定。
3. 微生物限度检查法的标准操作规程3.1 样品处理样品处理过程应密闭、无菌且保持无菌状态。
洗手、穿戴无菌工作服及手套等工艺应符合规定，以避免二次污染。
3.2 检验方法微生物限度检查法主要分为计数法和筛选法，具体方法可根据制品的特性进行选择使用，并符合规定的国家标准。
对于细菌，常用的检验方法包括菌落计数法、薄膜过滤法等；对于真菌，常用的检验方法包括直接涂片法、薄膜过滤法等。
3.3 限度对于不同的制品，在药品中通常采用菌落计数法，在制品中微生物的限度规定一般标准分别为：细菌总数不超过10^3CFU/g或/mL，霉菌和酵母菌总数不超过10^2CFU/g或/mL。
3.4 结果判定若检测出的微生物数目符合规定限度，则判定结论为合格；若其中一个指标不符合规定，则判定为不合格。
微 生 物 限 度 检 查 法
微生物限度检验方法的发展情况
1．1980年我国药品微生物限度检验工作正式发行《药品卫生检 验方法》。 2．1984年出版第二版《药品卫生检验方法》。 3．1990.12年中检所出版第三版，主要对原《方法》中各地反 映意见较多的问题进行了改写；增加了部分检验方法和供试液 的制备方法；为了同国内外检验方法相协调，对某些内容作了 相应的更改，此外，还参照国家标准的编写格式作了编排。
恒温培养箱 霉菌培养箱 恒温水浴箱 净化工作台 30～35℃ 25～28℃ 45±1℃ 生物显微镜 1500X 36±1℃
体视显微镜或放大镜
电热干燥箱 250～300℃
电冰箱
高压蒸汽消毒器 电子天平或药物天平 匀浆仪或研钵 锥形瓶 100ml，250ml，500ml，1000ml 感量0.1g
直形吸管 量杯 试管
康氏振荡器 紫外灯 365nm
（带盖）
大、小橡皮乳头
乙醇棉球或碘伏棉球 灭菌剪刀、镊子、钢锥 灭菌称样纸 灭菌不锈钢药匙
火柴、记号笔（玻璃铅笔）
白瓷盘、洗手盆 实验记录纸
细菌、霉菌与酵母菌的检查方法
（平皿菌落计数法）
（一）供试品的抽样、保存及检验量 1． 供试品应随机抽样。一般抽样量（2个以上最小包装单位） 为检验量的3倍量。 2．对异常的供试品应针对性的抽样。抽样时，凡发现有异常或 可疑的样品， 应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的 包装不得作为样品。 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）、外观看出长螨、发 霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需在抽样检验。 不能以外观有上述情况而检查内容物合格，来判断该药品合格。 3．供试品收检后应及时检验，若有困难，应存放在该品种规定 的储存条件下（一般为阴凉干燥处），勿冷藏或冷冻，以防供试 品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。
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所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药密丸、 膜剂，需取自4丸、4片以上）。
固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。
液体制剂检验量为10ml。源自膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为50m2,化学药及 生化药膜剂检查量为10cm2。
抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问 的样品，但明显破裂的包装不得作为样品。
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4、含动物组织（包括提取物）的口服给药制 剂
5、有兼用途径的制剂 应符合各给药途径的标准
6、霉变、长螨者 以不合格论 7、原料及辅料
参照相应制剂的微生物限度标准执行
19
供试品的抽样及检验取量
一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量的3倍量 （以备复试）。贵重药品检验量可以酌减（至少要够 各种菌检查用的溶液）。
15
药品微生物限度检查方法介绍
16
2005年版微生物限度标准的应用
• 微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生 物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具、 工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学 评价的综合依据之一。
• 药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料 的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药 品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查 均以本标准为依据。
1000级 ≤350,000 ≤20,00
100000级 3,500,000 ≤20,000
GB/T16294-1996
活微生数（个）/m3
≤5 ≤100 ≤500
沉降菌 洁净级别 100级 10000级 100000级
个/（∮90mm.0.5h） ≤1 ≤3 ≤10
6
菌种保存、复壮及管理
9
菌种的复壮
分离纯化：琼脂平板分离、单细胞（菌体或孢子）的 分离
通过宿主复壮 淘汰退化 理化因素诱变
10
菌种的管理
专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌种的冰箱不得 放置食品及易挥发性试剂及有机溶媒等
定期有专人按操作规程进行传代接种 菌种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告，研
究处理。 实验菌种不得任意带出 使用致病菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处
14
菌液的制备（3）
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马 丁琼脂斜面培养基上， 23～28 ℃培 养5～7天，加3~5ml0.9％无菌氯化钠 溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 取1 ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml， 采用10倍递增稀释法，稀释至104~10-6，使细菌数约为50~100cfu/ml。
染的死角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。 人员：肥皂洗手， 0.1%新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。 操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间，
手不能来回出入操作台。 在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去空气
湿气，用紫外灯杀菌半小时。 非无菌室工作人员不得进入，对外来维修人员要进行监督。 缓冲间不得放杂物、培养箱等。 定期对门、窗、墙面等消毒。 定期检查洁净度情况。
保存原则 保存方法 复壮 管理
7
菌种的保存原则
挑选特征典型的纯菌菌落 确定保存的合适菌体形态，凡能产生孢子或芽孢的微
生物都用孢子或芽孢保存 选择最适宜的保存方法进行保存 定期对保存的菌种进行检查
8
菌种保存的常用方法
琼脂斜面低温保存法 甘油冷冻管保藏法 半固体琼脂斜面低温保存法 液体石蜡保存法 超低温保存法（菌种） 砂土
4
洁净度的要求
应在环境洁净度10000级局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必 须无菌。
工作台面及环境应定期按《医药工业洁 净室（区）悬浮粒子、浮游 菌和沉降菌的 测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
5
尘埃粒子
洁净级别
尘粒数/m3
≥0.5um ≥5um
100级
≤3,500 ≤0
• 检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及 控制菌的检 查。
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2005年版微生物限度标准的分类
1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的 制剂 应符合无菌检查法的规定。
2、口服给药制剂 3、局部给药制剂
3.1. 用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂无菌 3.2. 眼部给药制剂： 3.3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 3.4、阴道、尿道给药制剂 3.5、直肠给药制剂 3.6、其它局部给药
理
11
菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104]
生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64941]
白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F) 98001] 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003] 大肠埃希菌(Escherichia coli)) [CMCC(B) 44102] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63501]
12
菌液的制备（1）
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中， 30～35℃培养18~24小时，取此培养液 1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10 倍递增稀释法，稀释至10-5 ~10-7，使细 菌数约为10~100cfu/ml。
13
菌液的制备（2）
接种白色念珠菌的新鲜培养物至改 良马丁培养基中， 23～28 ℃培养 18~24小时，取此培养物1ml加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增 稀释法，稀释至10-5 ~10-7，使细菌 数约为50~100cfu/ml。
药品的卫生学检查方法介绍
（北京市药品检验所 戴红）
1
无菌室的质量管理 药品的微生物限度检查 药品的无菌检查
2
无菌室的要求
位置选择 面积大小 洁净度 采光 紫外杀菌 门 人流物流 地面墙面
3
无菌室的管理
陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备 无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污