土壤微生物生物量碳测定方法

土壤微生物生物量的测定方法

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

土壤微生物生物量碳测定方法

土壤微生物生物量碳测定方法一、呼吸法通过测定土壤中微生物呼吸释放的CO2量来间接估算土壤微生物生物量碳。

该方法的原理基于微生物在代谢过程中产生的CO2量与其生物量碳之间的正相关关系。

常用的测定方法包括静态方法和动态方法。

1.静态方法：在采样后立即封闭土壤样品容器，然后测定一定时间内容器内CO2的累积释放量，并利用其中一种模型计算微生物生物量碳。

例如，利用静态方法可以测定土壤有机碳浓度和总CO2浓度，通过两者的比值计算微生物生物量碳。

2.动态方法：将土壤样品装入氧气通气的大容器中，测定一定时间内容器中CO2的连续释放量，并通过外推法计算微生物生物量碳。

例如，可以通过监测土壤样品容器中CO2的连续释放曲线，然后利用微生物呼吸速率和微生物生物量碳之间的关系计算微生物生物量碳。

二、估算法利用土壤中微生物生物量碳与其中一种土壤性质之间的相关性来估算土壤微生物生物量碳。

常用的估算法包括土壤学习法、土壤酶学法和土壤微生物生态法。

1.土壤学习法：根据不同土壤类型的土壤微生物生物量碳数据进行学习建模，然后根据土壤性质数据进行预测。

常用的学习方法包括主成分分析、判别分析和回归分析等。

2.土壤酶学法：通过测定土壤中一些酶活性与微生物生物量碳之间的相关性来预测微生物生物量碳。

常用的酶活性指标包括脲酶、蔗糖酶和脱氢气酶等。

3.土壤微生物生态法：通过测定土壤微生物多样性和群落结构与微生物生物量碳之间的相关性来估算微生物生物量碳。

常用的方法包括16SrRNA和ITS基因测序、脂肪酸指纹技术和磷脂脂肪酸分析等。

三、标记法通过标记的同位素技术测定土壤微生物生物量碳。

其中，最常用的标记同位素是^13C和^14C。

通过给土壤样品添加同位素标记物并追踪其在土壤中的分布和转化，可以计算微生物生物量碳。

总结起来，土壤微生物生物量碳的测定方法主要包括呼吸法、估算法和标记法等。

不同的方法适用于不同的土壤类型和测定目的，综合运用多种方法可以更准确地评估土壤微生物生物量碳。

土壤微生物量碳测定方法

土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomasS不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。

近40 年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。

由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳（Microbial biomass carbon, Be来表示土壤微生物生物量的大小。

测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigatio n-i ncubatio n. Fl）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。

熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加-1入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。

Voro ney（1983）发现熏蒸土壤用0.5mol LK2SO4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。

Vanee等（1987）建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol L-1K2SO4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数KEC取值0.38）来计算土壤微生物碳。

Wu 等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。

该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。

林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。

对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数KEC的取值，有很多研究进行了大量的14研究。

测定KEC值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。

生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)

一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。

将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。

注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。

硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。

六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。

过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。

磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。

2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。

土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物量碳测定方法

土壤微生物量碳测定方法：1、试剂配制：1、0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶液于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加热）定容至1 L。

2、去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。

再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次，将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。

3、0.8000 mol.L-1 1/6 K2Cr2O7 标准溶液；称取39.2245g重铬酸钾（K2Cr2O7分纯）加400 ml蒸馏水加热溶解，冷却定容1L4、02 mol.L-1 FeSO4 溶液，56.0g硫酸亚铁【FeSO1.7H2O】溶解蒸馏水中，加15ml浓硫酸，用蒸馏水定容至1L5、邻啡罗啉指示剂：1.485g邻啡罗啉（C2H8N2.H2O）及0.695g硫酸亚铁（FeSO4.7H2O）溶于100ml 蒸馏水，形成红棕色络合物【（FeC12H8.N2）8 2+】,贮存于棕色瓶中2、试验步骤：1、制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%的水在25℃下培养7~15d【day】，取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，精制5分钟，再抽滤5分钟，同样操作重复三次。

干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。

按照土：0.5M K2SO4=1:4（烘干土算，一般就是湿土；0.5M K2SO4=1:2），加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。

微生物量碳的测定方法

氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳一、采样与样品预处理土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。

采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。

如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。

过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。

预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。

土壤田间持水量采用改进的Shaw（1958）方法测定。

在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗用玻璃纤维堵塞。

取50.00 g土壤于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50 ml水，保持30 min，再打开夹子使多余的水流入量筒，30 min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量，用烘干土壤质量表示。

——林启美老师文件内容二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE）1、方法原理土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。

通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。

浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定，也可用微量碳分析仪测定。

此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。

2、仪器及设备培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。

3、试剂1.无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[ϕ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。

再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。

得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。

（试剂浓硫酸ϕ(H2SO4)=95~98% ，稀释19倍）2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1]: 称取硫酸钾（K2SO4,化学纯）87.10g，加热溶于去离子水中，稀释至1L。

土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。