微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。
将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。
注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。
六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。
过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。
磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。
邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。
2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。
首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。
另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。
其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。
浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。
熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。
微生物量碳、氮的转换系数为0.45。
土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。
土壤微生物量碳测定方法
土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳( Soil microbial biomass )不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分(如氮、磷和硫等)的保持和释放及其植物有效性。
近40 年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。
由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc) 来表示土壤微生物生物量的大小。
测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法 (Fumigation-incubation, FI )和熏蒸提取法( Fumigation-extraction, FE )。
熏蒸提取法(FE法)由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。
Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol • L-1K2SQ提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。
Vance 等(1987) 建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol ・L-1&SQ提取剂(水土比1: 4)直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数K EC(取值0.38)来计算土壤微生物碳。
Wu等( 1990)通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取一一碳自动一起法测定土壤微生物碳。
该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。
林启美等(1999)对熏蒸提取- 重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。
对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC的取值，有很多研究进行了大量的研究。
测定K EC值的实验方法有：直接法(加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物)和间接法(与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较)。
微生物量碳氮测定方法
微生物量碳氮测定（赵宁宁版）氯仿熏蒸提取法CFE（Chloroform fumigations extractions-Method）Literature:Brookes PC, Landman A, Pruden G, Jenkinson DS (1985). Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: Arapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil. Soil Biology & Biochemistry 17: 837-842.试剂处理：1.氯仿必须是除去乙醇的，乙醇除去方法是先加入约200l的氯仿至1L的分液漏斗中，然后用5% v/v H2SO4溶液20ml洗涤两次，每次手摇动2-3min左右。
之后在用蒸馏水洗涤2-3次，然后加入5g左右的无水硫酸镁或者无水氯化钙干燥，最后使用旋转蒸发仪蒸馏。
2.沸石处理：玻璃珠事先用丙酮洗净，然后在105度下烘干。
使用清洗烘干后的玻璃珠，否则氯仿有可能不会沸腾。
上述处理均在通风橱里操作。
3.检查真空干燥器的气密性，事先使用真空泵抽取真空，待一天后轻微打开干燥器的开关，听到是否有呲呲的声音。
若是气密性不好，使用少些凡士林密封。
步骤：1.鲜土样过2mm筛子后，在40C冷藏室贮藏。
2.在熏蒸提取之前，测定土壤重量含水量，之后用蒸馏水调节土壤水分含量至统一（一般是调节到土壤的最大持水量或者调节至土壤样品中含水量最高值），这是为了保证熏蒸效果一致。
3.称取15g新鲜土样到50ml的小烧杯中（标签要用铅笔记录）。
4.将氯仿，真空干燥器事先放入通风橱中（氯仿有毒），在真空干燥器底部放入平底100ml或者200ml烧杯，烧杯中加入用丙酮洗净烘干的玻璃珠至小半杯即可，然后加入处理完毕的氯仿至2/3左右。
生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。
将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。
注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。
六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。
过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。
磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。
邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。
2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。
首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样 6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。
另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。
其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。
浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。
熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。
微生物量碳、氮的转换系数为0.45。
土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。
生物量碳氮测定方法
生物量碳氮测定方法
熏蒸提取法首先需要标定氯仿和浓硝酸的用量。
氯仿用于提取生物样品中的有机碳，而硝酸用于氧化有机物质并释放出氮。
实验过程中，首先将称量好的生物样品放入一个带有砂浴和回流装置的烧瓶中，并加入适量的硝酸和氯仿。
然后，用火焰加热烧瓶，使溶液进行蒸发和浓缩。
随着溶液的蒸发，有机物质被转化为气体，并被冷凝在装有冷冻剂的收集瓶中。
在冷凝过程中，氯仿中的有机碳会沉积在冷凝瓶底部。
完成冷凝后，将氯仿从冷凝瓶中转移到预先称量的烧瓶中，然后再进行蒸发和浓缩，直到氯仿蒸发殆尽。
最后，将烧瓶中残余的有机物质转移到燃烧船中，放入燃烧炉中进行燃烧。
燃烧后，生成的CO2和N2通过吸收器中的饱和硫酸被捕获，并被转移到室外的装有碱液的收集瓶中。
碱液中的CO2被氢氧化钠中和，并转化为氢氧化钠。
通过在吸收瓶中加入酚酞指示剂，可以测定CO2的体积。
测定氮的过程与测定碳类似，只是在蒸发过程中释放的气体被洗涤瓶中的含硼酸溶液捕集。
然后将含硼酸溶液转移至定容瓶中，用碱液进行中和，再用氯化亚铁标准溶液滴定，从而可以测定氮的含量。
通过测定生物样品中CO2和N2的体积，以及标定剂量和无机碳和氮的含量，可以计算出生物样品中的有机碳和氮的含量。
总的来说，熏蒸提取法是一种通过加热蒸发和燃烧的方法，将生物样品中的有机物质转化为气体或溶液，并通过捕集和测定气体体积的方式，来测定生物体内的碳和氮含量。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。
配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。
待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。
（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。
（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。
要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。
（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。
值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。
（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。
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二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法
1．主题内容与适用范围
本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。
2．方法提要
土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K2SO4溶液浸提，提取液一部分用K2CrO7（重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H2SO4消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。
3．提取液的制备
3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量：
0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C
的冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜
3.2试剂的制备：0.5 M K2SO4溶液（化学纯）、
无醇氯仿（提纯方法：用1N H2SO4溶液与氯仿(CHCl3三氯甲烷)按体积
比2:1于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与
氯仿2:1混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，
加一勺无水硫酸钠，保存）
3.3分析步骤：
3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。
在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。
放入装土的
大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。
包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。
到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。
另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。
3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。
用注射器注入每瓶50ml 0.5M K2SO4溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。
如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。
4．生物量碳的测定—K2CrO7氧化法
4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电
炉两个、变压器两个、滴定管（25ml）
4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K2CrO7标准溶
液
邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K2CrO7溶液（19.6125g/L，分析纯）
0.02M (NH4)2Fe(SO4)2溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫
酸（98%，分析纯）酸化，而后定容至1L、
4.3分析步骤：
4.3.1吸取2ml 0.4 N K2CrO7溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的玻璃球（约一小药匙，10个）。
吸取步骤（3.2.2）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多。