土壤微生物量氮的测定方法

ICS13.080.30
B10
团体标准
T/NAIA0001—2020土壤微生物量氮的测定
2020-XX-XX发布2020-XX-XX实施宁夏化学分析测试协会发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》规定编写。

本标准由宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）提出。

本标准由宁夏化学分析测试协会归口。

本标准起草单位：宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）、宁夏大学、宁夏农林科学院荒漠所、宁夏化学分析测试协会。

本标准主要起草人：王京、白玲、任亚丽、马晓瑞、刘鸿翔、刘辉、俞鸿千、张小飞、刘娜娜。

本标准于2020年XX月XX日首次发布。

土壤微生物量氮的测定
1范围
本标准规定了土壤微生物量氮的测定方法。

本标准适用于各类土壤微生物量氮的测定。

2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不住日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 601化学试剂标准滴定溶液的制备
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 1121.1土壤检测第一部分：土壤样品的采集、处理和贮存
3原理
新鲜土样经氯仿熏蒸24h 后，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物量氮，用硫酸钾溶液提取微生物量氮，测定提取液中氮含量，根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤氮含量的差值及转换系数，计算土壤微生物量氮。

4试剂和溶液
除非另有说明外，本方法均使用符合国家标准的分析纯试剂，分析用水为GB/T 6682规定的三级水。

4.1氯仿（CHCl 3）。

4.1.1去乙醇氯仿制备
市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前须将乙醇去除。

方法是量取适量的氯仿和二级水按1:2的比例置入分液漏斗中，充分震摇1min 并静置分层后，慢慢放出底层氯仿于干燥的烧杯中，重复洗涤3次，得到无乙醇氯仿，向其中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在4℃、黑暗条件下保存。

注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。

4.2氢氧化钠（NaOH）。

4.3硫酸钾（K 2SO 4）。

4.4硫酸铜（CuSO 4）。

4.5硼酸（H 3BO 3）。

4.6浓硫酸（H 2SO 4）。

4.7甲基红指示剂（C 15H 15N 3O 2）。

4.8溴甲酚绿指示剂（C 21H 14BrO 5S）。

4.9氢氧化钠溶液（1mol/L）
称取40g （精确至0.01g ）氢氧化钠用水溶解，定容至1000mL 。

4.10硫酸钾浸提剂（0.5mol/L）
称取174.26g （精确至0.01g ）硫酸钾，用研钵磨成粉末，倒于2.5L 塑料桶中，加水2L ，盖紧螺旋盖置于摇床（150r/min ）至完全溶解。

4.11氢氧化钠溶液（400g/L）
称取400g （精确至0.01g ）氢氧化钠加水溶解，定容至1L 。

4.12硼酸溶液（20g/L）
称取20g （精确至0.01g ）硼酸加水溶解，定容至1L 。

4.13硫酸标准溶液（0.02mol/L）
准确移取5.56mL 浓硫酸缓缓注入800mL 水中，用水定容至1000mL ，配制成浓度为0.1mol/L 的硫酸标准溶液，按照GB/T 601对其进行标定。

将此溶液用水稀释5倍得到0.02mol/L 的硫酸标准溶液。

4.14指示剂
称取0.1g（精确至0.0001g ）甲基红和0.5g（精确至0.0001g ）溴甲酚绿指示剂放入玛瑙研钵中，加入100mL 95%乙醇研磨溶解。

5仪器设备
5.1电子天平：感量0.0001g 和0.01g。

5.2真空泵。

5.3恒温培养箱（25℃±1℃）。

5.4凯氏定氮仪。

5.5摇床（25℃，150r/min，300r/min）。

6测量步骤
6.1土壤前处理
新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土壤中可见植物残体(如根、茎和叶)及土壤动物(如蚯蚓等)，过2mm 孔径筛并混匀。

如果土壤过湿，应在室内适当风干，并经常翻动，以避免局部干燥，至土壤含水量约为田间持水量的40%（以手感湿润疏松但不结块为宜）。

如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节含水量至田间持水量的40%。

将土壌置于密封的塑料桶内，在25℃±1℃下预培养7-15d。

桶内有适量水以保证相对湿度
为100%，并在桶内放一小烧杯1mol/LNaOH 溶液以吸收土壌呼吸产生的CO 2。

这些过程是
为了消除土壤水分限制对微生物的影响以及植物残体对测定的干扰。

经预培养的土壤应立即分析，否则，应置于4℃下保存，且分析前需在上述条件下至少再培养24h。

6.2熏蒸
称取经前处理相当干50g（精确至0.01g）烘干基的新鲜土壤3份，置于100mL 烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2~3个，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm 大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯1mol/LNaOH 溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO 2，干燥
器底部还应加入少量水以保持湿度，用真空泵抽真空，在-0.07MPa 真空度下使氯仿剧烈沸腾3~5min。

关闭真空干燥器阀门，于25℃±1℃黑暗条件下熏蒸24h。

打开干燥器阀门时，由于空气进入应该能听见有明显嘶嘶的声音，否则，意味着抽真空不够或漏气，应重新进行熏蒸。

取出土壤和氯仿（氯仿倒回贮存瓶，可再使用），将装土壤的烧杯转入清洁真空干燥器中，反复抽真空（-0.07Ma）直到土壌无氯仿味为止，否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。

一般需要反复抽真空5~6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器，以加快去氯仿速度和效果。

在熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为对照土壤。

6.3浸提
将熏蒸后的土壤无损转移到200mL 聚乙烯塑料瓶中，加入100mL 0.5mol/L 硫酸钾浸提剂（4.10），使土水比为1:2（土壤为质量单位g，浸提液为体积单位mL），振荡（25℃，300r/min）浸提30min，用中速定量滤纸过滤于100mL 塑料瓶中。

另称取等量的3份对照土壤于200mL 聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100mL 0.5mol/L 硫酸钾浸提剂（4.10）同上浸提。

同时做3个不加土壤的试剂空白，过滤后的浸提液应立即分析，或在-18℃下保存。

6.4消化
取10.0mL 浸提液（解冻的浸提液在取样前应彻底混匀）于250mL 消化管中，加入0.100g 硫酸铜，5mL 浓硫酸，于电炉上消化，混合液消化变清后再回流3h。

6.5测定
按说明书检查凯氏定氮仪，空蒸15min 洗管道。

消化结束后，冷却，接在蒸馏装置上。

将一三角瓶接在冷凝管的下端，并使冷凝管浸在三角瓶的液面下，三角瓶内盛有25mL 20g/L 硼酸吸收液（4.12）和指示剂（4.14）3滴。

然后向消化管缓缓加入35mL 400g/L 氢氧化钠溶液（4.11），蒸馏5min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管的下端（洗入三角瓶中）。

用0.02mol/L 硫酸标准液（4.13）滴定，溶液由蓝色变为酒红色时即为终点。

记下消耗标准硫酸溶液的毫升数。

7结果计算样品中氮含量以克每千克（g/kg）表示，按式（1）计算：
2011001000014.0)(V f m c V V N ⨯⨯⨯⨯⨯-=)
1(⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
式中：
N样品中氮的含量，单位为克每千克（g/kg）；
滴定样品时消耗硫酸标准溶液的毫升数，单位为毫升（mL）；
V
1
滴定空白时消耗硫酸标准溶液的毫升数，单位为毫升（mL）；
V
C硫酸标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（moL/L）；
0.014氮原子的毫摩尔质量，单位为克每毫摩尔（g/mmol）；
M称取试样的质量，单位为克（g）；
F土壤水分系数；
用于测定的浸提液体积，单位为毫升（mL）。

V
2
土壤微生物量氮，按式（2）计算：
=)2(⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
Bc÷
Ec
k
式中：
Bc样品中微生物量氮的含量，单位为克每千克（g/kg）；
Ec熏蒸土壤浸提测定的氮含量－不熏蒸土壤浸提测定的氮含量，单位为克每千克（g/kg）；
K转换系数，取值0.45。

结果保留三位有效数字。

8精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。