土壤微生物量测定方法
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。
土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法常规培养法是最早也是最常用的土壤微生物量测定方法之一、该方法是将土壤样品经过稀释后接种到含有特定培养基的培养皿中，经过一段时间的培养，根据培养皿上的菌落数量计算土壤中微生物的数量。
常用的培养基有营养琼脂培养基、土壤细菌培养基和土壤真菌培养基等。
常规培养法的优点是简单易行，可以同时测定不同类型微生物的数量，但该方法有一些局限性，如只能测定能够在培养基上生长的微生物，不能测定需异养条件才能生长的微生物，而且该方法容易低估土壤中微生物的真实数量。
生物量测定法是一种利用土壤微生物的生物学过程测定微生物量的方法。
该方法一般分为碳饥饿法和氮饥饿法两种。
碳饥饿法是将土壤样品暴露在低碳条件下（如0.01%葡萄糖溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
氮饥饿法是将土壤样品暴露在低氮条件下（如0.01%硝酸铵溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
这两种方法都是利用微生物的生物学特性，通过测定微生物对不同养分的响应来估计微生物的数量。
生物量测定法的优点是准确度较高，可以测定土壤中广泛类型的微生物，但该方法也有一些局限性，如需要较长的试验周期，测定过程中需要严格控制温度、湿度等环境条件，且操作较为繁琐。
生物学特征法是一种通过测定土壤微生物的生物学特征来评估微生物群体数量的方法。
该方法常用的特征包括土壤酶活性、呼吸作用速率、微生物生长速率和微生物群体的磷脂脂肪酸组成等。
这些特征的测定可以通过色谱、酶反应和分子生物学技术等手段进行。
生物学特征法的优点是操作简便，消耗土壤样品较少，时间短，结果可靠。
但该方法也有一些问题，如不同微生物对环境的响应不同，结果受环境因素影响较大。
综上所述，土壤微生物量的测定方法有常规培养法、生物量测定法和生物学特征法等。
不同的测定方法各有优缺点，使用时可以根据具体的研究目的和所需数据的准确度进行选择。
此外，单一的方法往往无法全面准确地评估土壤微生物量，因此常采用多种方法综合分析，以得到更准确的结果。
土壤微生物数量测定方法
土壤微生物数量测定方法土壤微生物是指生活在土壤中的微小生物，包括细菌、真菌、放线菌、古菌等。
土壤微生物在土壤的生物地球化学循环、有机质分解、养分转换和植物健康等过程中起着重要的作用。
因此，对土壤微生物数量的准确测定具有重要意义。
本文将介绍一些常用的土壤微生物数量测定方法。
1.瓶培法：将适量的土壤样品与适量的培养基混合，在37°C下培养约24小时，然后通过平板计数法或最凼稀释法进行测定。
2.膜过滤法：将土壤提取液通过特定孔径的膜过滤器滤过，然后将膜放置在培养基上进行细菌的生长，最后进行计数。
3.间接法：通过测定土壤样品的可培养细菌指标，如氧化还原酶、脱氢酶等的活性，从而推算出土壤中的细菌数量。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的细菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行细菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的真菌，通过计数来估算真菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使真菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌数量测定相似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行真菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的真菌基因，如18SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行真菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的放线菌，通过计数来估算放线菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使放线菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌和真菌数量测定类似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行放线菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的放线菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行放线菌数量的测定。
通过上述方法测定土壤中微生物的数量，可以了解土壤微生物对土壤生态系统功能的影响，并为土壤质量评价和科学合理利用提供依据。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定方法
目前常用的土壤微生物测定方法主要包括直接计数法、培养法、DNA
分析法和生化方法等。
1.直接计数法：直接计数法是指通过显微镜观察和计数土壤中微生物
的数量。
这种方法简单直观，可以快速测定土壤中微生物的数量。
但是，
由于土壤微生物数量庞大，直接计数方法需要大量的样品和时间，且对操
作者的要求较高。
2.培养法：培养法是指通过将土壤样品接种在富含营养物质的培养基上，并在一定温度和湿度下培养一段时间，通过观察和计数可见的菌落来
测定土壤中微生物的数量和种类。
这种方法可以有效地测定土壤中常见的
细菌和真菌等，但是对于无法培养的微生物种类相对有限。
3.DNA分析法：DNA分析法是指通过提取土壤中微生物的DNA，并通
过PCR扩增和DNA测序等技术来测定土壤中微生物的种类和多样性。
这种
方法可以检测到所有存在的微生物，无论是否可以培养。
因此，DNA分析
法可以更全面地测定土壤中微生物的多样性和种类。
但是，这种方法对实
验条件和技术要求较高。
4.生化方法：生化方法是指通过测定土壤中微生物代谢产物的含量或
活性来测定土壤中微生物的数量。
例如，通过测定脲酶、葡萄糖酶、氧化
还原酶等土壤微生物常见的酶活性来评估微生物的活性和数量。
生化方法
可以快速测定土壤微生物的数量和活性，但是受土壤理化性质的影响较大。
总之，以上所述的方法各有优缺点，可以根据实际情况选择合适的方
法或多种方法相结合来测定土壤微生物的数量和多样性。
此外，测定方法
的选择还要考虑实验所需的样品数量、可行性和经济性等因素。
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1.直接计数法：直接计数法是通过显微镜观察土壤样品中微生物数量来测定土壤微生物生物量。
常用的直接计数法包括滴定法、薄层计数法和电镜计数法。
滴定法是将土壤样品溶解后，通过滴定法来计数微生物细胞的数量。
滴定法主要包括用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为参比菌，将细菌与土壤样品混合，经一系列稀释后进行滴定。
通过观察滴定液中菌落的数量，可以推算出原始土壤样品中微生物的生物量。
薄层计数法是将土壤样品制成薄层，然后在显微镜下进行计数。
这种方法可以直接观察微生物的形态特征，通过计算单位面积上微生物的数量来估算微生物生物量。
电镜计数法是利用电镜的高分辨率特性，观察土壤样品中微生物的形态和数量。
这种方法可以观察到更小的微生物和微生物的形态细节，但是操作复杂，成本较高。
2.间接测定法：间接测定法通过测定土壤中微生物活性代谢产物来估算微生物生物量。
常用的间接测定法包括ATP测定法、细胞膜脂肪酸测定法和氮素代谢产物测定法等。
ATP测定法是通过测定土壤中的三磷酸腺苷(ATP)含量来估算微生物生物量。
微生物的ATP含量与其生物量有一定的关系，因此可以通过测定ATP含量来间接估算土壤微生物生物量。
细胞膜脂肪酸测定法是通过测定土壤样品中微生物细胞膜中的脂肪酸含量来估算微生物生物量。
微生物细胞膜中的脂肪酸种类和含量与微生物群落的组成和数量有关，因此可以通过测定脂肪酸的含量来间接估算微生物生物量。
氮素代谢产物测定法是通过测定土壤样品中微生物氮素代谢产物的含量来估算微生物生物量。
微生物的氮素代谢活动与其生物量有关，因此可以通过测定氮素代谢产物的含量来间接估算微生物生物量。
3.分子生物学方法：分子生物学方法是利用PCR技术对土壤样品中微生物的DNA或RNA进行扩增和测定来估算微生物生物量。
常用的分子生物学方法包括引物扩增法、荧光原位杂交法和高通量测序法等。
引物扩增法是通过设计特定的引物对微生物的DNA或RNA进行扩增，并通过PCR反应的产物数量来估算微生物生物量。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。
配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。
待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。
（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。
（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。
要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。
（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。
值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。
（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。
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土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。
配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。
待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。
（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。
（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。
要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。
)（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。
值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。
（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。
（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。
2、仪器设备碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。
3、操作步骤;（1）土样前处理新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。
如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。
如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。
将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。
经过预培养的土壤应立即分析。
如需保留，应放置于4℃的冷藏箱中，下次使用前需要在上述条件下至少培养24 h。
这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响，以及植物残体对测定的干扰。
土壤饱和持水量按Shaw（1958）的方法测定：在圆型漏斗下端装一带夹子的橡皮管，漏斗内塞玻璃纤维。
取50 g土壤于漏斗中，夹紧橡皮管，加入50 ml水保持30 min。
然后打开夹子，测定30 min内流出的水量。
加入的水量减去流出的水量，再加上原来土壤中含有的水量，即为该土壤的饱和持水量，以烘干土壤质量百分数表示。
（2）熏蒸称取经前处理后相当于20.0 g烘干基重的新鲜土壤(25.0g)3份于50 ml烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3个，烧杯内放入少量经浓硫酸处理洗涤后烘干的瓷片（0.5 mm大小，防瀑沸），干燥器底部加入少量水以保持湿度。
用土壤熏蒸抽真空装置抽真空，在– MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3～5 min。
关闭真空干燥器阀门，移置25℃黑暗条件下熏蒸24 h。
将熏蒸过的土壤转移到另一个干净的真空干燥器中，反复抽真空（– MPa）6次，每次3 min，彻底除去土壤中的氯仿，直到无氯仿味为止。
否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。
熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加入去乙醇氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为“对照”土壤。
（3）提取@将熏蒸土壤无损地转移到125 ml聚乙烯提取瓶中，加入80 ml mol L-1K2SO4，土水比为1 : 4（w : v），振荡（25℃，300 r min-1）浸提30 min，用中速定量滤纸过滤于125 ml塑料瓶中。
在熏蒸开始的同时，另称取等量的3份不熏蒸土壤于125 ml聚乙烯提取瓶中，加入80 ml mol L-1K2SO4同上浸提。
同时做3个不加土壤的试剂空白。
浸提液应立即分析，或在–18℃下保存。
要注意的是低温（–18℃）下保存的土壤浸提液解冻后会出现一些白色沉淀，据推测为CaSO4和K2SO4，对浸提液中有机碳测定没有影响，可不必除去这些白色沉淀（Brookes等，1985），但解冻后也应立即测定，且在取样前应将浸提液彻底混匀。
（4）测定取10 ml土壤提取液于40 ml样品瓶中（注意解冻的浸提液在取样前应彻底混匀），加入10 ml六偏磷酸钠溶液（pH ），使提取液中的沉淀（CaSO4和K2SO4）全部溶解。
采用Phoenix 8000碳–自动分析仪测定样液中的有机碳含量。
先采用2 mm细管向样液中通入高纯度氮气5～10 min，先除去溶解在样液中的部分CO2，样液再进入无机碳排除管进一步排除残留的CO2。
再进入紫外氧化室，在过硫酸钾溶液和磷酸溶液作用下样液中的有机碳全部氧化为CO2，产生的CO2经纯化后再通过红外检测器测定。
详细操作步骤参见仪器使用说明。
标准碳工作曲线：分别吸取0、、、、、ml浓度为1000 mg C L-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100 ml容量瓶中，用高纯度去离子水定容。
即得到0、20、40、60、80、100 mg C L-1系列标准碳溶液。
分别吸取上述不同浓度度的标准碳溶液10 ml于40 ml样品瓶中，按上述相同方法测定。
（5）结果计算：.土壤微生物量碳：B C = E C / k EC式中：E C = 熏蒸土壤提取的有机碳–不熏蒸土壤提取的有机碳k EC为转换系数，取值。
二、土壤微生物生物量氮（氯仿熏蒸－K2SO4提取-流动注射氮分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：同上（2）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：同上（3）硫酸铬钾还原剂：称取50.0 g分析纯硫酸铬钾[KGr?SO4?2]，溶于200 ml分析纯浓硫酸，用蒸馏水稀释到1 L。
？（4）硫酸铜溶液[c（CuSO4）= mol L-1]：称取30.324 g分析纯硫酸铜（CuSO4）溶于蒸馏水并定容至1 L。
（5）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 10 mol L-1]：称取400 g分析纯氢氧化钠溶于蒸馏水并定容至1 L。
（6）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 4 mol L-1]：称取160 g分析纯氢氧化钠溶于双蒸水并定容至1 L，使用前用真空抽滤瓶（膜孔径μm）过滤。
（7）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= mol L-1]：取ml 4 mol L-1 NaOH用去离子水稀释至1 L。
（8）硼酸溶液（ρ（H3BO4）= 2 g 100 ml-1）：称取20.0 g分析纯硼酸（H3BO4）溶于蒸馏水定容至1 L。
（9）硫酸溶液[c（H2SO4）= mol L-1]：取ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ= 1.84 g ml-1）用蒸馏水稀释到1 L，此溶液H2SO4浓度为mol L-1，将该溶液稀释10倍即可得到mol L-1硫酸溶液。
再用mol L-1标准硼砂溶液标定其准确浓度。
（10）标准硼砂溶液[c（Na2B4O7?10H2O）= mol L-1]：先将分析纯硼砂（Na2B4O7 ?10H2O）在55℃蒸馏水中重结晶，过滤后得到的结晶放入装有食糖和氯化钠饱和溶液烧杯的干燥器中（相对湿度70%）干燥。
准确称取经重结晶和干燥的硼砂38.13672 g，溶解于蒸馏水并定容至1 L。
（11）指示剂贮存液：称取1.0 g氨混合指示剂溶解于10 ml mol L-1 NaOH和10 ml 95%乙醇混合液中，用去离子水定容至200 ml。
该贮存液可存放1个月。
~（12）指示剂溶液：取10 ml指示剂贮存液用去离子水稀释并定容至500 ml，用真空抽滤瓶（膜孔径μm）过滤。
注意：此溶液应使用前一天配制，最多可使用1周。
（13）标准氯化铵贮存液[ρ（NH4Cl）= 1000 μg N ml-1]：称取经105℃烘2～3小时的分析纯氯化铵3.8190 g溶于去离子水中并定容至1 L。
此贮存液可稳定保存数月。
（14）标准氯化铵溶液[ρ（NH4Cl）= 50 μg N ml-1]：取10 ml 1000 μg N ml-1氯化铵用去离子水稀释至200 ml。
此溶液最多保存7 d。
2、仪器设备流动注射氮分析仪（FIAStar 5000，丹麦福斯公司）、真空抽滤瓶（膜孔径μm）、容量瓶（100 ml）、其他仪器设备同上。
3、操作步骤\（1）土壤前处理、熏蒸、提取同上。
（2）提取液中硝态氮还原：吸取ml熏蒸与不熏蒸土壤mol L-1 K2SO4浸提液于250 ml消化管中，加入10 ml硫酸铬钾还原剂和300 mg锌粉，至少放置2 h后再消化。
研究结果表明熏蒸与不熏蒸土壤提取液中硝态氮含量差异很小，在测定土壤MB-N时，可以不包括硝态氮，即省略提取液中硝态氮还原过程。
（3）消化：方法Ⅰ：吸取ml熏蒸与不熏蒸土壤mol L-1 K2SO4浸提液（或经还原反应后的浸提液）于250 ml消化管中，加入ml mol L-1 CuSO4溶液、5 ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物（如经浓硫酸处理并洗涤后烘干的瓷片，0.5 cm大小），混合液消化变清后再回流3 h。
（4）消化液中氮测定：消化液冷却后，用去离子水洗涤转移到100 ml容量瓶中，至体积大约为70 ml，待再冷却后慢慢加入10 ml 10 mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀（以免因局部碱浓度过高而引起消化液中NH4+的损失），再用去离子水定容至100 ml。