土壤微生物数量测定方法整理
土壤微生物生物量碳测定方法
土壤微生物生物量碳测定方法一、呼吸法通过测定土壤中微生物呼吸释放的CO2量来间接估算土壤微生物生物量碳。
该方法的原理基于微生物在代谢过程中产生的CO2量与其生物量碳之间的正相关关系。
常用的测定方法包括静态方法和动态方法。
1.静态方法：在采样后立即封闭土壤样品容器，然后测定一定时间内容器内CO2的累积释放量，并利用其中一种模型计算微生物生物量碳。
例如，利用静态方法可以测定土壤有机碳浓度和总CO2浓度，通过两者的比值计算微生物生物量碳。
2.动态方法：将土壤样品装入氧气通气的大容器中，测定一定时间内容器中CO2的连续释放量，并通过外推法计算微生物生物量碳。
例如，可以通过监测土壤样品容器中CO2的连续释放曲线，然后利用微生物呼吸速率和微生物生物量碳之间的关系计算微生物生物量碳。
二、估算法利用土壤中微生物生物量碳与其中一种土壤性质之间的相关性来估算土壤微生物生物量碳。
常用的估算法包括土壤学习法、土壤酶学法和土壤微生物生态法。
1.土壤学习法：根据不同土壤类型的土壤微生物生物量碳数据进行学习建模，然后根据土壤性质数据进行预测。
常用的学习方法包括主成分分析、判别分析和回归分析等。
2.土壤酶学法：通过测定土壤中一些酶活性与微生物生物量碳之间的相关性来预测微生物生物量碳。
常用的酶活性指标包括脲酶、蔗糖酶和脱氢气酶等。
3.土壤微生物生态法：通过测定土壤微生物多样性和群落结构与微生物生物量碳之间的相关性来估算微生物生物量碳。
常用的方法包括16SrRNA和ITS基因测序、脂肪酸指纹技术和磷脂脂肪酸分析等。
三、标记法通过标记的同位素技术测定土壤微生物生物量碳。
其中，最常用的标记同位素是^13C和^14C。
通过给土壤样品添加同位素标记物并追踪其在土壤中的分布和转化，可以计算微生物生物量碳。
总结起来，土壤微生物生物量碳的测定方法主要包括呼吸法、估算法和标记法等。
不同的方法适用于不同的土壤类型和测定目的，综合运用多种方法可以更准确地评估土壤微生物生物量碳。
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。
土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。
因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。
这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。
稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。
最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。
根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。
1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。
按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。
凝固后的培养基可加热溶解后使用。
二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
三、操作步骤（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法常规培养法是最早也是最常用的土壤微生物量测定方法之一、该方法是将土壤样品经过稀释后接种到含有特定培养基的培养皿中，经过一段时间的培养，根据培养皿上的菌落数量计算土壤中微生物的数量。
常用的培养基有营养琼脂培养基、土壤细菌培养基和土壤真菌培养基等。
常规培养法的优点是简单易行，可以同时测定不同类型微生物的数量，但该方法有一些局限性，如只能测定能够在培养基上生长的微生物，不能测定需异养条件才能生长的微生物，而且该方法容易低估土壤中微生物的真实数量。
生物量测定法是一种利用土壤微生物的生物学过程测定微生物量的方法。
该方法一般分为碳饥饿法和氮饥饿法两种。
碳饥饿法是将土壤样品暴露在低碳条件下（如0.01%葡萄糖溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
氮饥饿法是将土壤样品暴露在低氮条件下（如0.01%硝酸铵溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
这两种方法都是利用微生物的生物学特性，通过测定微生物对不同养分的响应来估计微生物的数量。
生物量测定法的优点是准确度较高，可以测定土壤中广泛类型的微生物，但该方法也有一些局限性，如需要较长的试验周期，测定过程中需要严格控制温度、湿度等环境条件，且操作较为繁琐。
生物学特征法是一种通过测定土壤微生物的生物学特征来评估微生物群体数量的方法。
该方法常用的特征包括土壤酶活性、呼吸作用速率、微生物生长速率和微生物群体的磷脂脂肪酸组成等。
这些特征的测定可以通过色谱、酶反应和分子生物学技术等手段进行。
生物学特征法的优点是操作简便，消耗土壤样品较少，时间短，结果可靠。
但该方法也有一些问题，如不同微生物对环境的响应不同，结果受环境因素影响较大。
综上所述，土壤微生物量的测定方法有常规培养法、生物量测定法和生物学特征法等。
不同的测定方法各有优缺点，使用时可以根据具体的研究目的和所需数据的准确度进行选择。
此外，单一的方法往往无法全面准确地评估土壤微生物量，因此常采用多种方法综合分析，以得到更准确的结果。
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。
土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。
因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。
这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。
稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。
最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。
根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。
1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。
按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。
凝固后的培养基可加热溶解后使用。
二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。
土壤微生物数量测定方法
土壤微生物数量测定方法土壤微生物是指生活在土壤中的微小生物，包括细菌、真菌、放线菌、古菌等。
土壤微生物在土壤的生物地球化学循环、有机质分解、养分转换和植物健康等过程中起着重要的作用。
因此，对土壤微生物数量的准确测定具有重要意义。
本文将介绍一些常用的土壤微生物数量测定方法。
1.瓶培法：将适量的土壤样品与适量的培养基混合，在37°C下培养约24小时，然后通过平板计数法或最凼稀释法进行测定。
2.膜过滤法：将土壤提取液通过特定孔径的膜过滤器滤过，然后将膜放置在培养基上进行细菌的生长，最后进行计数。
3.间接法：通过测定土壤样品的可培养细菌指标，如氧化还原酶、脱氢酶等的活性，从而推算出土壤中的细菌数量。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的细菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行细菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的真菌，通过计数来估算真菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使真菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌数量测定相似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行真菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的真菌基因，如18SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行真菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的放线菌，通过计数来估算放线菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使放线菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌和真菌数量测定类似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行放线菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的放线菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行放线菌数量的测定。
通过上述方法测定土壤中微生物的数量，可以了解土壤微生物对土壤生态系统功能的影响，并为土壤质量评价和科学合理利用提供依据。
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定方法
目前常用的土壤微生物测定方法主要包括直接计数法、培养法、DNA
分析法和生化方法等。
1.直接计数法：直接计数法是指通过显微镜观察和计数土壤中微生物
的数量。
这种方法简单直观，可以快速测定土壤中微生物的数量。
但是，
由于土壤微生物数量庞大，直接计数方法需要大量的样品和时间，且对操
作者的要求较高。
2.培养法：培养法是指通过将土壤样品接种在富含营养物质的培养基上，并在一定温度和湿度下培养一段时间，通过观察和计数可见的菌落来
测定土壤中微生物的数量和种类。
这种方法可以有效地测定土壤中常见的
细菌和真菌等，但是对于无法培养的微生物种类相对有限。
3.DNA分析法：DNA分析法是指通过提取土壤中微生物的DNA，并通
过PCR扩增和DNA测序等技术来测定土壤中微生物的种类和多样性。
这种
方法可以检测到所有存在的微生物，无论是否可以培养。
因此，DNA分析
法可以更全面地测定土壤中微生物的多样性和种类。
但是，这种方法对实
验条件和技术要求较高。
4.生化方法：生化方法是指通过测定土壤中微生物代谢产物的含量或
活性来测定土壤中微生物的数量。
例如，通过测定脲酶、葡萄糖酶、氧化
还原酶等土壤微生物常见的酶活性来评估微生物的活性和数量。
生化方法
可以快速测定土壤微生物的数量和活性，但是受土壤理化性质的影响较大。
总之，以上所述的方法各有优缺点，可以根据实际情况选择合适的方
法或多种方法相结合来测定土壤微生物的数量和多样性。
此外，测定方法
的选择还要考虑实验所需的样品数量、可行性和经济性等因素。
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1.直接计数法：直接计数法是通过显微镜观察土壤样品中微生物数量来测定土壤微生物生物量。
常用的直接计数法包括滴定法、薄层计数法和电镜计数法。
滴定法是将土壤样品溶解后，通过滴定法来计数微生物细胞的数量。
滴定法主要包括用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为参比菌，将细菌与土壤样品混合，经一系列稀释后进行滴定。
通过观察滴定液中菌落的数量，可以推算出原始土壤样品中微生物的生物量。
薄层计数法是将土壤样品制成薄层，然后在显微镜下进行计数。
这种方法可以直接观察微生物的形态特征，通过计算单位面积上微生物的数量来估算微生物生物量。
电镜计数法是利用电镜的高分辨率特性，观察土壤样品中微生物的形态和数量。
这种方法可以观察到更小的微生物和微生物的形态细节，但是操作复杂，成本较高。
2.间接测定法：间接测定法通过测定土壤中微生物活性代谢产物来估算微生物生物量。
常用的间接测定法包括ATP测定法、细胞膜脂肪酸测定法和氮素代谢产物测定法等。
ATP测定法是通过测定土壤中的三磷酸腺苷(ATP)含量来估算微生物生物量。
微生物的ATP含量与其生物量有一定的关系，因此可以通过测定ATP含量来间接估算土壤微生物生物量。
细胞膜脂肪酸测定法是通过测定土壤样品中微生物细胞膜中的脂肪酸含量来估算微生物生物量。
微生物细胞膜中的脂肪酸种类和含量与微生物群落的组成和数量有关，因此可以通过测定脂肪酸的含量来间接估算微生物生物量。
氮素代谢产物测定法是通过测定土壤样品中微生物氮素代谢产物的含量来估算微生物生物量。
微生物的氮素代谢活动与其生物量有关，因此可以通过测定氮素代谢产物的含量来间接估算微生物生物量。
3.分子生物学方法：分子生物学方法是利用PCR技术对土壤样品中微生物的DNA或RNA进行扩增和测定来估算微生物生物量。
常用的分子生物学方法包括引物扩增法、荧光原位杂交法和高通量测序法等。
引物扩增法是通过设计特定的引物对微生物的DNA或RNA进行扩增，并通过PCR反应的产物数量来估算微生物生物量。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。
配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。
待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。
（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。
（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。
要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。
（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。
值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。
（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。
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土壤微生物的分离鉴定及数量测定（一）培养基的制备Ⅰ测定微生物总量培养基：1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）牛肉膏Beefextract 5.0g蛋白胨Peptone 10.0gNaCI 5.0g蒸馏水H20 1000m1琼脂15～20gPH 7.2~7.4制备步骤：⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解.⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌.⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL.⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。
一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。
⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。
注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。
如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。
，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。
⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min.2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基）可溶性淀粉20gKNO3 1gK2HPO40.5gMgSO4• 7H2O 0.5gNaCl 0.5g原0.05gFeSO4• 7H2O 0.01gpH 7.2-7.4制备步骤：（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。
（2）称量准确称量各种成分。
（3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。
（4）分装、包扎、灭菌。
注：各成分按配方顺序依次溶解，对于微量成分，可预先配成高浓度的溶液，方便配置时量的控制。
配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH。
另：倒平板之前，在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液，每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL(l00ppm)。
3. 真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基）葡萄糖10.0gMgSO4.7H2O 0.5g蛋白胨 5.0g孟加拉红33.4mg （或者每升加1%溶液3.3mL）K2HPO41g蒸馏水H20 1000m1PH 自然(4-5)制备步骤：（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。
（2）称量和熔化按培养基配方，准确称取各成分，并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中待各成分完全溶化后，边加边搅拌, 以防糊底,补足水分到所需体积。
再将孟加拉红配成1%的溶液，在1000ml培养液中加入1%的孟加拉红溶液3.3ml，混匀后，加入琼脂加热溶化。
(3) 分装、加塞、包扎、灭菌。
(4) 链霉素的加入由于链霉素受热易分解，所以临用时将培养基溶化后待温度降低至45摄氏度左右时才能加入。
注：⑴灭菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加链霉素。
⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培养基加0.lmL。
Ⅱ测定功能菌所用培养基：1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A）(NH4)2SO4 2.0gNaH2PO40.25gMnSO4·4H2O 0.01gMgSO4·7H2O 0.03gK2HPO40.75gCaCO3 5.0g蒸馏水1000mlPH 7.2注：CaCO3最后加，不需要溶解，直接调PH，培养基中有这个成分是为了缓冲pH。
因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，所以要碱性物质平衡酸碱。
下同。
2.硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基B）NaH2PO40.25gK2HPO40.75gMgSO4·7H2O 0.03gMnSO4·4H2O 0.01gCaCO3 1.0gNa2CO3 1.0gNaNO2 1.0g蒸馏水1000mlPH 7.23. 反硝化细菌培养基柠檬酸钠 5.0 gKNO3 2.0 gKH2PO4 1.0 g,K2HPO4 1.0 gMgSO4·7H2O 0.2 g蒸馏水1000 mlpH值7.2~7.54.好气性自生固氮菌培养基（改良阿须贝(Ashby)无氮培养基）苯甲酸钠 1.5 gK2HPO4 0.2 gMgSO4·7H2O 0.2 gNaCl 0.2 gCaSO4·2H2O 0.1 gPH 7.4—7.6注：在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，要露出液面。
5.氨氧化细菌培养基（蛋白胨氨化培养基）K2HPO4 0.5 gKH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g蛋白胨 5.0 g蒸馏水1000mlPH 7.0~7.26. 好气性纤维素分解菌培养基（依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基）KH2PO4 1.0 gFeCl3·6 H2O 0.1 gMgSO4·7H2O 0.3 gCaCl2·6H2O 0.1 gNaCl 0. 1 gNaNO3 2.5 gpH 7.2～7．4注：在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，需露出液面。
(二)试剂的配制1.格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液：第一液：将0.5g的对氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
第二液：将0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
2. 纳氏试剂甲液：将20.0g碘化汞和10.0g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
乙液：将20.0g氢氧化钾溶于100ml水中。
分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，放置2天后使用。
保存于棕色瓶中。
取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。
3.二苯胺试剂：溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水中，然后徐徐加入100ml浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。
（三）实验器材1.仪器设备4℃冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。
2.器材准备⑴将90ml水装入250ml三角瓶中，并装有15-20个玻璃珠，灭菌。
⑵将9ml水装入试管，灭菌。
⑶试管架，1ml无菌吸管，记号笔，白瓷比色板，接种环，酒精灯等。
（四）实验方法1.样品采集在靠近植株根系部, 去除表层0-5cm的表土，采集5-20 cm土壤剖面,多点采集, 混匀后四分法取1 kg, 装无菌塑料袋带回，4℃冰箱保存。
2.悬液制备称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。
此为10-1土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。
以此类推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的土壤悬液。
3.土壤悬液稀释度选择⑴细菌:10-4~10-6⑵放线菌：10-3~10-5⑶真菌：10-2~10-4以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。
⑷亚硝酸细菌：10-3~10-6⑸硝酸细菌：10-3~10-6⑹反硝化细菌：10-4~10-7⑺好气性自生固氮菌：10-3~10-6⑻氨氧化细菌：10-5~10-8⑼好气性纤维素分解菌：10-2~10-5以上采用最大或然法（MPN），分别设置四个浓度梯度，三次重复。
4.接种(平板接种技术)平板接种是用接种环将菌种接至平板培养基上,或用移液管,滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上,然后进行培养.其目的是进行菌落形态观察,分离纯化菌种,活菌计数,或进行其它试验.其方法有多种,根据实验的目的要求不同,可分以下几种.①斜面菌种接至平板划线法:按无菌操作的方法自斜面用接种环直接取少量菌体,在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线,注意不要划破培养基.或先制成菌悬液,接种在平板边缘的一处,将接种环灼烧灭菌,再从有菌的部位如上方法划线接种.点接法:一般用于霉菌菌落观察的接种.无菌操作下,用接种针从斜面或孢子悬液中取少量孢子,轻轻点接在平板培养基上,点接的部位和点接的次数根据实验目的与要求确定.②菌悬液接至平板涂抹法:用灭菌的移液管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板上,然后用无菌的玻璃涂棒将菌液均匀涂布在整个平板上.混菌法:先将菌液加入培养皿中,然后加入融化并冷却至45～50℃的固体培养基,轻轻摇匀,平置,待完全凝固后倒置培养.③平板菌种接至斜面此法一般是将分离培养得到的单菌落,在无菌操作下分别接种到斜面培养基上,以便进一步扩大培养或作保存之用.接种之前先选好平板上的单菌落,并做好标记.左手拿平板,右手拿接种环,在火焰上方或火焰旁边操作,灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却,以免将菌种烫死,然后挑取菌落,在火焰旁边稍等片刻,此时左手将平板放下,拿起斜面培养基,按斜面接种的方法接种.5.培养将所有试管和平板置于25-28℃黑暗条件下避光培养。
培养时间由短到长分别为：⑴真菌：2～3d；⑵细菌：3～4d；⑶放线菌：5～7d。
⑷氨氧化细菌：7～8d；⑸好气性自生固氮菌：7～8d；⑹亚硝酸细菌：10～14d；⑺硝酸细菌：10～14d；⑻反硝化细菌：10～14d；⑼好气性纤维素分解菌：10～14d；6.结果观察⑴亚硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。
⑵硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。
此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。
⑶反硝化细菌：加入格利斯亚硝酸试剂，观察颜色变化，确定正负反应。
⑷好气性自生固氮菌：观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成，或有无圆晕混浊出现。