临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验-荧光免疫技术 复习资料汇编

临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验-荧光免疫技术复习资料汇编一、概述荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光。

（一）荧光荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光。

荧光物质（二）其他荧光物质铕（Eu3＋）为三价稀土镧系元素，其螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。

二、荧光抗体技术荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位。

荧光抗体技术包括荧光抗体制备、标本制作、荧光抗体染色和荧光显微镜检查等内容。

（一）荧光抗体的制备1.抗体要求：用于标记的抗体应该具有高特异性和高亲和力。

2.荧光素要求：①与蛋白质结合后不易解离，而未结合者易于清除；②荧光效率高；③荧光色泽与背景组织对比鲜明；④不影响蛋白质原有的生化与免疫性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

3.抗体的荧光素标记：搅拌法和透析法。

4.荧光素标记抗体的纯化：去除未结合的游离的荧光素。

可采用透析法或层析分离法。

5.荧光抗体的鉴定：荧光素与蛋白质的结合比率（组织切片的荧光抗体染色以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色以F/P＝2.4为宜）、抗体效价、抗体特异性。

6.荧光抗体的保存：小量分装，-20℃冻存可保存1～2年。

真空干燥后可长期保存。

稀释后的抗体不宜长时间保存，在4℃可保存1～3天。

（二）标本的制作临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。

制作标本要力求保持抗原的完整性、切片要求尽量薄、干扰物质要充分洗去、安全。

（三）荧光抗体染色与结果判断1.直接法用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。

本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。

2.间接法可用于检测抗原和抗体。

本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。

本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。

3.双标记法本法用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。

在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。

4.荧光抗体染色结果判断每次实验时均需设立严格的实验对照（阳性和阴性对照）。

阳性细胞的显色分布有胞质型、胞核型和膜表面型三种类型，显色深浅可作为抗原定性、定位和定量的依据。

5.荧光显微镜荧光显微镜能发射出一定波长的激发光对待测样本进行激发，使之产生一定波长的发射荧光，从而对组织细胞的结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

荧光显微镜与普通光学显微镜主要结构基本相同，不同之处在于光源、滤光片、聚光器和消色差镜头等。

三、荧光免疫分析的类型常用的荧光免疫分析测定方法主要有流式细胞分析技术、时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定和荧光酶免疫测定等。

（一）时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）用镧系元素（Eu3+）标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

1.时间分辨：非特异性荧光寿命较短（1～10ns），最长不超过20ns。

而镧系元素螯合物的荧光寿命较长（10～1000μs）。

2.Stokes位移：激发光谱和发射光谱的波长之差很大（273nm），故极易将激发光和发射光分开。

3.发射光谱和激发光谱：镧系元素发射光谱带较窄，多在613nm±10nm。

利用615nm±5nm的滤光片只允许此波段的荧光通过，以供测量，排除了其余波长的荧光，且能量损失也不大。

4.信号增强：免疫反应完成后，加入酸性增强液，Eu3＋从复合物上完全解离下来，被另一种螯合剂所螯合，形成一个新的具有高强度荧光的稳定螯合物，信号的增强效果可达上百万倍。

（二）标记物和标记方法Eu3＋最为常用。

Eu3＋不能直接与抗原或抗体结合，需应用具有双功能基团的螯合剂，其一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成镧系元素离子一螯合剂一抗原（或抗体）复合物。

（三）方法类型1.双抗体夹心法：双抗体夹心法待检抗原与固相抗体结合，再与Eu3+标记抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-Eu3+标记抗体复合物，在酸性增强液作用下，复合物上的Eu3+从免疫复合物中解离，形成新的微粒，在340nm激发光照射下，游离出的Eu3+螯合物可发射613nm的荧光。

经时间分辨荧光分析仪记录计算出待检抗原的含量。

2.固相抗体竞争法：待检抗原和Eu3＋标记的抗原与固相抗体发生竞争结合。

3.固相抗原竞争法：待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3＋标记抗体。

4.方法评价：时间分辨荧光免疫测定灵敏度高；分析范围宽；标记结合物稳定，有效使用期长；测量快速，易自动化；无放射性污染。

（四）荧光偏振免疫测定当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方向的平面光，称之为偏振光。

荧光物质经单一平面的偏振光（蓝光，485nm）激发后，可吸收光能并发射出相应的偏振荧光（绿光，525～550nm），偏振荧光有很强的方向性。

1.Ag F分子小，转动速度快，偏振荧光弱2.Ag F-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强3.待检抗原含量与偏振荧光强度成反比4.方法评价：荧光偏振免疫测定样品用量少；荧光素标记结合物稳定，使用寿命长；方法重复性好；快速，易自动化；试剂盒专属性强，适于检测小分子和中等分子物质，不适宜测定大分子物质。

（五）荧光酶免疫测定某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。

标记酶底物荧光产物激发光（nm）荧光（nm）碱性磷酸酶4-MUP 4-MU 360 450（蓝）β-半乳糖苷酶4-MUG 4-MU 360 450辣根过氧化物酶HPA 二聚体317 414（紫）注：4-MUP（4-甲基伞酮磷酸盐）；4-MUG（4-甲基伞酮-β-半乳糖苷）；4-MU（4-甲基伞酮）；HPA（对羟基苯丙酸）1.方法类型：（1）双抗体夹心法：固相抗体-待测抗原-酶标记抗体；（2）双抗原夹心法：固相抗原-待测抗体-酶标记抗原；（3）固相抗原竞争法：待测抗原+固相抗原+定量酶标记抗体；2.方法评价：（1）荧光酶免疫测定由于使用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，故灵敏度大大提高。

（2）背景荧光会干扰测定，用固相荧光酶免疫测定法效果好。

四、荧光免疫技术在医学检验中的应用（一）荧光抗体技术的应用1.自身抗体检测，辅助诊断自身免疫性疾病。

2.病原体检测，用于疾病诊断、流行病学调查和临床回顾诊断。

3.免疫病理检测，用于组织中抗原、抗体的鉴定。

4.细胞表面抗原和受体检测。

荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析。

在这种分析法中检测仪器不是荧光显微镜，检测对象不是固定了的标本，而是将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射后发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。

（二）荧光免疫测定的应用1.时间分辨荧光免疫测定应用范围十分广泛，包括蛋白质、激素、药物、肿瘤标志物、病原体抗原/抗体等；2.荧光偏振免疫测定特别适用于血清或尿液中小分子物质的测定；3.荧光酶免疫测定可用于多种抗原抗体的检测。

【习题】1.目前使用最广泛的荧光色素为A.FITCB.RB200C.TRITCD.R-REE.Eu3+『正确答案』A『答案解析』目前使用最广泛的荧光色素为FITC。

2.RB200产生的荧光色泽为A.橘红色B.黄绿色C.蓝紫色D.天青色E.褐黑色『正确答案』A『答案解析』RB200产生的荧光色泽为橘红色。

3.荧光抗体间接法可检测A.抗原B.抗体C.补体D.蛋白质E.抗原和抗体『正确答案』E『答案解析』荧光抗体间接法可检测抗原和抗体。

4.主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术A.荧光偏振免疫测定B.荧光免疫显微技术C.时间分辨荧光免疫测定D.底物标记荧光免疫测定E.流式荧光免疫技术『正确答案』C『答案解析』时间分辨荧光免疫测定主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原。

5.最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质A.异硫氰酸荧光素B.四乙基罗丹明C.四甲基异硫氰酸罗丹明D.藻红蛋白E.镧系稀土元素（Eu）『正确答案』E『答案解析』最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质是镧系稀土元素（Eu）。

6.关于直接法荧光抗体染色的特点，错误的是A.简单易行，特异性高B.敏感度偏低C.非特异性荧光染色因素少D.可检测抗原及抗体E.每检测一种抗原需制备一种相应的荧光抗体『正确答案』D『答案解析』间接法可以用于检测抗原和抗体，不是直接法。