人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导

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有限稀释法分离纯化人牙周膜干细胞的实验研究

有限稀释法分离纯化人牙周膜干细胞的实验研究目的体外分离培养人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）并进行鉴定。

方法采用有限稀释法分离和纯化PDLSCs并通过克隆形成及多向分化实验，鉴定所得细胞的增殖和分化能力。

结果分离纯化所得细胞均为长梭形或者不规则形，克隆细胞呈旋涡状集落生长趋势，体外诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞分化，具有干细胞增殖和多向分化的特性。

结论有限稀释法分离纯化的PDLSCs具有间充质干细胞的表型及增殖和多向分化的生物学特性。

Abstract：Objective To isolate and culture the human periodontal ligament stem cells（PDLSCs）in vitro and to identify them.Methods PDLSCs were isolated and purified by limiting dilution method.The proliferation and differentiation ability of the obtained cells were identified by clonal formation and multidirectional differentiation experiments.Results The purified cells were fusiform or irregular in shape，cell clone was spiral colony growth trend under induction to osteoblasts，adipocytes，with characteristics of proliferation and multi cell differentiation.Conclusion PDLSCs isolated and purified by limited dilution method have the phenotype of mesenchymal stem cells and the biological characteristics of proliferation and multi-directional differentiation.Key words：Finite dilution method；Human periodontal ligament stem cells；Clonal formation；Induction differentiation牙周病是一种慢性炎症骨吸收疾病，是造成成年人牙齿丧失最主要的原因[1-2]。

人牙周膜干细胞的生物学活性研究

现代检验医学杂志
第２８卷
第３期
２０１３年５月
ＪＭｏｄＬａｂＭｅｄ，Ｖｏｌ，２８，Ｎｏ．３，Ｍａｙ．２０１３
２７
人牙周膜干细胞的生物学活性研究
石建峰，毕文超。，张晨，饶国洲，李昂（１．西安交通大学口腔医院，西安７１０００４；
阴性，波形蛋白和ＣＤ４４阳性表达；流式细胞仪结果显示ＰＤＬＳＣｓ表面高表达ＣＤ２９（９２．４７），ＣＤ４４（９６．４２）和ＣＤ１０５
（９６．４０％）；ＣＤ３４，ＣＤ４５和ＨＬＡ－ＤＲ阴性表达；诱导成骨结果显示ＰＤＬＳＣｓ有较强的成骨活性，茜素红染色诱导组有明显
ＳＨＩＪｉａｎ－ｆｅｎｇ，ＢＩＷｅｎ－ｃｈａｏ０，ＺＨＡＮＧＣｈｅｎ，ＲＡ０Ｇｕｏ — ｚｈｏｕ，ＬＩＡｎｇ
（１．ｔｈｅＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｉ＂ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ ’ ａｎ７１０００４，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＸｉａｎ

炎性牙周组织中牙周膜干细胞的分离、鉴定和体内外评估

炎性牙周组织中牙周膜干细胞的分离、鉴定和体内外评估唐哲（摘译）;于金华（校）
【期刊名称】《口腔生物医学》
【年(卷),期】2011(2)4
【摘要】从健康的牙周膜（PDL）中能够分离出间质干细胞（MSC），而本研究是从感染的PDL组织中分离和鉴定人牙周膜干细胞（hPDLSCs），并评估其再生潜能。

方法：从骨内缺损的皮瓣手术中获得炎性PDL，从中分离出感染的人牙周膜干细胞（ihPDLSCs），从因正畸需要拔除的牙齿获取健康的人牙周膜干细胞，【总页数】1页(P198-198)
【关键词】牙周膜干细胞;牙周组织;鉴定人;分离;炎性;评估;体内外;间质干细胞【作者】唐哲（摘译）;于金华（校）
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】R781.4
【相关文献】
1.大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞的分离与表型鉴定 [J], 钟隆飞;李巧星;许立军;王伟录;单玉喜
2.同一个体来源正常与炎性牙周膜干细胞生物学性能的比较 [J], 张琳琳;毕春升;陈发明;金岩
3.人牙体组织及牙周组织干细胞分离、培养、鉴定的研究进展 [J], 郭俊
4.大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞的分离及鉴定 [J], 许立军;钟隆飞;单玉喜;薛波新;陈岽
5.人牙体组织及牙周组织干细胞分离、培养、鉴定的研究进展 [J], 郭俊（综述）;杨健（审校）
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人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究

人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究毛丽霞;刘加强;赵晶蕾;王洁;夏韫晖;王博;袁玲君;房兵【摘要】目的：探讨人牙髓干细胞在体外成骨向分化潜能。

方法：用免疫磁珠法分选人牙髓干细胞并检测其干细胞表面标志物Stro-1、 CD29、 CD34、 CD44、CD45、 CD90、 CD105的表达。

体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化，通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性和矿化结节形成情况，通过real-time PCR分析成骨相关基因ALP、col I、RunX2、OC的表达，未成骨诱导细胞作为对照。

结果：人牙髓干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物Stro-1、 CD29、 CD44、 CD90、 CD105，阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。

成骨诱导5d、7d、14d ALP染色阳性，21d茜素红染色仅诱导组可见明显钙结节形成，对照组为阴性。

成骨相关基因ALP、RunX2和Col I mRNA在成骨诱导早期高表达，OC mRNA在成骨诱导14d表达开始逐渐升高。

结论：经磁珠分选纯化的人牙髓干细胞在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化，形成钙盐沉积和矿化结节， ALP、col I、RunX2、OC参与了成骨向分化的过程。

%Objective:To investigate the capability of human dental pulp stem cells (hDPSCs) on osteogenic differentia-tion in vitro.Methods:hDPSCs were purified by magnetic-activated cell sorting with Stro-1 and the phenotypes were ana-lyzed with stem cell surface markers CD29, CD44, CD90, CD105, Stro-1,CD34, CD45. hDPSCs were treated continuous-ly with osteogenic inductive medium for 21. Alkaline phosphatase(ALP) staining, the expression levelsof ALP, osteocalcin (OC), Collengen I(ColI), RunX2 genes and alizarin red staining for mineralization at different time points were analyzed. The non-induced cells were used as control.Results:Phenotype analysis indicatedthat hDPSCs were positive for mes-enchyme stem cell markers CD29, CD44, CD90, CD105, Stro-1, and negative for hematopoietic stem cell markers CD34, CD45. Compared with the control group, the ALP staining of the cells in induced group were significantly higher at day 5, 7, 14 and only the induced cells could form mineralized nodes as shown by alizarin red staining on Day 21. The expression of the ALP, ColI, RunX2, OC genes were positive in induced group.Conclusion:Human DPSCs selected by Stro-1 have the potential of differentiation into osteoblasts under osteogenic culture and forming mineralized nodes. Osteoblast markers (ALP, OC, ColI, RunX2 etc) participated in the osteogenic differentiation of hDPSCs.【期刊名称】《口腔颌面修复学杂志》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】6页(P193-198)【关键词】人牙髓;干细胞;成骨诱导;细胞分化【作者】毛丽霞;刘加强;赵晶蕾;王洁;夏韫晖;王博;袁玲君;房兵【作者单位】上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011【正文语种】中文【中图分类】R782.4人牙髓干细胞(human dental pu lp stem cell，hDPSCs)具有自我更新和多向分化潜能[1,2]，可向多种细胞分化，其中包括成骨样细胞[3-5]，这种特性使人牙髓干细胞替代骨髓基质干细胞修复骨组织缺损成为可能。

牙周膜干细胞论文：牙周膜干细胞的培养和鉴定

牙周膜干细胞论文：牙周膜干细胞的培养和鉴定【中文摘要】本研究从离体牙的牙周膜上分离出牙周膜细胞群,并对其进行纯化；在此基础上,对纯化后的细胞进行鉴定。

证实该细胞为“干细胞性”细胞,为后续牙周组织工程研究提供实验基础。

方法：1.分离纯化人牙周膜干细胞收集临床因正畸或阻生拔出的无龋病、无牙周病的恒牙,取根中1/3的牙周膜,采用酶解组织块法分离到牙周膜细胞群,然后有限稀释克隆法对牙周膜细胞群进行纯化,通过MTT法分析牙周膜细胞群与纯化后的牙周膜细胞的生长情况。

2.牙周膜来源干细胞的初步鉴定采用流式细胞仪分析细胞周期和细胞表面标记物,经成骨诱导液诱导细胞,对细胞进行初步鉴定。

结果：1.有限稀释克隆纯化后的细胞呈长梭形,通过MTT检测,证明该细胞是慢增殖周期的细胞。

2.流式细胞仪检测纯化后的细胞的周期特点和细胞表面标志物,证实其符合干细胞特性。

3.诱导纯化后的细胞成骨分化,细胞出现单极化,其间有针尖大小的钙结节形成,证实纯化后的细胞具有分化潜能。

结论：1.酶解组织块法有效分离到人牙周膜细胞群,有限稀释克隆纯化获得的牙周膜干细胞保持了其生物学特性。

该细胞具有干细胞周期特点,且有成骨分化潜能。

2.培养出牙周膜干细胞,可为组织工程提供基础。

【英文摘要】:Periodontal ligament cell populations were isolated from the periodontal membrane of extracted teeth and were purified; On this basis, the purified cells wereidentified. This paper confirmed that the cells were “stem cells” cells, to provide a basis for follow-up study of periodontal tissue engineering experimental.Methods:1. Separation and purification of human periodontal ligament stem cells Collecting the permanent teeth removal, without caries and periodontal disease, was indicated in the clinical cases due to orthodontic or impacted. Take the periodontal membrane on the middle 1/3 of the root surface. We separated cells within the periodontal tissue membrane by enzymatic, purified cells by limiting dilution cloning. The growth of periodontal ligament cell populations and purified periodontal ligament cells were analyzed by MTT.2. preliminary identification of Periodontal ligament stem cells:Cell cycle and cell surface markers were detected by flow cytometry. Osteogenic medium induced cells to identified cells.Results:1. Cells purified by limiting dilution cloning appeared Spindle. The results show that the cell is a slow proliferation cycle stem cells by MTT detection.2. The cells purified were detected cell surface markers and cell cycle characteristics by flow cytometry. The result demonstration that the cells accordance with characteristics of stem cell.3. Purified cells were induced by osteogenic medium, cells were unipolar, there have been needlethe size of calcium nodules, confirmed that the purified cells possess differentiation potential.Conclusion:1. Cells which maintain their biological characteristics were effectively isolated by Enzymatic and purified by limiting dilution cloning. And the cells have characteristics of stem cell cycle and potential of Osteogenic differentiation.2. Cultured periodontal ligament stem cells provide the basis for tissue engineering.【关键词】牙周膜干细胞组织工程细胞鉴定【英文关键词】Periodontal ligament stem cells Tissue Engineering Cell identification【目录】牙周膜干细胞的培养和鉴定摘要3-4ABSTRACT4-5缩略词表7-8第1章引言8-9第2章人牙周膜干细胞的分离培养和鉴定9-18第一部分分离纯化人牙周膜细胞9-13 1 材料和方法9-11 1.1 主要试剂和仪器9-10 1.2 细胞的分离和纯化10-11 2 结果11-12 2.1 细胞生长的情况11 2.2 细胞的克隆形成情况11 2.3 细胞生长曲线11-12 3 讨论12-13第二部分筛选纯化后的人牙周膜干细胞的鉴定13-18 1 材料与方法13-15 1.1 主要试剂与仪器13-14 1.2 方法14-15 2 结果15-16 2.1 流式细胞仪分析结果15 2.2 成骨分化诱导后细胞形态15-16 3 讨论16-18第3章结论与展望18-19致谢19-20参考文献20-22附图22-24攻读学位期间的研究成果24-25综述25-34参考文献32-34。

人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究

ＰＡＮｅｇ１ＮＧｎ，ＡＮＧａｇ￣ＦｎｔＤＩＹｉ￣ＷＧｕｎ，ＺＨＡＯ２ａＹｕ，ＨｕＮＩ
（．ｅａｔｎｏｔｏｏｔｓＳｏｔｌｇｏｐａ，ｈｏｒｌｒｄｃｌｎｖｒｉ，ｉｎ７０３。ｈａｘ。ｉ１Ｄｐｒｍｅｔｆｈｄｎｉ，ｔｍａｏｏｙＨｓｉｌｅＦｕｈＭｉａｙＭｅｉｉｓｙＸａ１０２ＳａｎｉｎＯｒｃｔＴｔｉｔａＵｅｔＣｈａ
维普资讯
中国美容医学２００８年５月第１第５期ＣｉｅｅＪｕｌｆｅｔｅｉＭｅｉｉｅＭａ．０８Ｖ１７Ｎ．７卷ｈｎｓｏｍａ０ｓｔｄｃｎ．ｖ２０．０．．０Ａｈｃ１５
・
齿科美容
・
论著・
［关键词］干细胞；人牙周膜干细胞；免疫磁珠；流式细胞计量术；免疫细胞化学
［图分类号］７３５［献标识码］［章编号］０８６５（８０ — ４中Ｒ８．文Ａ文１０— ４５２０）５００
Ｉｏｌｉｓａｔｏｎ，ｄｅｎｉｃｉｄｉｏｍｉｓｏｆｍａｎｐｅｒｉｔｉａｔｆｏｎａｎｂｏｎｃｈｕｉｏｄｏｎａｌｉｔｇａｍｅｎｔｌｌｔｅｍｃｅｌｓｓ
ＭｅｈｄｓＤＬＣｓｗｅｅｉｏａｅｙｉｕｏａｅｉｔｏＴｈｌｗｙｏｔｎｍｍｕｏｙｏｈｍｉｒｒｃｄｒｔｏＰＳｒｓｌｔｄｂｍｍｎｍｇｎｔｍｅｈｄｃｅｆｏｃｔｍｅｒａｄｉｙｎｃｔｃｅｓｙｐｏｅｕｅｔｗｅｅｕｅｏｄｉｃｏｅｔｅｃｌｃｃｅａｄｓｒｃｒｅｆｔｅＰＳ．ｔｏｎｃｉｎａｄａｉＯｉｄｕｔｒｏｅｔｒｓｄｔｓｌｓｈｅＩｙｌｎｕａｅｍａｋｒｏｈＤＬＣｓＯｓｅｉｄｕｔｎｄｐｎｃｉｗｅｅｄｎｏｆｏＯｎｃｎｏｒｔｅｍｕｔｉｔｎｄｆｅｅｔｔｎｏｏｆｍｈＩｄｒｉａＩｉｒｎｉｉｆＰＤＬｉｅｃＯａｏＳＣｓ．ＲｓｌＴｈｃｉｄｃｌａｌｎｌｙａｄＩｗｒｉｒｔｎｅｕｔｓｅａｑｕｒｅｌｈｄｃｏａｉｎｏｐｏｌｅａｉ．ｅｓｔｆｏ

人的炎症牙周膜干细胞和牙周膜干细胞的体外分离、培养与鉴定

人的炎症牙周膜干细胞和牙周膜干细胞的体外分离、培养与鉴定目的体外分离培养人的炎症牙周膜干细胞和正常的牙周膜干细胞，并从形态学和表面分子表达率比较两种细胞的差别，为体外分离、培养炎症牙周膜干细胞提供理论依据。

方法体外酶消化组织块法培养牙周炎患者的炎症牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常的人的牙周膜干细胞（PDLSCs），体式显微镜下观察细胞表面形态，流式细胞仪检测表型分子CD90、CD29、CD105、CD31、CD45、STRO-1进行干细胞鉴定。

标签：牙周膜干细胞；炎症牙周炎导致牙周支持组织破坏，是成人失牙的主要原因[1]。

牙周治疗的主要目的是控制牙周组织炎症，维护牙周组织健康，并使包括牙槽骨、牙骨质、牙周膜、牙龈在内的牙周组织达到形态和功能上的再生与重建，这也是牙周病治疗的终极目标[2-4]。

近年发展起来的组织工程技术为牙周组织再生治疗开辟了新途径，种子细胞、信号分子和支架是牙周组织工程技术的三大要素，因此合理选择种子细胞是牙周组织工程技术获得成功的关键[5-6]，目前已确认可用于牙周组织工程技术的种子细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和牙周膜干细胞等[7-9]，其来源多为健康的人体组织，通常存在取材有创、来源有限等弊端，在一定程度上限制了临床治疗的可行性。

许多研究表明在牙周炎时期也存在着组织的再生，而组织的再生离不开干细胞的迁移，只有适当类型的干细胞附着于根面，增殖并分化为功能性附着结构（牙骨质-牙周膜-牙槽骨）的各种细胞组分，配合适宜的刺激因子和基质成分，才可能形成再生组织，否则可能仅产生修复[10]。

Lin 等[11]对3名重度牙周炎（Ⅲ度根分叉病变）患者需要拔除的患牙行GTR 手术，术后6周，切取其中2名患者患牙周围的再生组织，进行免疫组化检测，发现了STRO-1、CD146 和CD44 阳性的细胞，同时拔除余下1名患者的患牙，取其再生组织进行细胞体外培养并传代，用流式细胞仪分析得到STRO-1、CD146 和CD44 阳性的细胞百分比分别为78.3%、94.9%和100%，所得细胞经矿化和成脂诱导4周后可分别形成矿化结节及脂滴，但其分化能力低于PDLSCs 和BMSCs。

人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究

人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究目的：分离筛选人牙周膜干细胞，研究其生物学特性并进行初步鉴定。

方法：采用STRO-1为标记物以免疫磁珠分离筛选人牙周膜干细胞，观察细胞生长及克隆形成情况，流式细胞仪细胞周期、细胞表型分析，免疫细胞化学染色技术检测STRO-1、Vimentin表达，并测定细胞体外多向分化能力。

结果：免疫磁珠法可获得人牙周膜干细胞，细胞具有克隆形成能力，增殖速度低。

细胞周期分析大多数细胞处于G0/G1期,为慢周期性;细胞表型分析证实CD146、CD44高表达，CD34、CD45低表达。

STRO-1及Vimentin均为阳性染色，矿化诱导和成脂诱导证实该细胞具有多向分化能力。

结论：免疫磁珠法是有效的分离纯化牙周膜干细胞的方法。

所分离细胞具有干细胞的细胞周期、表型特点及多向分化能力。

Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells, meanwhile, CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells.Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry研究证实牙周膜内存在具有横向分化能力的干细胞(牙周膜干细胞)，在体外微环境作用下还可分化为成牙骨质细胞或成骨细胞[1-2]。

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万方数据
甄蕾，等．人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导
ＺＨＥＮＬｅｉ．ｅｔａＬＨｕ眦ｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏＯｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ／ｎｖ／ｔｒｏ・３１９・
ＲＮＡ提取试剂盒、一步法ＲＴ．ＰＣＲ试剂盒（Ｔｉａｎｇｅｎ公司。

北京）。

１．２方法
１．２．１牙周膜细胞原代培养收集临床１２一１８岁因正畸需要而拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，ＰＢＳ洗３次，刮取根中ｌ，３牙周膜组织，采用酶解组织块法培养，每隔３ｄ换液．直至细胞从组织块周围游出。

细胞生长达８０％汇合时传代。

１．２．２有限稀释法克隆化培养纯化ＰＤＬＳＣｓ取对数生长期的第１代细胞。

以１～２个／孔的密度接种于９６孔板，常规培养７。

１４ｄ，至出现细胞克隆（细胞数≥５０为判定标准）后扩大培养。

１．２．３ＰＤＬＳＣｓ的初步鉴定分别取第２代克隆形成细胞进行爬片。

采用ＳＰ法检测波形蛋白和角蛋白的表达。

同时利用兀ＴＣ荧光标记二抗检测ＳＴＲＯ．．１和ＣＤｌ４６的表达。

１．２．４体外诱导分化取第２代对数生长期的克隆形成细胞。

按５ｘｌｌＹ个／ｍＬ接种于２４孔板中，待细胞进入对数生长期后弃去原培养液。

ＰＢＳ洗３遍，换诱导液（１０ｍｍｏｌ／ＬＢ．甘油磷酸钠、１０｛ｍｏｌ／Ｌ地塞米松、５０Ｉ．Ｌｇ／ｍＬ维生素Ｃ）培养２１ｄ。

对照组细胞常规培养。

１．２．５成骨性能的鉴定
１．２．５．１茜素红Ｓ染色观察钙结节形成人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液，４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ后饱和茜素红Ｓ溶液染色１０ｍｉｎ，观察钙结节形成情况。

１．２．５．２定性的细胞ＡＬＰ活性检测人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液。

按ＡＬＰ检测试剂盒说明书规范操作。

光学显微镜下观察染色情况。

１－２．５．３免疫细胞化学检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原表达人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后常规ＳＰ法检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原蛋白表达情况。

１．２．５．４ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡＬＰ、ＢＳＰｍＲＮＡ表达收集诱导培养２１ｄ后的人ＰＤＬＳＣｓ．。

使用细胞总ＲＮＡ提取试剂盒提取培养细胞总ＲＮＡ。

采用一步法进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，以Ｂ．ａｃｔｉｎ为内参照。

参照ＧｅｎＢａｎｋ数据库，采用Ｏｌｉｇｏ计算机软件设计引物，Ｂ．．ａｃｔｉｎ上游引物５＇－ｇｃｇａｇａａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｔｃａｔｇｔｔ一３’。

下游引物５’一ｇｃｔｔｃｔｃｃｔｔａａｔｇｔｃａｃｇｃａｃｇａｔ－３’：ＡＬＰ上游引物５＇－ａｔｅｔｔｔｇ．－ｇｔｃｔｇｇｃｃｃｃｃａｔｇ－一３。

下游引物５＇－ａｔｇｃａｇｇｃｔｇｃａａｔａｃｇｃｃａｔ一３７；ＢＳＰ上游引物５＇－ａｔｇｇｃｃｔｇｔｇｃｔｔｔｃｔａａｔ－３’。

下游引物５＇－ｔｔｃｃｔｅｃｔｅｃｔｃｔｔｃｔｇａａｃｔｇ．－３’：由上海生工生物技术公司合成。

反应条件：５０。

Ｃ３０ｍｉｎ逆转录，９４。

Ｃ５ｍｉｎ逆转录失活，然后９４。

Ｃ３０ｓ，５８。

Ｃ３０ｓ，７２。

Ｃ３０ｓ，３５个循环，７２。

Ｃ延伸７ｍｉｎ。

ｌ％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定ＰＣＲ产物片断大小。

２结果
２．１ＰＤＬＳＣｓ的分离及纯化
本实验采用酶解组织块法培养原代细胞。

３～１０ｄ组织块周围有细胞爬出。

２周左右可达８０％汇合。

有限稀释法筛选出来的细胞克隆呈圆形、多角形等多种形态，但都表现为胞核聚集在中心，胞质形成的突起向外呈放射状．具有成体干细胞的特征。

２．２ＰＤＬｓＣｓ的鉴定
免疫细胞化学检查发现．ＰＤＬＳＣｓ广谱角蛋白阴性表达，波形蛋白阳性表达（图１），说明本实验克隆形成细胞为中胚层来源的间充质细胞．且无外胚层来源的细胞污染。

免疫荧光检测可见克隆细胞ＳＴＲＯ．１、ＣＤｌ４６均呈阳性表达，细胞发出明亮的绿色荧光（图２、３），提示其具有干细胞特性。

田１第２代ＰＤＬｓＣｓ波形蛋白染色阳性（免疫组化。

ｘ１００ｌ
Ｆｉｇｍｕｍ１Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｖｉｍｅｎｌｉｎｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ０ｆＰＤＬＳＣｓ（ｉｍｍｕｎｏｈｉａｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｘ１００）
圈２第２代ＰＤＬＳＧｓＳＴＲＯ．１染色阳性（免疫荧光，ｘ１００）
Ｆｉｇｍ陀２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＴＲＯ・１ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ
ＰＤＬＳＣｓ（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｘ１００）
　万方数据
・３２０・
口腔颌面外科杂志２００８年１０月第１８卷第５期
ＪｏｕｍｄｏｆＯｒａｌａｎｄＭａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌＳｕｒｇｅｒｙＶ０１．１８Ｎｏ．５Ｏｃｔｏｂｅｒ．２００８
圈３第２代ＰＤＬＳＣｓＣＤｌ４６染色阳性（免疫荧光。

×１００）
Ｆｉｇｕｒｅ３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＤｌ４６ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＤＬＳＣｓ（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｖｅ，ｘ１００）
２．３钙结节形成
矿化液连续培养１４ｄ左右出现肉眼可见的针尖大小灰白色小结节，并逐渐增大，２１ｄ后茜素红Ｓ染色可见红色的钙结节，周围边界不清（图４）。

图４ＰＤＬＳＣｓ矿化诱导２１ｄ后钙结节染色（×１００）
ｒｉｇ，ｕｒｅ４ＣａｌｄｕｍｎｏｄｅｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＰＤＬＳＣｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎｄｕｃ－ｌｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２１ｄａｙｓ（ｘ１００）
２．４ＡＬＰ活性
人ＰＤＬＳＣｓ经矿化诱导２１ｄ后．ＡＬＰ染色可见明显紫色颗粒（图５），对照组细胞无明显颗粒形成。

圈５ＰＤＬＳＣｓ矿化诱导２１ｄ后ＡＬＰ染色阳性（ｘ１００）
Ｆｉｇｕｒｅ５ＡＬＰｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＰＤＬＳＣｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｌ－ａｍｆｏｒ２１ｄａｙｓ（ｘ１００）
２．５ＢＳＰ、Ｉ型胶原表达
诱导组细胞ＢＳＰ、Ｉ型胶原阳性表达。

对照组细胞阴性表达（图６、７）。

图６ＰＤＬＳＣｓ矿化诱导２１ｄ后ＢＳＰ染色阳性【ｘ１００）
Ｆｉｇｕｒｅ６ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＳＰｉｎｔｈｅＰＤＬＳＣｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎ－ｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２１ｄａｙｓ（ｘ１００）
圈７ＰＤＬＳＣｓ矿化诱导２１ｄ后ｌ型胶原染色阳性（×１００）
Ｆｉｇｕｒｅ７ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｌｌａｇｅｎＩｉｎｔｈｅＰＤＬＳＣｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２１ｄａｙｓ（ｘ１００）
２．６ＲＴ．ＰＣＲ结果
诱导组在２０４ｂｐ和２８８ｂｐ处可见特异性扩增条带，对照组无特异性扩增条带（图８）。

圈８矿化诱导２１ｄ后ＲＴ—ＰＣＲ检测ＡＬＰｍＲＮＡ和ＢＳＰｍＲＮＡ表达
（Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ。

ｌ：诱导组ｐ－ａｅｔｉｎ。

２：诱导组ＢＳＰ。

３：诱导组ＡＬＰ。

４：对照组Ｂ－ａｃｔｉｎ，５：对照组ＢＳＰ，６：对照组ＡＬＰ）
Ｆｉｇｕｒｅ８ＡＬＰｍＲＮＡａｎｄＢＳＰｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＤＬＳＣｓｃｕｄ－ｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２１ｄａｙｓｂｙＲＴ－ＰＣＲ（Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ，ｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ１３－ａｅｔｉｎ，２：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ８ＳＰ，
３：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐＡＬＰ，４：ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ
ｐａｅｔｉｎ，５：ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐＢＳＰ，６：ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
ＡＬＰ）　万方数据
　万方数据
　万方数据。