牙周膜成纤维细胞培养
神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人牙周膜细胞增殖的影响
ｈ ＤＬ ｎ ｒ ａ ｅ ｎ ａｄ ｓ — ｅ ｅ ｄ ｎ ｎ ｅ ｆ ｒ ｕ ｔ ｒｄ ｗｉ ＧＦ ｏ Ｆ ． ｈ Ｐ Ｃｓｉ ｃ ｅ ｓ ｄ ｉ ｏ ｅ ｄ ｐ ｎ ｅ ｔ ｍａ ｎ ｒ ｔ ｌ ｅ ｔ Ｎ ｒｂ ＧＦ Ｔ ｅ ＮＧＦ ａ ｄ ｂ ＧＦ ｈ ｄ ｓｎ ｒｅ ｉ ｅｆ ｃ ｎｐ ｏｉ ｒ － ａｅｃ ｕ ｈ ｎ Ｆ ａ ｙ ｅ ｇ ｔ ｆ ｔ ｒｌ ｅａ ｃ ｅ ｏ ｆ
ｗＵ Ｙ ｎｘ ，Ｓ １Ｊ ，Ｓ Ｎ Ｘａ－ ｎ Ｎ Ｅ Ｒ ｉ（ ｅｔｏ ｔｍ ｔｌ ｙ Ｆｒ ｌ ｉ ｌＭｅｉ ｌＣｌｇ ，ｈ ｎｉ ｄ ａ Ｕ ｉ ｒｔ， ｕ —ｉ Ｈ ｉ Ｕ ｉ ｊ ， Ｉ ｕ Ｄｐ ｆＳｏ ａｏ ｇ ， ｉｔＣｉｃ ｄ ａ ｏｌ ｅ Ｓａ ｘ Ｍｅｉ ｌ ｎｖ ｓｙ ａ ｎ ｏｕ ｏ ｓ ｎａ ｃ ｅ ｃ ｅｉ
・
５ ・ ０
山西医科大学学报 （ ｈｎｉ ｄＵ ｉ）２０ ＪＳａｘ Ｍｅ ｎ ｖ ０９年 １ ，４ （ 月 ０ １
文章编号 ： １０ ６ １ （０ ９ ０ — ０ ０— ３ ０ ７— ６ １ ２ 因子 和碱 性成 纤 维 细胞 生长 因子 对 人 牙周 膜 细胞 增 殖 的影 响
ｔ ｎ ｏ Ｐ Ｃ ． Ｃ ｎ ｌ ｓ ｎ ＮＧ ｎ Ｆ ａ ｅ ｕ ｅ ｓ ｂｏ ｃｉ ｅ ｍｅ ｉｔｒ ｏ ｅ ｏ ｏ ｔｌｒｇ ｎ ｒ ｔ ｎ ｉ ｆｈ ＤＬ ｓ ｏ ｏ ｃｕ ｉ ｏ Ｆ ａ ｄ ｂ ＧＦ ｃ ｎ ｂ ｓ ｄ ａ ｉａ ｔ ｄａ ｏ ｓｆｒｐ ｒ ｄ ｎ ａ ｅ ｅ ｅ ａｉ ． ｖ ｉ ｏ Ｋｅ ｒ ｓ： ｐ ｒ ｄ ｎ ａ ｉａ ｎ ｅ ｌ ； ｎ ｒ ｅ ｇ ｏ ｈ ｆｃｏ ； ｂ ｓ ｂ ｏ ｌｓ ｇｏ ｈ ｆ ｃｏ ｙ ｗｏ ｄ ｅ ｏ ｏ ｔ ｌ ｇ ｍｅ ｔｃ ｌ ｅ ｖ ｗ ａ ｔｒ ａ ｉ ｆ ｒ ｂ ａ ｔｒ ｗ ａ ｔ ｒ ｉ ｌ ｓ ｒ ｔ ｃｉ ｔ
富血小板血浆对人牙周膜成纤维细胞在脱矿病变牙根表面增殖及分化的影响
２１ ００年 ４月
遵
义
医 学
院
学
报
Ｖｏ１３ Ｎｏ ２ ．３ ．
ＡＣ Ａ ＡＣ Ｔ ＡＤＥ Ａ ＭＩ Ｅ ＭＥＤ Ｃ ＮＡＥ Ｚ ＹＩ ＩＩ ＵＮ
Ａｐ ． ０ ０ ｒ２ １
富血小板血 浆对 人 牙周 膜成 纤维细胞 在脱 矿病 变 牙根表 面增 殖及 分 化 的影 响
高 丽 ・ ， 马叶华 何 权敏 张 ， ，
【 摘 要 ］ 目的
剑 ， 琪 刘
（ ． 医学３ ０ ；． ６０ ３ ２ 江苏省宜兴市牙病防治所 ， 江苏 宜兴 ２４ ０ ） １２ ０ 研究 不 同浓 度 的富血 小 板血 浆 （ｌｔｅ— ｉｈＰａｍ Ｐ Ｐ Ｐａ ｌ Ｒｃ ｌ ａ，Ｒ ）对 人 牙周 膜 成 纤维 细 胞 （ ｕ ａ ｅｔ ｓ Ｈ ｍｎ
［ｂｔａｔ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｎ ｅｔ ａ ｈ ｆ ｃ ｏ ｄｆ ｒ ｔｃｎ ｅｔ ｔ ｎ ｆｐａ ｌ — ｒ ｈ ｐａｍａ （Ｒ ）ｏ ｅ Ａｓ ｃ ｒ ］ ｊｃｉ ｏ ｉｖｓｇｔ ｔｅ ｅ ｅｔ ｆ ｉｅ ｎ ｏ ｃｎｒｉ ｓ ｏ ｌ ｅ ｔ ｉ ｌ ｖ ｉ ｅ ｅ ａｏ ｔｅ ｃ ｓ Ｐ Ｐ ｎ ｃｌ ｌ ｐｏｆｒ ｉ ｎ ｉｅｅｔ ｔ ｎｏ ｕ ｎｐｒ ｄ ｎａ ｌ ａ ｎ ｂｏｌｓ （ Ｄ Ｆ） ｎｔｅｄ ｍ ｎｒ ｉ ｄｒｏ ｓｒ ｃ ｆ ｒｌｅａｏ ａｄｄ ｒｎ ａ ｏ ｆ ｍａ ｅｉ ｏｔ ｇｍｅｔ ｒｂａｔ （ Ｌ ｓ ｏ ｈ ｅ ｉｅａ ｚ ｏｔ ｕ ａｅｏ ｉ ｔｎ ｆ ｉｉ ｈ ｏ ｌｉ ｉ ｆ ｓ Ｐ ｌｅ ｆ
处理 。 采用二次离心法分 离全血 ， 获取 Ｐ Ｐ， Ｒ 并配制为不 同浓度的 Ｐ Ｐ待用 。 Ｒ 将制备 的牙根片分组植入 ９ ６孔板 ， 分为 包被 Ｐ Ｐ组和不包被组 ， Ｒ 对照组不加 Ｐ Ｐ， Ｒ 实验组加入不 同浓度 的 Ｐ Ｐ 用 ＭＴ 法观察细胞附着及增殖的情况 。 Ｒ ， Ｙ 结果
成纤维细胞培养流程
《成纤维细胞培养流程》1.“先得准备好材料吧，这就像做饭得有食材，得全。
比如小李准备材料的时候可仔细了。
要是材料不齐，咋弄。
”2.“消毒得做好呀，这就像打扫房间得干净，得净。
比如小张对消毒特别重视。
要是消毒不好，完蛋。
”3.“细胞提取得小心吧，这就像摘花得轻点儿，得柔。
比如小孙提取细胞的时候小心翼翼。
要是不小心，细胞坏了。
”4.“培养基得选对呗，这就像给宝宝选奶粉，得准。
比如小周为选培养基费了不少心思。
要是培养基不对，白搭。
”5.“培养环境得合适吧，这就像人住的地方得舒服，得好。
比如小吴努力营造好的培养环境。
要是环境不好，细胞不长。
”6.“观察得仔细呀，这就像看宝贝得用心，得知。
比如小赵时刻盯着细胞观察。
要是不仔细观察，出问题都不知道。
”7.“换液得及时吧，这就像给花浇水得按时，得勤。
比如小郑按时换液。
要是不及时换液，细胞渴死。
”8.“得防止污染吧，这就像保护宝贝不被弄脏，得防。
比如小胡想尽办法防污染。
要是被污染，全完。
”9.“得有耐心吧，这就像等花开得能等，得耐。
比如小杨耐心等待细胞生长。
要是没耐心，急也没用。
”10.“得有技术吧，这就像开车得会开，得会。
比如小宋努力提高自己的技术。
要是技术不行，咋培养。
”结论：成纤维细胞培养有流程，得认真。
牙周组织生物力学
• 来源于造血系统的单核细胞---局部信号—融合；
• 成牙骨质细胞：
• 成纤维细胞的鉴别：①光镜下CB的形态不规 则而成纤维细胞一般呈纺锤形，就分泌胶原 的功能而言，CB不如成纤维细胞活跃。② CB能分泌矿化相关蛋白如OPN、 BSP、 OCN等，能形成矿化结节，成纤维细胞在一 般条件下无上述特性。
Байду номын сангаас
Substrate Stretch System
Loading Modes
Uniaxial Elongation
Four-Point Bending
Longitudinal Substrate Stretch
牙周膜的生物学特性
从结构和功能上看，牙周膜可以说是“牙骨 质和固有牙槽骨的骨膜”。 其中的成纤维细胞对牙周膜胶原纤维的生成和 更新起着重要作用； 同时，成骨细胞产生新骨，使新生的牙周膜纤 维得以重新附着，保持牙齿和牙周的正常联系； 成牙骨质细细胞可形成牙骨质，维持牙骨质的 完整健康。
胶原
多种胶原，目前已知Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅻ型等。
Ⅰ型胶原是形成坚固的纤维附着、使牙周膜具备 弹性，抵抗咬合力的组织学基础； Ⅴ型胶原覆盖在Ⅰ、Ⅲ型胶原的表面，加强细胞 的附着； Ⅵ型为很短的纤维原，联结于Ⅰ、Ⅲ型胶原之间； Ⅻ型胶原：胶原与细胞外基质联结的桥梁作用。
2．基质
在牙周膜中，细胞、纤维、血管及神经 之间的空隙中均为基质和体液所充满。 基质主要由酸性粘多糖和糖蛋白组成。 基质及体液成分可减少纤维间的摩擦，与 牙支持功能密切相关。
质组成。另有血管、淋巴管和神经。
1．牙周纤维 主要为胶原纤维，少量弹性纤维只见于血管壁; 主纤维束的一端埋在牙骨质内，另一端埋入牙槽 骨，或分布在牙龈中。 正常的主纤维束稍呈波纹状，弯曲值约占牙周膜 长度的7.5％，故咀嚼时牙齿可有轻微的活动。 分组:
人牙周膜成纤维细胞对甲硝唑替硝唑的跨膜转运
关 键 词 ：人 牙 周膜 成纤 维 细胞 ；甲 硝 唑 ；替 硝 唑 ；转 运 ；高 效 液 相 色 谱 法
［ 中国 图书分类号］Ｒ ８ ． ７ １４
［ 文献标 识码］ Ａ
［ 文章 编号］１０ — ７ １ ２ ０ ） ２ ０ ９ — ５ ０９ ３ ６ （０７ ０ — ００ ０
Ｔｈ ａ ｓ ｏ ｔｏ ｅ ｒ ｎ ｄ ｚ ｌ ｎ ｉ ｉ ａ ｏ ｅｉ ｕ ａ ｅ ｉ ｄ ｎ ａ ｇ ｍ ｅ ｔｆ ｒ ｂ ａ ｔ ｅｔ ｎ ｐ ｒ ｆ ｔ ｏ ｉ ａ ｏ ｅａ ｄ ｔ ｄ ｚ ｌ ｎ ｈ ｍ ｎ ｐ ｒ ｏ ｏ ｔ ｌ ｉ ａ ｎ ｂ ｏ ｌ ｓ ｒ ｍ ｎ ｌ ｉ ｓ
维普资讯
口 腔颌面 修复学杂志 ２０ ０ ７年４ 月第 ８ 卷第２期
・
论著 ・
人牙周膜成纤维细胞对 甲硝唑替硝唑的跨王 东胜
【 要】 目的 ：研 究人牙周膜成纤 维细胞（ｕ ｎｐ ｒｏ ｏ ｔｌ ｇ ｍｅ ｆ ｒｂａｔ， Ｄ Ｆ 对 甲硝唑和替 硝 摘 ｈ ｍａ ｅｉｄ ｎａ ￣ ａ ｍ ｉ ｏ ｌｓｓ ＨＰ Ｌ ） ｂ 唑的转运 ，为根管全身给药提供 实验 依据。方 法 ：正畸拔除 的前磨牙 ，组织块法 作 ＨＰ Ｌ Ｄ Ｆ原代培 养。甲硝 唑和
ｉｔ ｃｌ ｌ ｄｃｎ ｏ ｔｎｓｗ ｒ ａｕ ｙｈｇ ｅｆｒ ｎ ｃ ｉｕｄ ｃ ｏ ｔｇａｈ （ Ｐ Ｃ ｎ ｈ ｅｌ ｏａ ｎｒ ｅｌ ａ ｍｅｉｉ ｃ ｎｅｔ ｅｅｍｅｓ￣ｄ ｂ ｉｈｐ ｒ ｍａ ｅ ｌ ｉ ｈ ｍａｏｒｐ ｙ Ｈ Ｌ ）ａ ｄｔｅ ｃｌ ｔｔｌ ａ ｕｒ ｅ ｏ ｑ ｒ
替 硝 唑 孵 育 ＨＰ Ｆ 和 Ｍ Ｃ３ 一 细 胞 一 定 时 间 后 ，超 声破 碎 细 胞 ， 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 胞 内药 物 含 量 ，考 马 ＤＬ Ｔ３ Ｅ１
成纤维细胞的培养
成纤维细胞的培养1前言成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。
在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。
不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。
通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。
成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。
由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。
成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。
2材料和方法2.1材料玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管塑料器材：细胞培养板橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜2.2试剂的配制水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、2.3方法2.3.1试剂配制（1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水（2) 组织冲洗液：无血清MEM（3）细胞生长液：含10％FCS MEM2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。
体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究进展
体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究进展作者：吴玲来源：《中国保健营养·中旬刊》2014年第02期【摘要】牙周膜干细胞因高度自我更新能力和多向分化潜能能形成类似于天然牙骨质牙周膜复合体的结构，使其在临床上具有广泛应用前景，目前在牙周组织工程方面的应用研究已取得一些进展，被认为是牙周组织工程的首选种子细胞，但是牙周膜组织中干细胞含量非常少，如何用成体干细胞替代牙源性干细胞，从而获得大量种子细胞。
本文就目前体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究做一综述。
【关键词】牙周膜干细胞；增殖；细胞因子【中图分类号】R748 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）02-0534-02牙周炎是一种侵犯牙周组织（牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨）的慢性炎症性疾病，是由于细菌侵犯牙龈和牙周组织而引起的牙龈发炎肿胀，牙周袋形成、牙槽骨丢失，最终导致牙齿松动脱落病变，牙周炎是成年人牙齿丧失的主要原因之一。
全球重度牙周炎患病率为5-20%。
本文就目前体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究做一综述。
1.1 釉基质蛋白（EMP）由上皮根鞘内层的成釉细胞分泌，主要成分是釉原蛋白（amelogenin，Am）和非釉原蛋白（non-amelogenin）。
众多实验都已证实EMP对牙周膜干细胞和骨髓基质干细胞[7]有明显的促增殖作用，可以提高干细胞总蛋白的合成，碱性磷酸酶（ALP）的活性以及矿化结节的形成，并且作用的效果呈时间和质量浓度依赖性。
刘兰宁等用不同浓度的EMPs诱导牙周膜干细胞，得出EMPs在一定浓度下可以促进人PDLCs增殖，以100mg/L浓度最佳。
1.2 骨形成蛋白（BMP）除BMP-1外其余均属于转化生长因子-β超家族成员，在胚胎发育期间由多种上皮和间叶组织产生，诱导间叶细胞分化为软骨细胞和成骨细胞，参与软骨与骨发育，参与四肢形成及肺、肝、肾等软组织发育，与交感神经元分化有关。
在BMPs中，BMP-2的诱骨作用最强，是发现的唯一能单独诱导成骨的骨形成蛋白，存在于具有成骨潜质的细胞的细胞质中，可以诱导未分化的间充质细胞向成骨细胞和成牙骨质细胞分化，促进牙周组织新骨的形成。
Wnt信号通路调节人牙周膜干细胞成骨分化及其机制研究
Wnt信号通路调节人牙周膜干细胞成骨分化及其机制研究Wnt信号通路调节人牙周膜干细胞成骨分化及其机制研究摘要：牙周膜干细胞（PDSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的成纤维细胞样细胞，其在牙周组织再生与重建中起着重要作用。
近年来，Wnt信号通路成为研究PDSCs成骨分化的热点。
本研究通过分离培养PDSCs，采用不同浓度的Wnt信号通路激动剂，检测细胞增殖情况和成骨分化相关分子表达，揭示Wnt信号通路调节PDSCs成骨分化的机制，并探讨其在牙周组织再生与重建中的应用前景。
结果表明，Wnt信号通路激动剂处理能够提高PDSCs的增殖能力和成骨分化潜能，同时上调关键成骨转录因子RUNX2和osteocalcin的表达，下调抑制PDSCs成骨分化的因子Dkk-1和SOST的表达，对蛋白质水平的磷酸化调节也发挥重要作用。
总之，Wnt信号通路在调节PDSCs成骨分化过程中发挥着关键作用，为其在牙周再生领域的应用提供了新的思路和方法。
关键词：Wnt信号通路；牙周膜干细胞；成骨分化；RUNX2；osteocalcin；Dkk-1；SOST近年来，牙周组织再生与重建的研究备受关注，其中PDSCs作为一种重要的细胞来源受到越来越多的关注。
PDSCs具有自我更新和多向分化潜能，是牙周组织再生和重建中的重要细胞类型之一。
研究发现，Wnt信号通路在胚胎发育和成骨分化等生物学过程中发挥着关键作用。
因此，不少研究将目光投向Wnt信号通路在PDSCs成骨分化中的作用机制。
本研究通过对PDSCs进行不同浓度的Wnt信号通路激动剂处理，研究发现Wnt信号通路能够促进PDSCs的增殖和成骨分化。
同时，Wnt信号通路的激动对PDSCs关键成骨转录因子RUNX2和osteocalcin的表达起到调节作用，并且抑制具有抑制PDSCs成骨分化的因子Dkk-1和SOST的表达。
实验还发现，Wnt信号通路的调节作用可能与蛋白质水平的磷酸化有关。
维生素D减缓牙周炎症反应的实验研究
维生素D减缓牙周炎症反应的实验研究目的：初步探讨维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞炎症反应的抑制作用，为牙周病的防治提供一定的依据。
方法：采用酶联免疫吸附实验、实时荧光定量核酸扩增检测系统检测维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞分泌炎症因子白介素1β、肿瘤坏死因子α水平的影响。
结果：维生素D 对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞分泌炎症因子白介素1β、肿瘤坏死因子α有显著的抑制作用，最低有效浓度为6.25μg/ml，且随着维生素D浓度的增加，抑制作用越明显。
结论：维生素D是一种潜在的防治牙周炎症反应的药物。
Abstract：Objective To investigate the inhibitory effect of vitamin D on Porphyromonas gingivalis induced inflammation of human periodontal ligament cells，provide evidence for the prevention of periodontitis. Methods The enzyme linked immunosorbent assay and real-time quantitative PCR detecting system were used to observe the effects of vitamin D on the secretion of interleukin 1β and tumor necrosis factor α induced by Porphyromonas gingivalis. Results Vitamin D could inhibit the production of inter leukin 1β and tumor necrosis factor α significantly.The minimum inhibitory concentration was 6.25μg/ml.With the increase of concentration of vitamin D，the inhibitory effect was enhanced. Conclusion Vitamin D may be a potential medicine of periodontitis.Key words：vitamin D；1，25-dihydroxy vitamin D3；periodontitis；interleukin 1β；tumor necrosis factor α牙周炎是以炎症因子渗出、牙周支持组织破环为主要病理表现的慢性、广泛性炎症反应，是成人失牙的首要原因。
釉基质蛋白对人牙周膜成纤维细胞矿化相关蛋白的影响
・２ ７ ・ ２
釉 基 质 蛋 白对 人 牙 周 膜 成 纤 维 细 胞 矿 化 相 关 蛋 白 的 影 响
ｌ ａ ｎ ｉ ｒ ｂ ａ ｔ ｈ ＤＬＦ ｎ ｘ ｌ ｒ ｈ ｏ ｓｂ ｌ ｙ ｏ ｔ ｃ ｅｅ ａ ｉｇ ｐ ｒ ｄ ｎ ａ ｅ ｅ ｅ ａ ｉ ｎ Ｍ ｅｈ ｄ ｈ ＤＬＦ ｉ ｍｅ ｔｆ ｏ ｌ ｓ ｓ（ Ｐ ｇ ｂ ）ａ ｄ ｅ ｐ ｏ ｅ ｔ ｅ ｐ ｓ ｉ ｉ ｔ ｆｉｓ ａ ｃ ｌｒ ｔｎ ｅ ｉ ｏ ｔ ｌｒ ｇ ｎ ｒ ｔ ． ｉ ｏ ｏ ｔｏｓ Ｐ
Ｈ ＵＡＮＧ ａ － ｈ ｎ，ＬＩ Ｌａ ｎ ｎ Ｘｉ ｏｏ Ｄｅ ａ ｔ ｅ ｔ ｔｍ ｔ ｌｇ。Ｔ ｅ ｎ Ａ｝ ｉｉｔｄ Ｈｏｐ ｔｌ ｆ Ｃ ｅ ｇ ｕ Ｍｅ ｉ ｌ ｏ ｌ ｅ Ｃ ｅ ｇ ｕ６ ０ ０ ） ｏ ｈ Ｆ ｆｌ ｅ ｓ ｉ ｈ ｎ ｄ ｄ ｃ ｌ ｇ ， ｈ ｎ ｄ １ ５ ０ ａ ａｏ ａＣ ｅ
黄 晓 山 ， 兰 宁。 郭 利 明 刘 ，
（．成 都 医学 院 第一 附 属 医 院 ，四川 成 都 ６ ０ ０ ２ １ １５ ０ ．南 方 医科 大 学 中西 医结 合 门诊 部 ）
【 要 】 目的 通 过 检 测 釉 基 质蛋 白 （ ｎ ｍ ｌ ｔ ｘｐｏｅ ｓ ＭＰ ）作 用 于体 外培 养 牙 周 膜 成 纤 维 细 胞 ， 细 摘 Ｅ ａ ｅ ｍａｒ ｒｔ ｎ ，Ｅ ｓ ｉ ｉ 对 胞 骨 涎 蛋 白 、 桥 蛋 白 、 粘 连 素 、 骨 质 附 着 蛋 白 （ ｅ ｎｕ ｔａｈ ｎ ｒｔｉ， ＡＰ 表 达 及 碱 性 磷 酸 酶 （ｌａ ｎ 骨 骨 牙 Ｃ ｍｅｔｍ ａｔ ｍｅｔ ｏｅ Ｃ ） ｃ ｐ ｎ ａ ｌｅ ｋｉ
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我的细胞培养计划
1、 培养目的：
人牙周膜成纤维细胞( human periodontal ligamentfibroblasts,
PDLFs) 是牙周组织修复与重建的前体细胞之一., 在牙周病病理变
化和转归中起着重要作用。因此, 希望通过较简单的实验方法能较容
易地培养出生长状态良好的牙周膜成纤维细胞,为研究牙周膜的生物
学特点及各种与牙周膜成纤维细胞相关的实验研究提供较好的体外
模型。
2、实验室条件：
超净工作台、培养箱、倒置显微镜、冰箱、冷冻保存装置、细胞计数
板和电子细胞计数仪、离心机、PH计、天平、水纯化装置、高压蒸汽
消毒装置、电热干燥箱、过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液
器、特殊用具、杂用品。DMEM 培养基, 胶原酶, 胰蛋白酶, 小牛血
清, ABC 免疫组化试剂盒。
3、培养方法：
1）、培养基: DMEM 培养基, 内含10%小牛血清、青霉素100u/ ml、
链霉素100Lg / ml。
2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）；
选择12 岁~ 25 岁因正畸或阻生拔牙患者, X 线显示无根尖病变, 无
骨质吸收, 牙龈正常, 主诉该牙无既往病史。在拔牙过程中不增隙也
不使用牙挺, 拔除后, 用消毒刮匙刮取拔牙创骨壁中部的牙周膜,
将刮取的牙周膜立即放入盛有培养基的无菌瓶中, 送往实验室处理。
3）、 组织块的冲洗: 在洁净工作台上用含双抗( 青霉素100u/ ml, 链
霉素100Lg / ml ) 的HANK. S 液反复冲洗3 次, 尽量去除组织块上
附着的血污等其它杂质和细菌。
4）、PBS 冲洗2次后, 加入0. 125% 胰蛋白酶及0. 1%胶原酶5ml, 37℃
振荡下消化30～60min。镜下观察, 组织松散、大部分细胞游离时, 用
吸管吹打使其彻底分散。将消化的细胞悬液经190目筛过滤, 收集并
离心( 1000 r / min, 10 min) , 弃去上清液。
5）、加入含10%小牛血清的DMEM 培养基, 充分吹打细胞悬液, 血细
胞计数板计数,将细胞按4 × 105 / 瓶接种于25cm2 培养瓶, 加入4
mlDMEM 培养基, 内含10%小牛血清、青霉素100u/ ml、链霉素
100Lg / ml, 于二氧化碳孵箱内培养。培养条件为5%CO2、95%
空气、37℃、饱和湿度。待细胞贴壁后, 隔日换液。
4、注意事项：
1）、在收集标本, 供体年龄越小越易取得成功, 标本要新鲜并及时
处理。在刮除牙龈1/ 3牙周组织以避免污染的情况下, 要彻底刮下中
2/ 3剩余牙周组织, 以防止牙周膜细胞成分的丢失。
2）、 在消化时间上,应根据组织块的大小采用不同的消化时间。本
实验采用0. 1%胶原酶和0. 125% 胰蛋白酶联合消化约50min左右, 显
微镜下密切观察组织消化情况, 及时收集细胞, 消化时间过长, 将
会影响细胞贴壁及成活率。
3）、 在细胞贴壁方面, 通常原代细胞贴壁速度较慢, 可通过:a. 培
养瓶胶原涂膜; b. 在培养瓶内盛有少量培养基并预先1、2天放置二
氧化碳孵箱内, 使用前吸出培养基, 以改善瓶壁表面性状; c. 使用
进口一次性塑料培养瓶( Nunc, Danmark) 等方法, 可提高牙周膜细
胞成活及贴壁速度。¼静置培养, 在原代培养最初接种24小时内, 细
胞尚未完全贴壁或刚贴壁, 不可轻易震动培养瓶, 以防止刚贴壁的
细胞重新漂浮。
4）、由于细胞比较娇嫩,制备单细胞悬液过程中要求操作轻、稳,吹
打时忌产生气泡。另外整个制备单细胞悬液过程在冰 上进行,能更好
地保持细胞活力。
5）、一定要注意无菌操作。
5、目的细胞的鉴定方法：
1）、 细胞形态学观察
倒置显微镜下牙周膜成纤维细胞呈星形、长梭形, 胞体丰满, 胞浆均
匀, 核圆形或卵圆, 核仁清晰。
2）、 免疫组化染色观察
牙周膜成纤维细胞波丝蛋白染色阳性, 细胞胞浆棕黄色着色, 角蛋
白染色阴性, 证实该细胞为中胚层来源。
6、困难及解决办法：
1）、 刮离牙周组织要彻底，操作过程中动作轻柔。
2）、在实验准备阶段器清洗器械时要细致认真。若忽略培养瓶内的
细小的杂质，可导致在培养过程中一些杂质也在瓶内生长 。
3）、自身专业技能不熟练，吹打是过多气泡产生，无菌观念不强等
原因，在培养过程中导致细胞死亡。