三种方法原代培养人牙周膜细胞

中国组织工程研究与临床康复第14卷第23期 2010–06–04出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research June 4, 2010 Vol.14, No.23
Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Jiang Jun-qiang★, Master, Lecturer, Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China jqjiang@
Correspondence to: Cai Wei, Lecturer, Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China caiwei311@ Supported by: the Scientific Research Foundation of Health Department of Sichuan Province, No. [2007]431*
Received: 2010-01-19 Accepted: 2010-05-10
三种方法原代培养人牙周膜细胞*★
蒋俊强，王忠朝，黎春晖，蔡炜
Primary culture of human periodontal ligament cells using three methods
Jiang Jun-qiang, Wang Zhong-chao, Li Chun-hui, Cai Wei
Abstract
Jiang JQ, Wang ZC, Li CH, Cai W.Primary culture of human periodontal ligament cells using three methods. Zhongguo Zuzhi
Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(23): 4290-4294. [ ]
摘要
蒋俊强，王忠朝，黎春晖，蔡炜.三种方法原代培养人牙周膜细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(23):4290-4294.
[ ]
0 引言
细胞培养技术是细胞生物学研究的基础[1]。

从组织中分离的原代细胞较好地保存了原组织细胞的遗传特征和生物学特征[2]。

体外培养的人牙周膜细胞(human periodontal ligament cell，hPDLC)对研究牙周细胞生物学、药理学、毒理学以及牙周组织工程研究具有重要意义[3-7]。

牙周膜是一种致密的结缔组织，由细胞、基质和大量的胶原纤维组成。

由于受到牙周组织的解剖结构和取材数量的限制，牙周膜细胞的原代培养较为困难，这也成了限制牙周细胞生物学研究的瓶颈[8-10]。

大量的研究者对其培养方法进行了探索，目前常用的方法主要有两种：组织块法和酶消化法[11-15]。

作者在实验过程中发现这两种方法存在培养周期较长，成功率较低、培养出的细胞活性欠佳等缺陷。

若将两种方法结合起来，采用酶消化结合组织块法能够有效提高hPDLC培养的成功率。

本实验分别采用这3种方法进行hPDLC的原代培养，比较其培养成功率，同时对所培养细胞进行鉴定，探索hPDLC原代培养的方法，为牙周细胞生物学研究奠定基础。

蒋俊强，等. 三种方法原代培养人牙周膜细胞
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泸州医学院附属
口腔医院口腔内科，四川省泸州市646000
蒋俊强★，男，1976年生，四川省邻水县人，汉族，2006年四川大学华西口腔医学院毕业，硕士，讲师，主要从事牙周病病因及其防治的研究。

jqjiang@
通讯作者：蔡炜，讲师，泸州医学院附属口腔医院口腔内科，四川省泸州市646000
caiwei311@
中图分类号:R394.2 文献标识码:A
文章编号:1673-8225(2010)23-04290-05
收稿日期：2010-01-19
修回日期：2010-05-10(20091119002/WL.Q)
1 材料和方法
设计：随机分组设计，对比观察。

时间及地点：实验于2007-08/2008-05在泸州医学院口腔医学实验中心完成。

材料：选取于泸州医学院附属口腔医院口腔颌面外科门诊因正畸需要而拔除的双尖牙58颗，患者年龄12~16岁，平均14岁，征得患者本人及家长同意。

所选牙无龋坏、根尖周炎和牙周炎。

主要试剂及仪器：
实验方法：
hPDLCs 原代培养：
组织来源及分组：将所选58颗牙随机分为3组，分别采用组织块法(n =19)、酶消化法(n =19)、酶消化结合组织块法(n =20)进行原代培养。

牙离体后立即用含双抗的PBS 反复冲洗，去净血污后立即投入含双抗的DMEM 细胞培养液中，转送至超净工作台。

在超净工作台内用双抗液漂洗后，在不含血清的细胞培养液润湿下用手术刀刮取牙根中1/3的牙周膜。

组织块法培养：将刮取的牙周膜组织剪成约 1 mm×1 mm×1 mm 的小块，均匀铺于无菌的25 mL 培养瓶。

倒置培养瓶，加入含体积分数为20%胎牛血清、双抗的DMEM 培养基 5 mL ，然后将培养瓶置于CO 2恒温培养箱中(体积分数为5%CO 2，37 ℃、100%湿度)孵育。

4 h 后翻转培养瓶，继续培养。

酶消化法培养：将刮取的牙周膜组织剪成约 1 mm×1 mm×1 mm 的小块，0.25%胰蛋白酶消化5 min ，800 r/min 离心6 min ，弃上清液，再用0.2%Ⅰ型胶原酶于恒温摇床内，37 ℃消化50 min ，800 r/min 离心3 min ，弃上清液，加入含体积分数为20%胎牛血清、双抗的DMEM 培养基5 mL ，吹打混匀后将培养瓶置于CO 2恒
温培养箱中(体积分数为5%CO 2，37 ℃、100%湿度)培养。

酶消化结合组织块法培养：收集刮下的牙周膜组织不经剪切，直接移入离心管，加入含0.2%Ⅰ型胶原酶3 mL ，37 ℃振荡消化110 min ，见大部分细胞游离，用吸管吹打使其充分分散，加入少量含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基终止消化。

1 000 r/min 离心10 min ，弃上清液，加入少量含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基，接种于25 mL 细胞培养瓶中，用巴氏吸管将组织块摆放均匀，倒置培养瓶，加入含体积分数为20%胎牛血清、双抗的
DMEM 培养基5 mL ，然后将培养瓶置于CO 2恒温培养箱中(体积分数为5%CO 2，37 ℃、100%湿度)孵育。

4 h 后翻转培养瓶，继续培养。

传代培养：待细胞长满瓶底约80%时，弃原
培养基，用PBS 洗涤1次，加入0.25%胰蛋白酶消化3 min ，倒置显微镜下见大部分细胞回缩变圆后，用含血清的培养基终止消化，1 000 r/min 离心10 min ，弃上清液，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基，1∶2进行传代培养。

hPDLCs 的鉴定：
细胞形态学观察：倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态；第2代细胞接种于载玻片上，制备细胞爬片2张，常规苏木精-伊红染色，显微镜下观察细胞形态。

免疫组织化学染色鉴定：取第2代培养细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞后按1×107 L -1的密度接种于载玻片上，待细胞长满载玻片后，PBS 振洗3次，5 min/次；40 g/L 多聚甲醛固定20 min ；PBS 振洗吹干；体积分数为3%H 2O 2处理10 min ；正常血清工作液封闭10 min ；分别加入一抗Vimitin 和CK14于2张爬片(37 ℃， 2 h)；PBS 振洗后依次加入二抗、三抗处理 (37 ℃，0.5 h)；DBA 显色2~6 min ；苏木精复
染2~6 min ；树胶封固；显微镜下照相。

绘制细胞生长曲线：取第4代细胞，用0.25%
的胰蛋白酶消化后，接种细胞于24孔细胞培养
板，每孔接种1 mL ，细胞密度为1.5×107 L -1。

将培养板置于CO 2恒温细胞培养箱中静置密闭培养。

接种细胞后，每24 h 计数3孔，取均值；连续计数8 d ，绘制出细胞生长曲线。

按下式计算细胞倍增时间：
DMEM 培养基，双抗液(含100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素)，胰蛋白酶，Ⅰ型胶原酶，胎牛血清抗细胞角蛋白多克隆抗体，抗波形丝蛋白多克隆抗体 ABC 免疫组织化学试剂盒 超净工作台
CO 2恒温培养箱
倒置相差显微镜 高速离心机 试剂及仪器
来源
Sigma ，美国
DACO ，美国
Vector ，美国
AIR TECH ，苏州净化设备厂Forma Scientific ，美国 Olympus 公司，日本 上海菲恰尔分析仪器有限
公司
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其中t 0=培养起始时间，t =培养终止时间，N 0=培养起始细胞数，N t =培养终止细胞数。

主要观察指标：原代细胞游出时间、所培养细胞形态、细胞抗波形蛋白与角蛋白免疫组织化学染色鉴定及细胞生长曲线变化。

设计、实施、评估者：实验设计为第一、四作者，干预实施为第一、二作者，评估为第一作者。

所有参与实验人员均经过细胞生物学以及免疫组织化学实验训练，免疫组织化学染色鉴定采用盲法评判。

统计学分析：由第三作者采用SPSS 13.0软件完成统计处理。

2 结果
2.1 细胞原代培养情况
组织块法原代培养情况：倒置显微镜下观察，培养一
两周，有原代细胞从组织块边缘游出，以组织块为中心呈放射状排列生长。

19例中培养成功共4例，成功率21%。

4例中，最早可见到有细胞从组织块周围爬出的时间分别为原代培养第8，12，13，15天，平均11.25 d 。

细胞铺满瓶底80%分别在原代培养第15，18，18，20 d ，平均17.75 d 。

酶消化法原代培养情况：倒置显微镜下观察，原代培
养的第3天开始，即有细胞开始贴壁生长，细胞多为星形或长梭形。

19例中培养成功共2例，成功率11%，另有1例在原代培养第4天见到有细胞贴壁生长，但是贴壁细胞数量较少，而且细胞核异型性多见，细胞增殖乏力，无法完成传代培养。

成功的2例中，细胞铺满瓶底80%分别在原代培养第10，12天，平均11 d 。

酶消化结合组织块法原代培养情况：倒置显微镜下观
察，原代培养的第5天开始，即有细胞从组织块周围游出，细胞为星形或长梭形(见图1)。

20例中培养成功共7例，成功率35%。

观察到细胞游出时间分别为5，6，8，8，10，10，11 d ，平均8.29 d 。

细胞铺满瓶底80%分别在原代培养第9，11，13，14，14，15，16天，平均13.14 d 。

2.2 hPDLC 鉴定
细胞形态学观察：3种方法所培养出的原代细胞经传
代培养后细胞均呈长梭形，胞体丰满，胞质均匀，核圆或椭圆形，位于细胞中央，内含两三个核仁。

细胞铺满瓶底后呈放射状、束状或漩涡状排列，见图2。

第2代细胞苏木精-伊红染色可见：细胞胞体为长梭形或星形；胞浆红染；胞核嗜碱性，圆形或卵圆形，位于细胞中央，内含两三个核仁，见图3。

细胞免疫组织化学染色鉴定：抗波形丝蛋白多克隆抗
体(VIM)在细胞中呈阳性表达(胞浆呈棕黄色)，见图4；抗细胞角蛋白(CK)染色阴性，证实细胞的间叶源性，而非上皮源性，见图5。

Figure 1 Human periodontal ligament cell grew around the explants with the combination of tissue explant and
enzymatic digestion method (×100) 图 1 酶消化结合组织块法原代培养的组织块周围有细胞爬出(×100)
Figure 2 Morphology of the third passage of human periodontal
ligament cell (×100) 图2 第3代牙周膜细胞形态(×100)
Figure 3 The second passage of human periodontal ligament
cell stained with hematoxylin-eosin (×200)
图3 第
2代细胞苏木精-伊红染色(×200)
Figure 4 Positive expression of anti-vimentin polyclonal antibody
in human periodontal ligament cell (×400)
图4 抗波形蛋白多克隆抗体在细胞中呈阳性表达(×400)
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细胞生长曲线：3种方法所培养的第4代细胞经细胞计
数法所得生长曲线图相似，均为近似的“S ”形(见图6)，有明显的滞留期、对数生长期和平台期。

细胞倍增时间分别为90.56，95.88，93.38 h 。

3 讨论
牙周膜又称为牙周韧带，是一种致密的结缔组织，由细胞、基质和大量的胶原纤维组成。

牙周膜细胞的原代培养是牙周细胞生物学研究的基础。

由于牙周膜细胞的原代培养较为困难，大量研究者对其培养方法进行了探索[16-20]。

一般来说，牙周膜细胞的原代培养有两种方法，一种是组织块法，另一种是酶消化法。

这两种方法在国内外均有使用，但是其成功率均不高，为10%~20%。

组织块法的优点是操作简单，需要组织量少，易于掌握，而且所获得的细胞纯度较高[21]。

但是其成功率相对较低，主要是由于能够获得的牙周膜组织量少，组织贴壁率低。

而且牙周膜组织中多为较韧硬的胶原纤维，细胞成分只占8%左右，因而细胞从组织块中游出较为困难。

胡军等[22]采用从拔牙创骨壁中部刮取牙周膜的方法取材，反复冲洗，去净血污后再将组织块贴壁培养，作者认为该法可以增加组织量，同时减少污染。

但是这种方法在实际操作中易混入牙龈以及口腔黏膜
或者牙槽骨组织。

实验中发现其组织块法的成功率为21%。

组织块法缺点是实验周期较长，一般未经酶消化处理的组织块在2周左右方可见细胞游出，三四周才能铺满瓶底。

最早可见到有细胞从组织块周围爬出的平均时间为原代培养第11.25天。

细胞铺满瓶底80%平均需要17.75 d ，这与以往的研究一致[23]。

酶消化法多采用胶原酶与胰蛋白酶混合消化组织块。

但有研究认为，胰蛋白酶对细胞的损伤明显，长时间或者高浓度胰蛋白酶作用后大量细胞被灭活[24]。

甚至有人认为胰蛋白酶消化超过20 min ，则可破坏细胞表面的蛋白质，使细胞表面通透性升高，活力下降，而且酶消化法所获得的细胞纯度不高。

在实验中发现酶消化法的成功率为11%。

实验中有1例经胰蛋白酶消化后在原代培养的第4天虽然见到有细胞贴壁生长，但是贴壁细胞数量较少，细胞核异型性多见，细胞增殖乏力，无法完成传代培养。

本实验采用酶消化结合组织块法，即先用0.2%胶原酶消化组织块110 min ，然后离心收集组织块进行原代培养，成功率为35%。

该方法的思路在于先用胶原酶消
化韧硬的牙周膜胶原纤维，以利于组织中细胞游出。

作者认为本法组织块不经剪切，直接进行消化培养，避免了机械剪切对细胞的损伤；不使用胰蛋白酶，避免了胰酶对细胞的损害；组织块经胶原酶的消化作用而松散，使细胞易于从外界吸收养分，易于从组织块中游离出去；在实际操作中发现，消化后的组织块较小，在培养瓶中容易漂浮移动，因此在原代培养的前5 d 内，不要移动或者晃动培养瓶，让漂浮的组织块尽量沉降并贴在瓶底，以利于细胞的游出。

在实际操作中，由于消化时间较长，还应该严格控制污染。

3种方法所培养的细胞，经过稳定传代培养后，细胞均为长梭形，免疫组织化学显示：细胞角蛋白染色阴性，波形丝蛋白染色阳性，说明细胞来源为中胚层的成纤维细胞。

细胞倍增时间接近，生长曲线近似，与其他研究结果相似[25-28]，说明细胞的生长特性并无太大区别。

但牙周膜中的细胞成分主要包括成纤维细胞、成牙骨质细胞、成骨细胞、破骨细胞、Malassez 上皮剩余以及未分化的间充质细胞[29]；从功能上区分，牙周膜细胞主要包括成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞3个亚群以及未分化间充质细胞[30]。

3种方法所培养的细胞在具体的细胞分型或者分群表达上是否有差异，尚需进一步的研究证明。

4 参考文献
[1] Narayanan AS, Bartold PM. Biochemistry of periodontal connective
tissues and their regeneration: a current perspective. Connect Tissue Res. 1996;34(3):191-201.
[2]
Itaya T, Kagami H, Okada K, et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. J Periodontal Res. 2009;44(4):425-433.
Figure 5 Negative expression of cytokeratin antibody in human
periodontal ligament cell (Immunohistochemistry,
×400) 图5 抗细胞角蛋白染色阴性(免疫组织化学染色, ×400)
蒋俊强，等. 三种方法原代培养人牙周膜细胞
www.CRTER
.org
[3] Maeda H, Nakano T, Tomokiyo A, et al. Mineral trioxide aggregate induces bone morphogenetic protein-2 expression and calcification in human periodontal ligament cells. J Endod. 2010;36(4):647-652. [4] Jäger A, Götz W, Lossdörfer S, et al. Localization of SOST/sclerostin in cementocytes in vivo and in mineralizing periodontal ligament cells in vitro. J Periodontal Res. 2010;45(2):246-254.
[5]
Hakki SS, Hakki EE, Nohutcu RM. Regulation of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix
metalloproteinases by basic fibroblast growth factor and
dexamethasone in periodontal ligament cells. J Periodontal Res. 2009;44(6):794-802.
[6] Flores MG, Yashiro R, Washio K, et al. Periodontal ligament cell sheet promotes periodontal regeneration in athymic rats. J Clin Periodontol. 2008;35(12):1066-1072.
[7]
Yang ZH, Zhang XJ, Dang NN, et al. Apical tooth germ cell-conditioned medium enhances the differentiation of periodontal ligament stem cells into cementum/periodontal ligament-like tissues. J Periodontal Res. 2009;44(2):199-210. [8] Si TZQ, Wu JZ. Xian: Shijie Tushu Chuban Gongsi. 1996:63-71. 司徒镇强,吴军正.细胞培养.西安:世界图书出版公司，1996:63-71. [9] Ragnarsson B, Carr G, Daniel JC. Isolation and growth of human periodontal ligament cells in vitro. J Dent Res. 1985;64(8): 1026-1030.
[10] Nagatomo K, Komaki M, Sekiya I, et al. Stem cell properties of human periodontal ligament cells. J Periodontal Res. 2006;41(4): 303.
[11]
Hou LT, Li TI, Liu CM, et al. Modulation of osteogenic potential by recombinant human bone morphogenic protein-2 in human
periodontal ligament cells: effect of serum, culture medium, and osteoinductive medium. J Periodontal Res. 2007;42(3):244-252. [12]
Ao JH, Liu YP , Dong R, et al. Linchuang Kouqiang Yixue Zazhi. 2006;22(9):528-530.
敖建华,刘彦普,董蕊,等.人牙周膜体外分离培养及其成骨表型的研究[J].临床口腔医学杂志,2006,22(9):528-530.
[13]
Jiang L, Zhu YQ. Yati Yasui Yazhoubingxue Zazhi. 2008;18(4): 195-199.
江龙,朱亚琴.改良组织块法体外培养人牙周膜细胞和牙髓细胞[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2008,18(4):195-199.
[14]
Zhang J, Mei F, Cai Q, et al. Zhongguo Shengwu Yixue Gongcheng Xuebao. 2009;28(5):774-759.
张静,梅芳,蔡晴,等.牙周膜细胞在网格型与无纺型聚乳酸纳米纤维支架材料上体外培养的研究比较[J].中国生物医学工程学报,2009, 28(5)：774-759.
[15]
Nagai N, Hirakawa A, Otani N, et al. Development of
tissue-engineered human periodontal ligament constructs with intrinsic angiogenic potential. Cells Tissues Organs. 2009;190(6): 303-312.
[16]
Li J, Xu C, Hao Y , et al. Shanghai Jiaotong Daxue Xuebao: Yixueban. 2008;28(11):1373-1376.
李隽,胥春,郝轶,等.人牙周膜细胞原代培养及鉴定[J].上海交通大学学报:医学版,2008,28(11):1373-1376.
[17]
Zhang L, Wang Y , Zhang JM, et al. Guiyang Yixueyuan Xuebao. 2008;33(5):465-468.
张丽,王永,张军梅,等.体外培养人牙周膜细胞方法的探讨[J].贵阳医学院学报,2008,33(5):465-468.
[18] Wang JP , Sui XM. Heilongjiang Yiyao Kexue. 2002;25(6):4-6. 王健平,隋晓梅.组织块法和酶消化法培养人牙周膜细胞[J].黑龙江医药科学,2002,25(6):4-6.
[19]
Jiang JQ, Ding Y , Li XY , et al. Huaxi Kouqiang Yixue Zazhi. 2009; 27(5):538-541.
蒋俊强,丁一,李小玉,等.骨碎补柚皮苷对人牙周膜细胞增殖、碱性磷酸酶活性影响的实验研究[J].华西口腔医学杂志,2009,27(5): 538-541.
[20]
Lu H, Wu ZF, Tian Y , et al. Shiyong Kouqiang Yixue Zazhi. 2003; 19(3): 304-307.
鲁红,吴织芬,田宇,等.狗牙周膜细胞三维立体培养的体外实验研究[J].实用口腔医学杂志,2003,19(3):304-307.
[21] Adams AM, Soames JV, Searle RF. Cultural and morphological characteristics of human periodontal ligament cells in vitro. Arch Oral Biol. 1993;38(8):657-662.
[22]
Hu J, Chen XM. Xiandai Kouqiang Yixue Zazhi. 2002;16(2): 176-177.
胡军,陈新民.人牙周膜成纤维细胞原代培养的研究[J].现代口腔医学杂志,2002,16(2):176-177.
[23] Shu D, Yang SW. Kouqiang Yixue. 2008;28(7):376-378.
舒丹,杨四维.牙周膜细胞体外培养技术的发展及应用[J].口腔医学, 2008, 28(7):376-378.
[24]
Tang CH, Shi SG, Niu ZY . Zhonghua Yixue Zazhi. 2004;84(8): 656-658.
汤楚华,施生根,牛忠英.酶消化组织块法原代培养人牙周膜细胞的初步研究[J].中华医学杂志,2004,84(8):656-658.
[25] Al-Nazhan S, Al-Nasser A. Viability of human periodontal ligament fibroblasts in tissue culture after exposure to different contact lens solutions. J Contemp Dent Pract. 2006;7(4):37-44.
[26] Lu H, Wu ZF. Yati Yasui Yazhoubingxue Zazhi. 2002;12(3):132-134.鲁红,吴织芬.人牙周膜细胞体外三维立体培养模型的建立[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2002,12(3):132-134.
[27]
Liu HW, Cai XW. Shiyong Kouqiang Yixue Zazhi. 2002;18(6): 522-525.
刘宏伟,蔡兴伟.不同代数人牙周膜细胞成骨特征稳定性的实验研究[J].实用口腔医学杂志,2002,18(6):522-525.
[28]
Liu Y , Fang DJ, Li JY , et al. Beijing Kouqiang Yixue. 2006;14(1): 20-22.
刘怡,房殿吉,李静远,等.小型猪牙周膜细胞体外培养及与三维支架材料的生物相容性研究[J].北京口腔医学,2006,14(1):20-22.
[29] Takei N. Carranza: Carranza’s Clinical Periodontology.9th ed Copyright W.B Saunders Company. 2002:115-145.
[30]
Zhang YH. Zhonghua Kouqiang Yixue Zazhi. 1998;33(4):251-253张蕴惠.牙周组织再生[J].中华口腔医学杂志,1998,33(4):251-253.。