细胞的传代培养和细胞计数法
细胞的传代培养和细胞计数法
人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消 •
化液； 4. 消化：再加 1ml 消化液漂洗 1 次 , 倒掉大部分消化液 , 保留约0.3ml,室温放置3～5min； 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园 , 加 1 ～ 2ml 含血清培 养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱 和湿度条件下培养。
细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml • 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液 • •
＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染 料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋ 死细胞数）］×100
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M3SP2 M3SP2-pBp M3SP2-PTEN
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DT = t × lg2 ÷ (lgNt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
• • • • • • • •
机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 密度梯度离心法：细胞漂浮密度， Ficoll, Percoll 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 电泳分离法：细胞表面电荷
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法可以包括以下步骤：
1. 细胞培养：将待实验的细胞株从冷冻保存中取出，放入无菌培养皿内，并加入适宜的培养基。
设置适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度等。
定期观察细胞生长情况并进行细胞的传代。
2. 细胞传代：当细胞培养达到一定密度时，将细胞通过酶消化方法从培养皿中取出，然后转移到新的培养皿中重新培养。
该方法可以获得更多的细胞数量，以维持细胞培养的供应。
3. 细胞分离：对于某些实验需要用到单独的细胞的情况，可以采用细胞分离的方法，如通过胰蛋白酶消化细胞外基质、抑制细胞黏附等，使细胞单个分散。
4. 细胞检测：使用显微镜观察细胞的形态变化，细胞生长情况和细胞颜色等。
也可以利用荧光显微镜观察细胞内的特定荧光标记物，如细胞核染色剂、蛋白质荧光探针等。
5. 细胞培养基交换：定期更换细胞培养基，以保持细胞的生长状态和代谢活性。
6. 细胞处理：根据实验需要，在培养皿中添加不同浓度或种类的化合物，如药物、抗生素等，对细胞进行处理。
7. 细胞采集：根据实验需求，利用细胞刮刀、吸球等方法将细胞从培养皿中收集起来。
8. 细胞冻存：将细胞保存在液氮中，以便长时间保存和后续使用。
9. 细胞裂解：对于某些实验需要提取细胞内的特定分子或蛋白质，可以使用细胞裂解液将细胞内组分释放出来。
10. 细胞计数：通过显微镜或细胞计数仪等方法，对细胞数量进行计数和测定。
请注意，具体细胞实验的操作方法可能因不同的实验目的和细胞类型而有所差异，上述仅为一般的基本操作方法。
在进行细胞实验时，应严格遵守相关实验室规范和安全操作指南。
细胞传代培养实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞传代培养的基本操作流程。
2. 熟悉细胞传代培养过程中的注意事项。
3. 了解细胞传代培养在生物科学研究中的应用。
二、实验原理细胞传代培养是指将已经生长到一定阶段的细胞，通过特定的方法进行分离、洗涤、消化、计数和稀释等步骤，将细胞转移到新的培养容器中继续培养的过程。
细胞传代培养是维持细胞生长、扩大细胞数量和保持细胞特性的重要手段。
三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞2. 培养基：DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清）3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、10%FBS、PBS缓冲液、酒精4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、移液枪、培养瓶/皿、吸管等四、实验步骤1. 准备阶段（1）将HeLa细胞从培养瓶中取出，用PBS缓冲液轻轻洗涤一次，去除残留的培养基。
（2）准备胰蛋白酶工作液，将其置于37℃水浴中预热。
（3）准备含有10%FBS的培养基，将其置于37℃水浴中预热。
2. 分离细胞（1）用移液枪吸取适量胰蛋白酶工作液，滴加到细胞培养皿中的细胞层上。
（2）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中消化2-3分钟。
（3）倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆且亮时，加入等体积含有10%FBS的培养基终止消化。
（4）用移液枪轻轻吹打细胞，使其成为细胞悬液。
3. 计数（1）取适量细胞悬液，使用细胞计数仪或显微镜配合琼脂滴定法计数。
（2）根据计数结果，调整细胞密度至所需的浓度，一般为每毫升105-106个细胞。
4. 传代（1）向含有预热的培养基的离心管中加入细胞悬液，并轻轻混匀。
（2）离心管离心，在1500 rpm速度下离心3-5分钟，以沉淀细胞。
（3）弃去上清液，保留沉淀的细胞。
（4）加入适量的新鲜培养基，将细胞重新悬浮。
（5）将细胞悬液转移到新的培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
五、实验结果1. 成功完成细胞传代培养，观察到细胞在新的培养瓶中继续生长。
2. 细胞生长状态良好，细胞密度符合预期。
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
【1】细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项细胞培养是生物学实验中常见的一项重要技术，它广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药理学等领域。
通过细胞培养，科研人员能够研究细胞的生长、分化、凋亡等生物学过程，同时也可以进行药物筛选、生物学效应观察等实验。
然而，细胞培养是一项复杂的工作，需要严格遵循一系列步骤和要求，并且需谨慎对待各项注意事项。
在本文中，我将以从浅入深的方式，全面探讨细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项，帮助你更深入地理解这一技术。
【2】细胞培养的具体步骤和要求让我们来了解细胞培养的具体步骤。
通常情况下，细胞培养的主要步骤包括：细胞分离、细胞计数、细胞传代、培养基准备、细胞接种、培养条件控制等。
具体来说，细胞培养的步骤包括收获细胞、细胞解聚、细胞计数、调整细胞密度、接种细胞、培养细胞、处理细胞等。
在进行这些步骤时，需要保持实验操作台面清洁整洁，常备所需培养工具、培养耗材和培养试剂，并且要准确记录实验过程中的重要参数和数据。
细胞培养的要求也是至关重要的。
要选择合适的细胞系，确保来源纯净、鉴定正确、培养活力好。
培养基的选用也十分重要，要根据不同细胞类型的需求来选择适当的培养基，并添加必要的生长因子、氨基酸、维生素等。
培养条件的控制也十分重要，包括温度、湿度、二氧化碳浓度、通风情况等。
细胞培养的灭菌和无菌操作更是必不可少，细胞培养过程中的任何污染都可能对实验结果产生影响。
【3】细胞培养的注意事项在进行细胞培养时，需要特别注意一些细节和注意事项。
要保持室内整洁，操作台面、培养箱、生物安全柜等工作台要保持干净，并且要经常消毒。
要做好个人防护工作，戴口罩、手套、工作服等，避免人体细胞对培养的影响。
要定期检查培养箱、生物安全柜等设备的运行情况，确保培养环境的稳定性和安全性。
对细胞的培养时间、传代次数、细胞密度等也需要严格控制，不可随意增加培养时间或传代次数，以免细胞出现突变或异常。
【4】对细胞培养的个人观点和理解从事细胞培养工作多年，我深知细胞培养的重要性和复杂性。
细胞培养方法与步骤
细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。
细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。
细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。
一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。
原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。
步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。
2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。
3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。
4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。
5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。
二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。
步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。
2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。
3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。
4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。
5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。
6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。
三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。
操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。
2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。
3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。
4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。
动物细胞传代培养分析
动物细胞传代培养分析动物细胞的传代培养是用来研究和繁育动物细胞的技术，对于生物科学和医学研究具有重要意义。
传代培养可以使动物细胞在无限期内继续增殖，为各种研究提供了充足的细胞资源。
本文将介绍动物细胞传代培养的原理、方法和应用。
一、传代培养的原理动物细胞的传代培养是通过将初始细胞（初代细胞）在一定培养条件下生长和分裂，定期收获一部分细胞进行继代，从而使细胞持续增殖。
动物细胞的传代培养基于以下原理：1.细胞增殖：传代培养的基本原理是细胞自身的生长和分裂能力。
在适当的生长条件下，细胞会进入细胞周期，经过细胞分裂产生新的细胞。
2.分离和分散：细胞传代过程中需要经常将细胞进行分离和分散，避免细胞过度密集或形成细胞聚集。
细胞分散是为了保证细胞的生长和增殖。
3.培养基的调配：细胞传代需要提供适宜的培养基满足细胞增殖的需求。
培养基的配方要包含必需的营养物质、生长因子和维生素等。
二、传代培养的方法传代培养主要有以下几个步骤：1.准备培养基：根据需要的传代次数，准备足够的培养基。
培养基的配方可以根据具体的细胞类型和研究需要进行调整。
2.细胞解离：将细胞从培养皿或瓶子中收集，用细胞解离液将细胞分散为单细胞悬浮状态。
细胞解离的方法主要有酶消化法和机械分散法。
3.计数和接种：用细胞计数仪进行细胞数目计数，然后计算出相应的接种细胞数目。
将细胞接种到新的培养皿或瓶子中，使其适当分散。
4.培养和观察：将接种好的细胞置于恒温培养箱中，提供适宜的培养条件（温度、湿度、CO2浓度等）。
定期观察细胞的生长状态和形态特征。
5.细胞收获：根据细胞传代的周期和细胞增殖速率，定期收获适量的细胞用于下一次传代或其他实验。
三、传代培养的应用1.基因表达研究：传代培养可以用来研究细胞的基因表达和细胞信号通路。
通过诱导细胞分化、抗体染色和PCR等方法，可以分析细胞的转录水平和蛋白质表达。
2.细胞毒性和药物筛选：传代培养可以用于药物毒性评价和新药筛选。
细胞计数法
细胞计数法细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。
一般利用计数板（血球计数板）进行。
即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。
不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。
1、制备细胞悬液对于悬液培养的细胞，可直接进行下面的步骤2（计数与计算过程）。
如果计数对象为贴壁生长的细胞，首先需将培养物制备成细胞悬液。
1）、终止培养，将培养液吸出，用PBS洗培养物一次。
2）、给培养瓶内加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，于37℃消化3～5min 。
期间不断在镜下观察。
当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。
3）、加入一定量的培养液（如果这些培养细胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。
2、计数与计算过程1）、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。
2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。
3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。
对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。
4）、按下式计数细胞悬液的密度：细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×104个/ml表示不计数：注意事项：1）、务必使分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。
2）、显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。
如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200个/10mm2或>500个/10 mm2 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。
细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：一.准备工作：取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。
二.细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks 液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
MTT法检测细胞活性的操作方法
MTT法检测细胞活性的操作方法MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑）法是一种常用的细胞活性检测方法。
该方法基于MTT试剂的还原能力，通过测量细胞培养物中形成的紫色产物的光密度来评估细胞的活性及增殖水平。
以下是MTT法检测细胞活性的操作方法的详细步骤：1.实验前准备：1.1培养细胞：选择合适的细胞株，并在培养基中培养细胞。
1.2需要的材料准备：MTT试剂、PBS缓冲液、洗涤液（如DMEM/F12或PBS），消毒剂，离心管，显微镜片，吸管，96孔板等。
2.细胞处理：2.1 细胞接种：将培养好的细胞用消过毒的25cm2培养瓶等容器进行接种，使其达到适当的细胞浓度。
2.2细胞处理：根据实验需要，将细胞处理为不同的实验组和对照组。
3.细胞培养：3.1细胞培养：将细胞放在37°C的恒温培养箱中培养，直到细胞达到合适的生长状态。
3.2细胞传代：根据实验需要，将细胞进行传代。
4.细胞处理后的时间点采集：4.1细胞溶解：在处理后的适当时间点，用洗涤液洗涤一次细胞，并用PBS缓冲液将细胞溶解。
可根据需要使用离心或其他方法进行溶解。
4.2细胞计数：将溶解的细胞计数。
5.进行MTT反应：5.1 加入MTT试剂：将适量的MTT溶液（通常为5 mg/mL）加入到每个孔中，确保覆盖整个细胞，使细胞完全接触MTT溶液。
5.2孵育细胞：将孔板放在37°C恒温培养箱中孵育，孵育时间通常为2至4小时，具体时间根据实验需要进行调整。
5.3移除上清：用吸管或离心机将MTT溶液完全移除，避免产生气泡。
5.4加入溶剂：将150至200μL的溶剂（如DMSO）加入到每个孔中，溶解最终的产物。
充分振荡孔板，使产物完全溶解。
5.5 读取吸光度：使用酶标仪或分光光度计，在570 nm波长下读取吸光度。
6.数据分析：6.1数据读取：根据测得的吸光度值，将每组细胞的平均吸光度值记录下来。
6.2数据分析：根据实验设计和目标，进行适当的数据分析，例如细胞活性的百分比变化、细胞增殖速率等。
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细胞生长曲线测定－计数法
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• 细胞生长缓慢 ：培养液或血清改变 ，
基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如 谷氨酰胺、生长因子等 ，低水平的细菌 或霉菌污染，接种细胞数太少 ，有限培 养细胞衰老 ，支原体污染
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细胞传代培养及细胞计数
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人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消
化液；
• 4. 消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液,
保留约0.3ml,室温放置3～5min；
开始传代。
• 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。 • 细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的
方法纯化细胞。
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血球计数板法
• 制备细胞悬液：细胞密度＞104/ml, 细胞过
多时需适当稀释,单个细胞率>95%。
• 加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计
数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。
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DT = t × lg2 ÷精品(l课g件Nt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
• 机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 • 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 • 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 • 密度梯度离心法：细胞漂浮密度，
Ficoll, Percoll
• 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 • 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 • 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 • 电泳分离法：细胞表面电荷
• 计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细
胞，压线者只计左边线和上边线。
• 计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数／4）
×104×稀释倍数
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细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml
• 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液＋1
滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数
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细胞培养过程中常见的问题
• 培养液pH值快速偏离 ：CO2浓度异常，
培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污 染
• 培养液出现沉淀 ：细菌或霉菌污染 • 细胞不贴壁 ：胰酶过度消化细胞 ，
支原体污染 ，缺乏附着因子
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• 细胞死亡 ：孵箱中缺CO2 ， 孵箱温度
不稳定 ，细胞冻融损伤 ，渗透压改变， 培养液中毒性代谢产物堆积
• 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染
料拒染）和死细胞（呈淡蓝色）
• 计算细胞活力：
活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋
数）］×100
死细胞
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细胞密度调整
• 稀释公式：C1·V1＝C2·V2
稀释前细胞密度C1，溶液体积V1 稀释后细胞密度C2，溶液体积V2
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细胞计数
• 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园, 加1～2ml含血清培
养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫；
• 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； • 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱
和湿度条件下培养。
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注意事项
• 细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,