细胞传代标准化步骤
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞培养传代标准操作规程
1、目的：建立Vero细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化。
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。
2、范围：适用于Vero细胞培养传代实验人员.3、编制依据《企业注册标准WS4—（S—009-2）—2003Z》。
4、Vero细胞培养传代操作规程4。
1试药与试液1、细胞：Vero细胞。
2、液体：0。
25%胰蛋白酶溶液；7。
5%碳酸氢钠溶液;小牛血清；PBS缓冲液；10×199培养液、灭菌注射用水、EDTA溶液。
4.2仪器与用具1、恒温培养箱；2、倒置生物显微镜。
4。
3操作方法4.3.1细胞培养、传代1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台30min。
2、挑选细胞形态佳、无污染的Vero细胞，弃旧生长液.3、细胞面经少量EDTA溶液洗涤后,加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺平培养瓶底为佳），倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，4、把细胞培养瓶置37。
0℃±0。
5℃孵育让残存的胰酶继续消化,（在37℃胰酶消化效果最佳）,每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆,透亮，细胞间隙明显增大时，加入先配好的完全培养基适量终止消化,用吸管轻柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。
5、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验,观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略.）6、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等,一般按照1：3-1：5比例进行传代。
先用滴管吹打混匀细胞悬液，平均分配细胞悬液到各个培养瓶中，补足完全培养基使液体总体积达到40ml左右，平放到培养箱中继续培养。
7、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
4。
3.2填写记录：1、随试验进程做好试验记录（按实验记录规范要求)，包括试剂的厂家、批号、效期，试验时间，试验结果。
细胞传代标准化步骤
细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套,用75%酒精擦手；
1、取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代或换液；
2、将培养基如有需要还有血清和大瓶高糖培养基、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后,将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯,将瓶口拧松,过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,将培养皿中的培养基取大培养皿6ml,
中培养皿3ml至一个新的15ml离心管中；一个1ml枪头
5、用适量PBS清洗细胞表面大皿5ml,中皿3ml,并弃去PBS；一个5ml枪头
6、加入适量胰酶消化细胞大皿1ml,中皿,此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消化；
C2C12用5min,3T3-L1用,一个1ml枪头
7、待消化完全后,用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化,并吹打培养皿皿底,将细胞移入
离心管；一个5ml枪头
8、1000rpm,5min离心,离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿,并加好培养基；
9、弃上清,口擦酒精,烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞沿壁轻轻吹打24次左右,按合适比例进行细胞传
代,在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱;一个1ml枪头
11、将所有试管收至冰箱,将废液缸及废液取出,装至一次性PE手套,废液缸喷酒精清
洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面,检查显微镜、离心机是否关闭,孵箱是否正常；
13、做试验记录,打开超净台和细胞间紫外,15min后关闭。
细胞传代培养实验步骤
细胞传代培养是生物学研究中常用的实验技术，用于保持细胞系的稳定性和活力。
以下是细胞传代培养的一般步骤：
培养基准备：准备适当的培养基，包括生长因子、营养物质和抗生素（如果需要）。
确保培养基的配制符合细胞系的特殊需求。
细胞检查：使用显微镜检查细胞的形态、数量和健康状态。
确保细胞处于适当的生长状态，没有受到感染或其他异常。
细胞收获：从之前的培养瓶中将细胞收获下来。
这通常涉及用胰酶等酶类来解离细胞，使其从培养瓶表面脱离。
细胞计数：使用血球计数板或自动细胞计数仪等工具，计算细胞的数量。
这有助于确定传代时应该用多少细胞。
传代操作：将收获的细胞按照既定的比例重新分配到新的培养瓶中。
传代的目的是dilution 细胞，以确保它们能够继续健康地生长。
培养新的细胞群：将传代后的细胞放入培养箱中，提供适当的环境条件（温度、湿度、CO2浓度等），促使细胞继续生长。
观察细胞生长：在培养过程中，通过定期使用显微镜观察细胞的形态和生长状态。
确保它们没有发生异常变化。
培养基更替：根据需要，定期更换培养基，以提供新的营养物质和保持适当的环境条件。
细胞冻存（可选）：如果需要，可以将一部分细胞冻存起来，以备将来的实验使用。
冻存细胞是为了防止细胞系的丧失或污染。
以上步骤是一般细胞传代培养的基本流程，具体操作可能会根据不同的细胞系、实验目的和实验室条件而有所调整。
在进行实验前，请确保你了解所使用细胞系的特性和培养条件。
MSC细胞传代培养标准操作流程(2)
间充质干细胞传代培养标准操作流程1 目的和范围：1.1 目的：规范间充质干细胞培养操作流程，保证间充质干细胞传代产品制备的稳定性、均一性。
1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员间充质干细胞传代培养的全过程。
2 文件：2.1 间充质干细胞传代培养标准操作流程。
3 记录：3.1 间充质干细胞传代培养记录。
3.2溶液配制记录。
3.3清场记录。
4 试剂与耗材：4.1试剂：75%酒精、生理盐水、DMEM培养基（低糖）、Ultroser G(血清替代物)、干细胞冻存液、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）。
4.2 仪器设备：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、镊子、1ml移液枪、水浴锅、离心机、细胞计数仪、电动移液枪、试管架。
4.3耗材：50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管、封口膜、无菌纱布。
5工作程序：5.1实验前准备：5.1.1 洁净区及超净工作台紫外照射≥30min，风机开启≥5min。
5.1.2 耗材准备：将已灭菌且在有效期内的器械放入传递窗内紫外照射≥30min后，去包布，经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.1.3 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶提前30min从冰箱取出待用。
5.1.4 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶用酒精擦拭后放入超净工作台，以便恢复至室温。
5.1.5 将50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.2溶液配制：5.2.1配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。
5.2.2Ultroser G(血清替代物)溶液配制：取一瓶Ultroser G(血清替代物)粉剂，用一次性注射器加入20ml超纯水（无菌）使其溶解约10-15min，再用0.2um一次性过滤器过滤备用。
细胞传代培养详细操作步骤
细胞传代培养详细操作步骤
流式细胞传代培养技术是一种常用的细胞培养技术，主要用于研究细胞的生长、变化和分化特性。
在研究细胞分化，衰老和死亡过程中，流式细胞传代培养十分重要。
而对流式细胞传代培养的详细操作步骤则具有非常重要的意义。
以下我将介绍流式细胞传代培养的详细操作步骤：
1．获取样品：首先要准备所需的培养基，然后将细胞从培养皿中接种到培养基中；
2．将细胞培养在培养盘中，因为细胞细胞在培养基中不断地增殖；
3．将培养基中细胞转移到新培养皿；
4．每次培养时，从培养皿中移去细胞末端，然后用新的培养基替换原来的培养基；
5．为了使细胞保持活性，可以采用代数培养，即每隔一段时间就将培养基更新成新的培养基；
6．按照细胞对培养基配比和温度要求，调整培养基，然后加入培养基中；
7．把培养基放入培养箱中，调节温度、湿度、二氧化碳浓度，二氧化碳浓度控制在5～10％，培养温度控制在37℃附近；
8．将培养盘放入培养箱中，定期检查，控制细胞的增殖情况；
9．当细胞足够分裂时，取出培养盘，用解毒液处理，然后冰冻保存细胞，用于后续研究。
以上就是流式细胞传代培养技术的整个操作过程，从样本获取到细胞保存，是一种有效而又系统的操作技术，也是细胞培养和研究的重要方法。
熟练掌握并正确操作流式细胞传代培养，对于更好地利用细胞培养来研究细胞分化，衰老和死亡等活动有着至关重要的意义。
细胞传代的过程及注意事项
细胞传代的过程及注意事项
细胞传代是细胞培养中最常见的操作，它是将已经在体外培养的细胞
放置到新的培养基中，继续生长繁殖的一种方法。
传代的过程一般包括准
备培养基、细胞膜解析、细胞数量细胞的复制、再次放置细胞、监测细胞
增殖等步骤。
1、培养基的准备：通常，将培养基煮沸后冷却至室温，加入必要的
抗生素和其他物质后进行搅拌均匀。
2、细胞膜解析：将要传代的细胞用叉子放入悬浮于培养液中，再加
入过氧化氢酶以解析细胞膜，具体方法是将培养基中的细胞分散成一个单层，逐步加入过氧化氢酶直到达到细胞解析的程度。
3、细胞数量细胞的复制：将细胞数量复制到前面所预定的细胞比例，使细胞保持初始比例，为传代提供有利条件。
4、再次放置细胞：将复制完成的细胞液再次放置在新的培养基中，
细胞培养室中的空气湿度和温度都必须维持在合适的范围，使细胞繁殖进
行得顺畅。
5、监测细胞增殖：在每次传代后，一定要记录下新培养基中细胞的
数量、形态和其他特征，以便确定新培养基的质量。
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细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；
1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml，中
培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消
化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入离
心管；（一个5ml枪头）
8、1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、弃上清，口擦酒精，烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，
在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。
（一个1ml枪头）
11、将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭。